白细胞介素-24 delE5对人类白血病细胞系K562的抑制作用

 目的　探索白细胞介素（IL）-24 delE5对人类白血病细胞系K562的抑制作用。方法　用TPA诱导白血病细胞系U937和HL-60向单核-巨噬细胞分化后,检测mda-7／IL-24及其选择性剪接体IL-24 delE5的表达。构建IL-24 delE5真核表达载体,稳定转染K562细胞。通过MTT法、集落形成实验、流式细胞术、Annexin-Ⅴ／PI检测及动物实验,观察IL-24 delE5对K562细胞增殖、集落形成、细胞周期、凋亡及体内致瘤性的影响;同时与mda-7／IL-24进行比较。结果　在TPA诱导分化的U937和HL-60细胞中发现IL-24 delE5的表达。稳定转染IL-24 delE5的K562增殖及集落形成明显下降,与空载体相比,G0／G1期细胞比例由（24.46±3.99）%增至（42.69±3.04）%,细胞周期阻滞于G0／G1期,体内实验证实K562细胞移植瘤生长明显被抑制。与mda-7／IL-24相比,上述各实验结果差异均无统计学意义。结论　IL-24 delE5与mda-7／IL-24一样对人类白血病细胞系K562具有明显的体内外抑制作用,该作用可能与IL-24 delE5所引起细胞周期G0／G1期阻滞有关。     

mda-7/IL-24对裸鼠肝癌移植瘤的生长抑制和促凋亡作用

目的:探讨mda7/IL24对裸鼠肝癌细胞移植瘤的生长抑制和促凋亡作用及其相关机制。方法：构建携带mda7基因的重组腺病毒载体Admda7。以HepG2细胞皮下接种建立裸鼠肝癌移植瘤模型,采用瘤内单点注射的方法分别给予AdGFP、Admda7和ALLN（毒胡萝卜素,NAcLLnorleucinal）+Admda7,观察瘤质量和瘤体积的变化,通过免疫组化和TUNEL法检测肿瘤组织内凋亡相关蛋白caspase3活化、细胞增殖相关抗原ki67和微血管密度、细胞凋亡率,并通过Western blotting检测caspase12、caspase3和Bax的表达。结果： Ad.mda7治疗组和Ad.GFP对照组肿瘤体积分别为（312.6±30.2）mm3和（520.6±30.0）mm3（P<0.01）,两组的肿瘤质量分别为（0.321±0.031）g和（0.534±0.030）g（P<001）;Ad.mda7治疗后瘤细胞的凋亡率显著高于对照组（P<0.01）;Ad.mda7可抑制肝癌组织ki67表达、微血管密度和促进caspase3的表达。 经 ALLN 处理的裸鼠,明显抑制Ad.mda7对肝癌细胞的致凋亡作用（P<0.05）,并且下调Ad.mda7诱导的caspase12、caspase3和Bax的表达。结论： Ad.mda7可显著抑制裸鼠肝癌移植瘤的生长和新生血管的形成,并通过内质网应激通路显著诱导肿瘤细胞的凋亡。     

人mda-7/IL-24对淋巴瘤细胞Namalwa的抑制作用

目的:研究黑素瘤分化相关基因-7(melanoma differentiation associated gene-7,mda-7,又称IL-24)对淋巴瘤细胞系Namalwa细胞的抑制作用。方法:用半定量RT-PCR方法检测10个造血系统恶性肿瘤细胞系(Namalwa、Raji、K562、NB4、U937、Ramous、CEM、KG1a、HL60、J6-1)中mda-7/IL-24的表达情况。用RT-PCR方法从活化的人外周血单个核细胞(PBMC)中克隆mda-7/IL-24编码区,构建真核表达载体pTarget-IL-24。经测序鉴定后,用脂质体法转染Namalwa细胞,筛选稳定表达细胞株。转染细胞经RT-PCR和Western blotting证实mda-7/IL-24的表达。通过MTF法、集落形成试验、流式细胞术、裸鼠体内成瘤实验来评价mda-7/IL-24对肿瘤细胞增殖、生长特性、集落形成、凋亡情况、体内致瘤能力的作用。结果:10个造血系统恶性肿瘤细胞系中未检测到mda-7/IL-24的表达;转染重组质粒pTarget-IL-24的Namalwa细胞在mRNA与蛋白水平都有mda-7/IL-24的表达;稳定表达mda-7/IL-24的Namalwa细胞增殖活力以及集落形成能力与转染空载体的对照组相比明显下降(P<0.05);但是两者的凋亡率比较无统计学意义。裸鼠体内移植瘤实验结果显示稳定表达mda-7/IL-24的Namalwa细胞株的致瘤性明显低于转染空载体的对照组(P<0.05)。结论:mda-7/IL-24对来源于Burkitt淋巴瘤的Namalwa细胞系具有明显的增殖抑制作用,为Burkitt淋巴瘤的基因治疗提供了新的思路。     

白细胞介素-24抑制K562细胞生长的机制

 目的　探讨白细胞介素-24（又称黑色素瘤分化相关基因-7,IL-24／mda-7）对白血病细胞系K562的周期阻滞作用机制。方法　利用基因芯片技术初步分析转染IL-24／mda-7与转染空载体的K562细胞之间基因表达差异,并以实时定量PCR验证;以Western blotting方法检测pRb的磷酸化水平。结果　转染IL-24／mda-7可使K562细胞的细胞周期相关基因p21WAF-1、BCCIP上调,cdk6、Smurf2下调,定量PCR证实了上述表达变化;IL-24／mda-7转染还可明显降低K562细胞pRb磷酸化水平。结论　IL-24／mda-7 可能通过调节细胞周期相关蛋白,即上调p21WAF-1、BCCIP,下调cdk6、Smurf2,使K562阻滞于G0／G1期,从而抑制细胞生长。     

基因在肺腺癌A549细胞中的表达及其对细胞生长的抑制

目的: 研究外源性分化抑制因子3（Inhibitor of differentiation 3,Id3）基因表达对人肺腺癌细胞系A549细胞生长的抑制作用。方法：构建Id3和EGFP的融合基因表达载体pEGFP/Id3,采用脂质体转染技术将pEGFP/ Id3导入A549细胞。FCM分析转染细胞EGFP表达效率，荧光显微镜观察EGFP表达情况；半定量RTPCR、免疫细胞化学分析转染后A549细胞 Id3 mRNA和蛋白的表达。MTT法检测转染后A549细胞生长抑制情况，FCM分析A549细胞周期进程，Annexin V/7AAD和Hoechst33258染色检测转染后细胞的凋亡情况。结果:成功构建人Id3与EGFP融合基因表达载体pEGFP/Id3；荧光显微镜和FCM观察到EGFP的有效表达，转染48~72 h时EGFP表达率最高；Id3 mRNA及蛋白在转染后的A549细胞中能有效表达。转染后48 h和72 h，pEGFP/Id3转染组A549细胞生长受到明显抑制（P<0.01）；细胞周期分析表明，pEGFP/Id3转染组G0/G1期细胞显著高于对照组（P<0.05）; Annexin V/7AAD双染结果显示，pEGFP/Id3转染组细胞的早期凋亡率\[（10.67±2.60）%\]显著高于pEGFP组\[（3.39± 2.21）%\]和未转染组\[（2.35 ± 0.95）%\]（P<0.05）；Hoechst33258染色结果也证实pEGFP/Id3组A549细胞出现明显凋亡形态特征。结论:外源性Id3基因在肺腺癌A549细胞中的表达能抑制细胞增殖,并诱导细胞凋亡。     

膜结合型干细胞因子促进白血病细胞K562的增殖和集落形成

目的:探讨膜结合型干细胞因子（membranebound stem cell factor,mSCF）在白血病细胞中的作用。方法：克隆并构建携可溶型干细胞因子（soluble stem cell factor,sSCF）前体的真核表达质粒pTARGETs,采用Overlap PCR法去除外显子6序列,进一步构建mSCF的表达质粒pTARGETm,DNA测序鉴定。通过脂质体介导分别将上述载体和空载体pTARGET转染白血病K562细胞,用G418筛选稳定表达细胞株,并用RTPCR、Western blotting法鉴定。通过CCK8细胞增殖实验以及集落形成实验观察不同细胞株体外增殖特点。结果：成功构建了sSCF和mSCF的真核表达载体,获得了稳定转染细胞株K562V、K562S、K562M。U底培养条件下,K562M增殖能力明显高于K562V和K562S（均P<0.01）。K562M集落形成率显著高于K562V 和K562S (均P<0.01),且集落形态大于其他两种细胞。结论： mSCF与Ckit之间的并置性作用显著促进白血病细胞的增殖。     

IL-27通过上调MIG和IP-10的表达抑制肿瘤血管形成

目的:研究IL27对肿瘤血管生成的抑制作用及其机制。方法： IL27基因稳定转染的人食管癌细胞（Eca109/IL27）接种于裸鼠,建立荷瘤裸鼠模型,观察肿瘤生长情况和裸鼠生存期。用ELISA法检测脾细胞IFNγ的分泌水平;免疫组化法检测瘤组织中VEGF和CD34的表达,并通过CD34的水平计算微血管密度;用RTPCR法检测肿瘤组织趋化因子IP10、MIG mRNA的表达水平。结果：接种Eca109/IL27细胞荷瘤小鼠的生存期较接种野生型Eca109细胞（未转染质粒）和Eca109/LXSN细胞（空载体质粒转染）小鼠的生存期明显延长（P<0.05）。接种Eca109/IL27细胞的裸鼠瘤组织中VEGF和CD34的表达水平显著性低于接种Eca109细胞和Eca109/LXSN细胞,微血管密度显著降低（均P<0.01）。Eca109/IL27组小鼠脾细胞产生较高水平的IFNγ（P<0.05）,趋化因子IP10和MIG mRNA的表达水平也显著性高于接种Eca109细胞组和Eca109/LXSN细胞组（P<0.05）。结论： IL27在裸鼠体内通过上调IP10和MIG表达抑制肿瘤血管生成,从而发挥抗肿瘤作用。     

慢病毒介导bcr/abl基因RNAi对白血病K562细胞生物学特性的影响

目的: 研究慢病毒介导RNAi致bcr/abl基因长期沉默对K562白血病细胞各种生物学特性的影响。方法：构建含bcr/abl RNAi序列的pNLB/AEGFP慢病毒重组质粒载体并包装病毒,感染K562细胞,挑取稳定转化的克隆（B/AK562）。Realtime PCR及Western blotting验证干扰效应;锥虫蓝染色、集落形成实验检测细胞增殖能力变化;联苯胺染色观察细胞分化;ELISA法检测酪氨酸激酶活性;AOEB染色观察细胞凋亡;比色法检测Caspase3、Caspase9活性;以上检测均以K562细胞和转染空质粒EGFPK562作对照。结果：成功构建bcr/abl基因RNAi稳定转染的B/AK562细胞, Realtime PCR及Western blotting证实B/AK562细胞中bcr/abl mRNA及P210bcr/abl蛋白含量明显下调。bcr/abl基因稳定下调后,K562细胞倍增时间明显延长（37.1 vs 20.4、23.3 h）、集落形成能力减弱（P<0.01）,K562细胞向红系分化,酪氨酸激酶活性下降（P<0.01）,自发凋亡率显著提高（P<0.01）,细胞中Caspase3（P<0.05）及Caspase9（P<0.01）活性明显提高。结论：慢病毒介导的RNAi能实现bcr/abl基因长期沉默,从而抑制K562细胞恶性增殖,诱导其分化及凋亡。     

青蒿琥酯对人食管癌细胞的抑制作用及其可能的机制

目的:探讨青蒿琥酯(artesunate,Art)对人食管癌细胞的抑制作用及其可能的机制。 方法：将人食管癌细胞Eca109接种到裸鼠左前上肢，建立食管癌荷瘤裸鼠动物模型，腹腔注射用药，第1组Art 100 mg/kg,第2组Art 200 mg/kg，第3组Art 300 mg/kg，第4组顺铂（cisplatin,又称DDP）3 mg/kg，第5组生理盐水对照组。观察各组裸鼠移植瘤体积和质量的变化，流式细胞术检测移植瘤组织的细胞周期、凋亡以及细胞分裂周期素25A(cell division cycle 25 A,CDC25A )、Smad3和转化生长因子β（transforming growth factor－β, TGF－β）蛋白的表达， RT－PCR检测移植瘤组织中CDC25A、Smad3和TGF－βmRNA的表达水平。结果:成功建立食管癌荷瘤裸鼠动物模型。Art治疗后，裸鼠移植瘤体积和质量均明显小于对照组(P<0.05或P<0.01)，其中Art 200 mg/kg组抑瘤作用最强，与DDP组相当。Art组与对照组相比，细胞周期G0 G1 期显著增高（P<005）、S期显著减少（P<0.05），凋亡率显著增高（P<0.05）；CDC25A蛋白及mRNA显著减少（P<0.05），Smad3和TGFβ蛋白及mRNA显著增高（P<0.05）。结论:Art具有抑制人食管癌细胞增殖的作用，其机制可能与通过下调CDC25A、上调Smad3和TGFβ的表达量而使肿瘤细胞停滞在G0G1期，并诱导肿瘤细胞凋亡有关。     

Survivin基因RNAi对子宫颈癌裸鼠移植瘤生长与凋亡的影响

目的：观察survivin基因RNAi对宫颈癌裸鼠移植瘤生长与凋亡的影响。方法：随机将BALB/c裸鼠分4组,分别注射转染携survivin RNAi重组质粒的HeLas2细胞、转染阴性对照质粒细胞HeLaNC、转染空质粒细胞HeLaU6 neo及宫颈癌HeLa细胞,建立人宫颈癌裸鼠皮下移植瘤模型。观察survivin RNAi对人宫颈癌裸鼠皮下移植瘤生长的影响;免疫组化法检测移植瘤组织中survivin蛋白的表达和微血管密度（MVD）,HE染色及TUNEL染色观察survivin RNAi对人宫颈癌裸鼠皮下移植瘤凋亡的影响。结果：成功建立人宫颈癌裸鼠皮下移植瘤模型, HeLas2组裸鼠瘤重明显小于其他3组（P<0.05）;肿瘤生长抑制率为67.9%。免疫组化结果显示,HeLas2组裸鼠移植瘤组织中survivin蛋白表达显著下降; MVD值也显著降低（P<0.05）;HE染色、TUNEL染色结果显示,HeLas2组裸鼠移植瘤组织细胞凋亡明显增多（P<0.05）,AI值达(22.73±137)%。结论：Survivin基因RNAi可通过下调移植瘤组织survivin蛋白表达和降低其MVD抑制移植瘤生长并促进其凋亡。