异体角膜对人外周血T细胞及其亚群CD69分子表达的体外调节

目的 观察异体角膜体外对人外周血T细胞及其亚群CD69分子表达的调节。方法 应用异体角膜与外周血淋巴细胞体外共同培养和流式细胞分析技术(FACS)。结果 对照组T细胞CD69表达为10．3％；受角膜或佛波醇脂(PDB)激活后，T细胞CD69表达分别为31.6％和53.8％；受角膜激活后，CD4和CD8T淋巴细胞CD69表达分别为47.3％和30．3％。结论 角膜组织体外能够刺激人外周血T细胞CD69的表达和T细胞活化，早期以CD4T细胞活化更明显。     

转移生长因子-β_1对异体角膜上皮所诱导的CD_(69)~ 及CD_(25)~ 表达的影响

目的　研究转化生长因子 β1(transforminggrowthfactorβ1,TGF β1)对异体角膜上皮所致的外周淋巴细胞亚群CD 69及CD 2 5活化的影响。方法　采用CD 69、CD 2 5间接免疫荧光标记技术 ,行流式细胞仪检测及分析CD 69、CD 2 5的表达率。结果　培养的异体角膜上皮细胞与外周血共孵育 3h ,测得CD 69及CD 2 5表达率均较对照组有显著升高 ;经TGF β1处理后 ,CD 69及CD 2 5表达率明显受到抑制。结论　TGF β1对异体角膜上皮细胞所致的T淋巴细胞早期活化分子CD 69及CD 2 5的表达有明显的抑制作用。     

体外传代培养的角膜缘干细胞特性的研究

目的探讨体外培养的角膜缘干细胞的特性并寻找其表面标志。方法体外扩增入角膜缘干细胞，检测第4代培养细胞Brd—U掺入率及p63、connexin43、角蛋白3／12的表达情况，分析细胞表面分子的表达。结果培养细胞Brd—U24h掺入率明显低于6d掺入率；第4代细胞表现为p63单阳、p63-connexin43双阳和角蛋白3单阳的混合体，而角膜上皮细胞只表达角蛋白。流式细胞分析传代的干细胞β4 integrin，CD90（＋），α6 integrin，CD14（-），角膜上皮细胞CD14（＋）。结论体外传代培养的角膜缘干细胞部分保持干细胞特性，具有增生能力。p63是增生细胞的标志。β4integrin＋／α6 integrin-联合CD90＋／CD14-可能纯化角膜缘干细胞。     

以羊膜为底物培养鸡角膜缘上皮细胞的实验研究

目的为眼表面重建术提供良好的移植材料。方法用胰酶及EDTA消化法去除羊膜上皮将消化、离心获得的鸡角膜缘上皮细胞调成1×107/mlDMEM悬液,接种在6孔培养板底的羊膜基底膜面,放人37℃,5％CO2孵箱培养。结果48h羊膜上培养细胞形成单层,较培养板上培养的同种细胞小,细胞表面的微绒毛及侧面足状突丰富,立体感明显。结论以羊膜基底膜为底物培养的鸡角膜缘上皮细胞可以着床生长并形成完整的单层上皮,为眼表重建使用羊膜及基底膜面培养的角膜上皮细胞提供了实验材料。同时表明羊膜在体外也可以促进鸡角膜缘上皮细胞生长。     

羊膜移植联合鸡角膜缘上皮移植治疗兔全角膜表层损伤的组织学改变

目的：研究羊膜移植术和联合鸡角膜缘上皮移植（联合移植）术治疗兔全角膜表层损伤的组织学改变。方法：兔39只分为3组，每组13只。对照组，将角膜及角膜缘外3mm的表层组织去除；羊膜移植组，在去除表层组织的创面上移植羊膜；联合移植组，在羊膜移植片表面角膜缘区移植鸡角膜缘上皮。手术当天各组处死1只兔，7、28、90、105天各组处死3只兔，摘除眼球分别进行光镜、免疫组化，透射电镜及扫描电镜检查。结果：对照组：角膜紊乱，表面不平，上皮表面微绒毛稀少，基质纤维血管化。羊膜移植组及联合移植组：羊膜结构逐渐被基质胶元纤维取代和改建，基质纤维平行排列，角膜表面光滑，上皮表面微绒毛丰富，细胞之间可见桥粒连接。结论：羊膜移植术和联合鸡角膜缘移植术治疗兔角膜广泛损伤，能抑制新生血管和纤维组织向角膜生长，较快促进眼表重建。     

TGF—β1对角膜上皮移植后CD4^＋,CD^＋8,CD25^＋和CD71^＋的影响

目的：为有效控制角膜移植术后排斥反应的发生,提高角膜移植成功率,我们在小鼠（BALB／c)角膜上皮移植术后应用TCF－β1,并观察其对外周血淋巴细胞亚群CD4^ ,CD8^ ,CD25^ ,CD71^ 活化的影响,为今后临床应用TGF－β1抑制角膜移植术后免疫排斥反应奠定基础。方法：采用CD4^ ,CD8^ ,CD25^ ,CD71^ 免疫荧光标记及流式细胞仪检测技术。分别对设立的阴性对照组,阳性对照组,同基因组,异体角膜上皮组及TGF－β1治疗组的BALB/c小鼠角膜上皮移植术后12d的外周血中CD4^ ,CD25^ ,CD8^ ,CD25^ ,CD4^ ,CD71^ ,CD8^ CD71^ 的表达进行分析,结果：BALB/c小鼠角膜上皮移植术后12d的外周血中CD25^ CD4^ ,CFD25% CD8^ ,CD71^ CD4^ 和CD71^ CD8^ 双阳性的T淋巴细胞均有显升高,术后经TGF－β1治疗后,上述细胞的数量明显受到抑制。CD25^ CD8^ ,CD71^ CD4^ 和CD71^ CD8^ 双阳性的T淋巴细胞均有显升高,术后经GF－β1治疗后,上述细胞的数量明显受到抑制。结论：角膜上皮移植术后应用TGF－β1可抑制特异性抗原介导的,以及非特异性炎疗诱诱导的移植排斥反应。     

羊膜培养兔角膜缘上皮细胞及自体移植--角膜缘干细胞缺损的治疗

目的　探讨以人羊膜为载体培养兔角膜缘上皮细胞及其自体移植治疗全角膜缘干细胞缺损。方法　在8只兔右眼用正庚醇脱上皮和角膜缘环切的方法构建全角膜缘干细胞缺损模型2月。其中6只兔为实验组,活体取左眼角膜缘浅层小块,置羊膜上常规和气_液培养42天后进行自体移植治疗右眼角膜缘干细胞缺损;2只兔为对照组,直接用解冻无细胞人羊膜移植治疗右眼角膜缘干细胞缺损。进行细胞和术眼活体观察、组织学观察和电镜观察。结果　角膜缘上皮细胞在羊膜上生长良好,形成复层,细胞间的联结结构存在,细胞与羊膜组织粘附牢固。实验组移植手术后角膜迅速上皮化,恢复角膜表面光滑和透明,组织学观察和电镜观察呈现生理角膜上皮层的结构特点。但眼睑闭合不全可导致手术失败。对照组术后出现角膜缘干细胞缺损导致的角膜病变。结论　以羊膜为载体培养角膜缘上皮细胞后自体移植可有效地治疗角膜缘干细胞缺损导致的角膜病变。     

人类角膜缘干细胞对外周血淋巴细胞作用的实验研究

目的 观察体外培养的人类角膜缘干细胞对同种异体外周血淋巴细胞的作用。方法 通过植片技术分离人角膜上皮细胞以及角膜缘干细胞。在两种细胞单层上，观察同种异体外周血淋巴细胞对丝裂原刀豆蛋白A（ConA）的增殖反应。另外，将两种细胞培养上清直接转移到由ConA刺激的淋巴细胞增殖系统，以观察两种细胞释放某些因子的抑制效应。结果 单层角膜缘干细胞对ConA刺激的外周血淋巴细胞增殖反应可以施加有效的抑制效应。角膜缘干细胞培养上清对ConA刺激的外周血淋巴细胞增殖系统，在72h分离上清显示有明显抑制效应。结论 角膜缘干细胞通过细胞交互作用和（或）释放某些抑制性因子对淋巴细胞的活化和增殖发挥潜在的抑制作用。     

角膜缘干细胞对外周血淋巴细胞活化和增殖作用的实验研究

目的 观察角膜缘干细胞对外周血淋巴细胞活化和增殖的抑制活性，并分析其机制。方法 通过植片技术分离兔角膜上皮细胞以及角膜缘干细胞。存两种细胞单层上，观察淋巴细胞埘丝裂原刀豆蛋白A(ConA)的增殖反应。另外，将两种细胞培养上清直接转移到由ConA刺激的淋巴细胞增殖系统以观察两种细胞释放。某些因子的抑制效应。结果 单层角膜缘干细胞对ConA刺激的外周血淋巴细胞增殖反应可以施加有效的抑制效应。角膜缘干细胞以及角膜上皮细胞的培养上清对ConA刺激的外周血淋巴细胞增殖系统，仅在72h分离上清显示有抑制效应。结论 角膜缘干细胞通过细胞交互作用和(或)释放某些抑制性因子对淋巴细胞的活化和增殖发挥潜在的抑制作用。     

羊膜为载体的人角膜缘上皮细胞移植治疗大鼠角膜碱烧伤的研究

目的研究人角膜缘上皮细胞的生物学特性,探讨体外培养的人角膜缘上皮细胞移植进行眼表重建的临床应用价值及前景。方法体外培养人角膜缘上皮细胞,通过免疫荧光染色法和逆转录聚合酶链反应（RT．PCR）法分析表型,Brdu掺入法检测慢周期（slow—cycling）细胞。建立大鼠角膜碱烧伤模型,随机分为单纯对照组、羊膜移植（AMT）组及羊膜为载体的角膜缘上皮细胞移植（LSAT）组,术后通过裂隙灯显微镜观察、角膜切片HE染色及免疫荧光染色等方法对各组大鼠眼表恢复情况进行评价。结果培养早期大多数角膜缘上皮细胞p63和K19染色阳性,仅少数细胞K3染色阳性;随培养时间的延长,K3阳性细胞增多,部分细胞同时表达p63和K3。RT—PCR示培养的角膜缘上皮细胞中p63和K12均有阳性表达,而角膜上皮细胞仅表达K12。Brdu掺入法检测到慢周期细胞。动物实验表明,LSAT可以显著减轻角膜病变,使角膜恢复完整性和透明性,眼表评分各项指标与AMT组和对照组比较差异均有统计学意义。LSAT组大鼠角膜切片染色示大部分上皮细胞抗人核和K3染色阳性。结论体外培养的人角膜缘上皮细胞中p63不仅表达于角膜缘干细胞,在短暂扩充细胞中也有一定量的表达;慢周期细胞的存在证实了培养的角膜缘上皮细胞中角膜缘干细胞的存在,p63和K19阳性、K3阴性的细胞为角膜缘干细胞;羊膜为载体的体外培养的人角膜缘上皮细胞移植可有效重建眼表,具有较高的临床应用价值与发展前景。