Construction of plasmid containing promoter of mouse interferon regulatory factor 3 and analysis of its promoter activity

目的 构建包含小鼠干扰素调节因子3(mIRF-3)基因启动子的质粒,并评价其启动子活性.方法 以小鼠全血细胞总DNA为模板,PCR扩增mIRF-3目的片段,亚克隆此片段至pGL3-basic荧光素酶报告基因的多克隆位点,构建含mIRF-3启动子的重组报告质粒pmIRF-3.将pmIRF-3、pGL3-basic和pGL3-control质粒分别转染小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3后,行荧光素酶 活性检测,计算相对活性单位(RLU).生物信息学分析转录因子结合位点.结果 成功构建了重组报告质粒pmIRF-3.与pGL3-basic组相比,pmIRF-3、pGL3-control组RLU明显增加(0.443±0.113vs.18.907±3.335、25.704±5.850) (P＜0.01).mIRF-3启动子区域内存在AML-1a、E2F、MZF1、CdxA、OCT-x等多个转录因子结合位点.结论 mIRF-3转录起始位点附近1479 bp序列在NIH3T3细胞中具有较强的启动子活性.     

ORMDL3基因第一内含子中新启动子区的鉴定

目的构建表达血清类黏蛋白1样蛋白3(ORMDL3)基因第一内含子中新启动子区的质粒,并研究其功能特征。方法以人基因组DNA为模板,PCR扩增ORMDL3基因第一内含子内新转录起始位点上下游776bp启动子区片段,酶切并连接此片段至pGL3-basic载体,构建含有ORMDL3基因第一内含子中新启动子区的基因重组体,并转染人胚肾293细胞。荧光素酶检测报告基因启动子的活性,计算相对活性单位。生物信息学方法分析转录因子结合位点。结果成功构建含有新启动子的重组质粒。与pGL3-basic空载体相比,新启动子活性明显增强,并定位于转录起始位点-363bp至-63bp之间,且该区域存在Sp1、GATA-1等转录因子的结合位点。结论 ORMDL3基因第一内含子中新转录起始位点上游具有启动子活性,在-363bp至-63bp区域存在转录调控元件,且Sp1、GATA-1等转录因子可能参与其转录调控。     

CD2AP启动子的克隆和活性分析

目的 构建表达CD2AP基因转录起始位点上游启动子的表达质粒,转染人类胚胎肾(HEK)-293T细胞,评价其启动子活性.方法 以人全血细胞总DNA为模板,PCR扩增CD2AP转录起始位点上游2082 bp的启动子区片段.亚克隆此片段至无启动子活性的pGL-3基本载体荧光素酶报告基因上游的多克降位点,构建含CD2AP启动子的重组报告质粒.转染HEK-293T细胞,行荧光素酶活性检测,计算相对活性单位(RLU).生物信息学分析转录因子结合位点.结果 酶切,测序鉴定证实成功构建含有CD2AP基因转录起始位点上游2082 bp的启动区的表达质粒.CD2AP的启动子与正常的pGL-3基本质粒比较,其RLU增加了74.8倍.其上游启动子区序列中含多个转录因子结合序列如AP1、Sp1、CREB和GATA-1等.结论 CD2AP转录起始位点上游序列在HEK-293T细胞中具有较强的启动活性.     

Identification of the new promoter in the fisrt intron of ORMDL3 gene

目的 构建表达血清类黏蛋白1样蛋白3(ORMDL3)基因第一内含子中新启动子区的质粒,并研究其功能特征.方法 以人基因组DNA为模板,PCR扩增ORMDL3基因第一内含子内新转录起始位点上下游776 bp启动子区片段,酶切并连接此片段至pGL3-basic载体,构建含有ORMDL3基因第一内含子中新启动子区的基因重组体,并转染人胚肾293细胞.荧光素酶检测报告基因启动子的活性,计算相对活性单位.生物信息学方法分析转录因子结合位点.结果 成功构建含有新启动子的重组质粒.与pGL3-basic空载体相比,新启动子活性明显增强,并定位于转录起始位点-363 bp至-63 bp之间,且该区域存在Sp1、GATA-1等转录因子的结合位点.结论 ORMDL3基因第一内含子中新转录起始位点上游具有启动子活性,在-363 bp至-63 bp区域存在转录调控元件,且Sp1、GATA-1等转录因子可能参与其转录调控.     

三联组氨酸核苷酸结合蛋白2启动子报告基因质粒的构建和活性鉴定

目的 三联组氨酸核苷酸结合蛋白2(Hint2,histidine triad nucleotide binding protein 2)在肝癌组织中低表达并与临床病理分期和病人预后密切相关,为研究Hint2的基因表达调控,构建人Hint2启动子荧光素酶报告基因质粒并鉴定活性.方法 提取人基因组DNA,以其为模板,将含有Hint2启动子的不同长度的片段插入荧光素酶质粒pGL3-basic,后与β-半乳糖苷酶共转染HeLa细胞,转染后24h通过β-半乳糖苷酶实验检测转染效率,通过荧光素酶实验检测转录活性.结果 质粒pGL3-h1(-6--463,457bp),pGL3-h2(-6--1255,1249bp)构建成功后,与 β-半乳糖苷酶共转染人子宫颈癌HeLa细胞.转录活性=荧光素酶值/β-半乳糖苷酶值,结果 显示pGL3-basic荧光素酶值/β-半乳糖苷酶值为147.3272,而pGL3-h1为67936,pGL3-h2为64234.19.空质粒与pGL3-h1,pGL3-h2之间差异具有统计学意义,而pGL3-h1,pGL3-h2之间差异不具有统计学意义.结论 Hint2位于转录起始位点上游-6至--463之间的启动子区域具有强转录活性.     

以Insig-2基因启动子为靶点的药物筛选模型的建立

目的通过双荧光素酶报告基因检测系统建立以胰岛素诱导基因2(insulin-induced gene 2,Insig-2)启动子为靶点的药物筛选模型。方法将人Insig-2基因启动子序列克隆入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,构建重组质粒pGL3-Insig-2并与内参质粒pRL-TK瞬时共转染工具细胞,通过检测荧光素酶报告基因表达水平的变化反映Insig-2基因启动子启动转录的活性,并对共转染质粒比例、工具细胞选择等条件进行探索和优化,相关药物处理进行验证。结果成功构建了重组质粒pGL3-Insig-2;确认pGL3-Insig-2:pRL-TK共转染比例为4∶1,确定3T3-L1细胞为工具细胞;1,25-(OH)2D3、小檗碱和姜黄素均能明显增强Insig-2基因启动子活性。结论成功建立了以Insig-2基因启动子为靶点的药物筛选模型,为筛选新型调脂药奠定基础。     

干扰素调节因子3第二内含子中新启动子在人胚肾AD-293细胞中的功能特征

目的构建包含人干扰素调节因子3(IRF-3)基因第二内含子中新启动子的质粒,研究其功能特征。方法以人类基因组DNA为模板,PCR定向克隆和酶切亚克隆构建IRF-3基因第二内含子内新转录起始位点上游的新启动子基因重组体,并瞬时转染人胚肾AD-293细胞。荧光素酶检测报告基因启动子的活性,计算相对活性单位(RLU)。结果成功构建含有新启动子区的质粒,与pGL3-Basic组相比,新启动子活性明显增强,并定位于新转录起始位点前-317～-110bp,且该区域内存在环腺苷酸应答元件结合蛋白(CREB)和GATA等转录因子结合位点。结论 IRF-3第二内含子内新转录起始位点上游具启动子活性;在-317～-110bp区域存在必需调控元件,并且CREB和GATA等转录因子可能参与其转录调控。     

基于双荧光素酶报告基因系统的人源SREBP1基因启动子的活性研究

目的 构建固醇调节元件结合蛋白 1（SREBP1）启动子双荧光素酶报告基因表达载体,为研究针对 SREBP1靶点的天然活性抑制剂筛选奠定基础。方法 利用生物信息学软件,对SREBP1基因5′端上游5 000 bp序 列进行启动子预测与分析。应用 Gibson Assembly 方法构建启动子双荧光素酶载体,并将构建成功的 pGL3- SREBP1-pro重组质粒和内参质粒pRL-SV40共转染肝癌HepG2细胞并给予天然抑制剂大黄素,检测SREBP1转录活 性的抑制效果。结果 SREBP1基因5′端上游2 000 bp区域内有启动子特征序列,存在转录因子结合位点;重组质粒 经酶切及测序鉴定证实为阳性克隆,瞬时转染肝癌HepG2细胞后经双荧光素酶报告基因系统检测,所克隆的片段序 列具有启动子活性,该活性可被大黄素所抑制。结论 成功构建了pGL3-SREBP1-pro双荧光素酶报告基因表达载 体,并证实其活性,可为进一步用于针对SREBP1靶点的天然活性抑制剂筛选奠定     

雌激素对载脂蛋白AⅠ基因启动子不同区域转录活性的影响

目的:探讨雌激素对载脂蛋白(Apo)AⅠ基因启动子不同区域转录调节活性的影响。方法:利用含荧光素酶报告基因的表达载体pGL2构建携带ApoAⅠ基因启动子不同区域片段的重组质粒和同时携带ApoCⅢ/AⅣ基因片段的重组质粒。阳离子脂质体法将重组质粒与pRL-null内参质粒共转染HepG2细胞,加入10μmol/L雌激素刺激24h检测细胞荧光素酶报告基因的荧光强度,以反映ApoAⅠ的转录水平。结果:pGL2/-256AⅠ,pGL2/-2500AⅠ,pGL2/-256AⅠCⅢAⅣ及pGL2/-2500AⅠCⅢAⅣ转染后雌激素组荧光素酶相对活性明显高于对照组(P<0.05);而pGL2/-41AⅠ及pGL2/-41AⅠCⅢAⅣ质粒转染后雌激素组与对照组荧光素酶活性差异无统计学意义(P>0.05)。结论:ApoAⅠ启动子-256~-41区域可能包含与雌激素作用相关的反应元件,受雌激素刺激后转录活性增强。     

-514bp及-250bp位点基因多态性对肝脂酶转录活性的影响

目的:探讨同时含肝脂酶(HL)启动子-514 bp和-250 bp多态位点的野生型及变异纯合子型的荧光素酶表达质粒对HL转录活性的影响.方法:PCR法扩增含不同目的基因的DNA片段,将目的基因插入到pUCm-T质粒中,获取含SacⅠ及BglⅡ酶切位点的目的基因,将该基因与含荧光素报告基因的pGL2质粒相连,构建pGL2-HL/-514T+ -250A变异纯合型以及pGL2-HL/-514C+ -250G野生型荧光素酶表达质粒,转染至HepG2细胞内表达,双荧光素酶检测系统检测不同重组质粒荧光素酶报告基因的活性.结果:(1)实验成功构建了同时含HL启动子部位-514/-250位点的野生型和变异纯合型的荧光素酶表达质粒.(2) pGL2-HL/-514T+ -250A变异纯合型的荧光素酶相对表达活性明显低于野生型荧光素酶表达活性(P＜0.01).结论:HL启动子-514及-250位置基因的联合变异可直接影响HL的转录活性.     

Effect of transforming growth factor-beta on activity of connective tissue growth factor gene promoter in mouse NIH ／ 3T3 fibroblasts

AIM: To investigate the regulatory mechanism of transforming growth factor-betaon activity of connective tissue growth factor promoter in mouse NIH/3T3 fibroblasts. METHODS: The regulation fragment of the 5' flanking region of the human CTGF gene was linked to pGL3-Basic vector, a firefly luciferase reporter construct without promoter. The recombinant plasmid pCTGF-luc was transiently transfected to NIH/3T3 fibroblasts. The activity of CTGF promoter after treatment of TGF-β1…     

丙泊酚抑制机械牵张诱导的肺泡上皮细胞HMGB1启动子转录激活

目的探讨丙泊酚对机械牵张诱导肺泡上皮细胞(A549)高迁移率族蛋白B1(high mobility group box1 pro-tein,HMGB1)启动子转录激活的影响。方法以基因重组技术将HMGB1启动子克隆入荧光素酶报告基因表达载体pGL3-Basic,得到重组质粒pGL3-HMGB1P。采用脂质体介导的细胞转染技术将pGL3-HMGB1P和空载体pGL3-Basic分别转染A549细胞,以机械牵张和机械牵张+丙泊酚分别处理转染后的A549细胞,检测并比较荧光素酶活性,分别用Western blot和RT-PCR检测细胞HMGB1蛋白和mRNA的表达。结果酶切和测序结果证实重组载体pGL3-HMGB1P构建正确,荧光素酶活性检测显示重组载体pGL3-HMGB1P在A549细胞中有效表达。与未牵张组比较,牵张组HMGB1启动子的转录活性和HMGB1表达均明显增加(P<0.05);与牵张组比较,牵张+丙泊酚组HMGB1启动子的转录活性和HMGB1表达均明显降低(P<0.05)。结论丙泊酚在转录水平通过抑制机械牵张诱导HMGB1启动子的转录激活而影响HMGB1的表达,可能是丙泊酚防治机械牵张引起炎症反应的机制之一。     

雌激素/雌激素受体α信号通路抑制血管平滑肌细胞SM22α的转录作用

目的确定雌激素/雌激素受体α(ERα)信号通路对大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)分化标志基因SM22α的转录调节作用。方法利用组织块贴壁法分离获得大鼠VSMCs,采用PCR方法扩增获得大鼠SM22α,并插入到pGL3-Basic质粒中构建SM22α启动子荧光素酶报告基因质粒。分别在VSMCs和COS-7细胞中利用Lucif-erase检测雌二醇(E2)、ERα及Myocardin对SM22α启动子转录活性的影响情况。结果 SM22α启动子荧光素酶报告基因质粒构建成功,E2、ERα可以抑制Myocardin对SM22α的转录活性。结论 E2/ERα信号通路可通过抑制Myocardin对SM22α的转录活性,从而促进VSMCs由分化型向增殖型转变。     

FSHB启动子基因多态性与多囊卵巢综合征的相关性研究

目的 克隆人卵泡刺激素β亚基(Follicle Stimulating Hormone β-subunit,FSHB)的启动子;构建FSHB启动子的报告基因载体并进行活性分析.方法 设计合成FSHB启动子引物,采用PCR技术从人基因组DNA中扩增FSHB启动子序列;将扩增片段插入载体并利用酶切与测序进行鉴定;亚克隆该基因至PGL6-TA荧光报告基因载体;瞬时转染进Hela细胞,收集细胞裂解液后,用荧光素酶报告基因系统检测报告基因载体的活性.结果 PCR扩增得到人FSHB基因启动子;成功构建pGL6-FSHB-promoter报告基因载体,测序结果表明启动子序列正确;双荧光素酶报告基因检测系统证实构建的报告基因载体具有启动子活性.通过荧光素酶相对表达效率比较,在Hela细胞的体外实验中发现,FSHB-211G→T突变后荧光素酶表达具有更高的效率,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 成功构建人FSHB基因启动子的克隆及其报告基因载体的构建,为深入研究FSHB转录表达的调控机制提供基础.     

小鼠核结合因子a1基因启动子报告载体的构建及鉴定

目的:构建小鼠核结合因子a1(Cbfa1)基因启动子萤光素酶报告载体,并检测其驱动报告基因的转录活性。方法:以小鼠基因组DNA为模板,巢式PCR扩增含有Cbfa1基因启动子(-1000～+200bp)的序列。限制性内切酶MluI和XhoI酶切这段序列后定向克隆到不含启动子的PGL3-Basic报告基因载体上,重组质粒命名为pGL3-Cbfa1。pGL3-Cbfa1瞬时转染成骨细胞系MC3T3-E1,检测其能否在Cbfa1基因启动子的调控下表达报告基因并提高萤光素酶活性。结果:pGL3-Cbfa1经酶切鉴定和序列分析证实与设计完全一致。细胞瞬时转染结果表明Cbfa1启动子具有转录活性,pGL3-Cbfa1的萤光素酶水平约是pGL3-Basic的35倍。结论:小鼠Cbfa1启动子报告基因载体的成功构建,为进一步将其用于抗骨质疏松药物的筛选与评价奠定了实验基础。     

人白介素-15基因系列启动子克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建

目的克隆人白介素-15(IL-15)基因系列启动子,构建IL-15基因启动子荧光素酶报告基因载体。方法通过PCR方法从HaCaT细胞基因组DNA中获得IL-15基因编码序列5′上游七段逐步缺失的IL-15启动子序列;双酶切后,分别重组到含萤火虫荧光素酶的报告基因pGL3-Basic载体上,构建IL-15基因系列启动子报告基因载体;用脂质体转染法将含最长启动子序列的报告基因载体转染至HaCaT细胞,并设置空白对照组和LPS组分别处理;24 h后采用双荧光素酶报告基因系统检测其启动子活性。结果经PCR方法扩增出七段逐步缺失的IL-15基因启动子片段,PCR及双酶切鉴定各重组体构建正确;瞬时转染HaCaT细胞后经报告基因检测得知所克隆最长序列具有启动子活性。结论成功构建了IL-15系列启动子报告基因载体,并在HaCaT细胞中初步活性分析得知所克隆IL-15基因调控系列内包含启动子核心区域,为进一步研究IL-15表达调控机制奠定了实验基础。     

核仁素转录激活子功能研究

目的：研究核仁素的转录激活子作用,探讨CD34^＋分子的基因转录调节机制。方法：分别构建核仁素的表达质粒,以及野生型和含有缺失突变的CD34^＋基因调控区质粒,启动子区下游含有荧光素酶报告基因。这些报告质粒的调控区分别是：①0．8kb野生型CD34^＋基因上游5’端序列;②缺失了127个核苷酸的CD34^＋基因上游5’端序列。应用瞬时转染试验,研究人CD34^＋基因上游5’端的转录特征,分析核仁素对CD34^＋基因的转录调节功能。结果：①含野生型CD34^＋基因上游5’端序列的报告质粒的相对荧光素酶活性约为空质粒pGL3-Basic的3倍;CD34^＋基因上游调控区的活性可被核仁素激活,其相对荧光素酶活性是空质粒的8倍。②CD34^＋基因上游5’端有127nt．缺失的报告质粒的相对荧光素酶活性与空质粒pGL3-Basic的活性相同,且与核仁素表达质粒共转染细胞时,其相对荧光素酶活性没有变化。结论：核仁素对CD34^＋基因起转录激活作用。CD34^＋基因上游5’端自-470nt．至-344nt．的区域对CD34^＋基因的表达具有重要意义。