聚合酶链反应-增强化学发光法快速检测结核杆菌的研究

目的　建立聚合酶链反应 -增强化学发光法 (polymerase chain reaction-enhanced chemilumine cence ,PCR-ECL)快速高灵敏度和高特异性检测结核杆菌的方法。方法 以结核分支杆菌、牛分支杆菌特异性抗原Pab基因的419bp片段为靶序列,PCR体系经优化,直接酶标法标记探针 ,增强化学发光检测(ECL)进行分子杂交。结果 PCR体系对结核分支杆菌、牛分支杆菌、卡介苗的扩增为阳性,PCR体系灵敏度为5fgDNA分子。ECL体系灵敏度为0.5pgDNA分子。采用模拟痰样,可检至10个以下结核杆菌。结论 建立了结核杆菌的PCR-ECL快速检测方法,整个过程可在一天半内完成。     

复方PCR用于分支杆菌菌种鉴定的初步研究

目的 寻找新的、快捷简便的分支杆菌菌种鉴定技术，进一步提高临床结核病诊断的水平。方法 将3套分支杆菌基因组DNA的不同标记引物同时放入一个体系中，并在同一退火温度下进行PCR扩增，通过对扩增产物的不同带型进行分析，对已知标准株和部分临床株进行菌种鉴定。结果 复方PCR方法可将结核复合群中的结核分支杆菌、牛结核分支杆菌与非结核分支杆菌一次性地区分开，特异性达到100％，灵敏度为10ng／反应。结论 复方PCR技术是一种有效而又简捷的分支杆菌诊断方法，可用于临床上分结核与非结核分支杆茵或分支杆菌与非分支杆菌的初步区分。     

复方PCR用于分支杆菌菌种鉴定的初步研究

目的　寻找新的、快捷简便的分支杆菌菌种鉴定技术,进一步提高临床结核病诊断的水平。方法 将3套分支杆菌基因组DNA的不同标记引物同时放入一个体系中,并在同一退火温度下进行PCR扩增,通过对扩增产物的不同带型进行分析,对已知标准株和部分临床株进行菌种鉴定。结果 复方PCR方法可将结核复合群中的结核分支杆菌、牛结核分支杆菌与非结核分支杆菌一次性地区分开,特异性达到100%,灵敏度为10ng/反应。结论 复方PCR技术是一种有效而又简捷的分支杆菌诊断方法,可用于临床上分结核与非结核分支杆菌或分支杆菌与非分支杆菌的初步区分。     

聚合酶链反应和DNA探针联合检测临床标本中结核杆菌的研究

目的为提高聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测未培养临床标本中结核杆菌的敏感性和特异性，方法，首先通过琼脂糖凝胶电泳检测ＰＣＲ扩增产物，然后用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ法转移到至膜上，与地高辛标记的人型结核杆菌ＤＮＡ探针杂交。结果ＰＣＲ电泳检测的灵敏度为１ｐｇ而ＤＮＡ探针检测将灵敏度提高到１００ｆｇ。２４种受试菌株中，只有结核分支杆菌复合体和蟾分杆菌有２４５ｂｐ扩增带，其中牛型结核分支杆菌与１８８ｂｐ探针不杂交，对２     

用DNA 芯片快速检测结核分支杆菌对利福平的耐药性

目的：研制一种新型DNA芯片，用于结核分支杆菌对利福平的耐药性快速检测，方法：根据结核分支杆菌rpoB基因的序列信息设计探针并制作DNA芯片，PCR扩增并荧光标记包含结核分支杆菌rpoB基因突变热点的目的片段，与芯片杂交，同时以DNA测序法为对照，结果：17株随机抽取的耐利福平结核分支杆菌菌株有14株可用DNA芯片检测出来，效率可达83％，患者痰液中少量的DNA足够进行芯片检测，无须进行培养。结论：用DNA芯片来检测结核分支杆菌对利福平的耐药性具有较高的特异性和灵敏度，该法快速，精确，可以应用于临床耐药性检测。     

聚合酶链反应—单链构象多态性技术检测耐多药结核分支杆菌rpoB、KatG、rpsL突变的研究

应用PCR-SSCP技术快速检测耐INH,RFP,SM结核分支杆菌分离株rpoB、KatG、rpsL基因突变,评价其在检测结核分支杆菌耐药性方面的价值。方法 32侏耐INH、RFP、SM结核分支杆菌临床分离株及25侏结核分支杆菌敏感分离株用PCR-SSCP方法分别检测,rpoB、KatG、rpsL基因突变。结果 32株耐多药结核分支杆菌分离株中,rpoB、KatG、rpsL PCR扩增产物PCR-SSCP分别有28株（87.5%)rpoB基因,19株（59.3%)KatG基因和23株（71.9%)rpsL基因电泳条带与结核分支杆菌标准株H37Rv电泳条带相比有明显差异,而25株结核分支杆菌敏感株的PCR-SSCP条带与结核分支杆菌H37Rv相似,特异性为100%。结论 PCR-SSCP方法敏感、特异,可快速检测结核分支杆菌rpoB、KatG、rpsL耐药基因突变,有利于耐多药结核分支杆菌耐药性的快速检测。     

PCR快速检测支气管灌洗液结核杆菌的研究

应用PCR(聚合酶链反应)体外DNA扩增技术检测结核杆菌DNA,灵敏度为1pg,约10～100个菌。所用引物只扩增结核杆菌复合体DNA产生245bp片段,其余受试分支杆菌及链霉菌、大肠杆菌未见该片段扩增,可见具有较高特异性。PCR直接检测83例结核病人支气管灌洗液结核杆菌DNA阳性率56.6％,显著高于涂片(20.5％)和培养(25.3％)。     

应用噬菌体裂解法快速鉴定结核分支杆菌

目的 研究噬菌体裂解试验对结核分支杆菌快速鉴定的意义。方法 应用结核分支杆菌噬菌斑技术快速检测结核分支杆菌、非结核分支杆菌和非分支杆菌及肺结核患者痰标本。结果 结核分支杆菌H37Rv、牛分支杆菌和非洲分支杆菌噬菌体裂解试验均为阳性,10株常见非结核分支杆菌和7株非分支杆菌均为阴性;30株结核分支杆菌临床分离株本法检测结果全部阳性;20份涂阳培阳肺结核患者痰标本,本法阳性19份（95％）;21份涂阴培阳痰标本,本法阳性15份（71％）;19份涂阴培阴痰标本,5份阳性（26％）。结论 噬菌体裂解试验可以快速鉴定结核分支杆菌,用其检测痰标本中的结核分支杆菌具有很高的特异性和较高的敏感性。     

结核分支村菌耐药分子机制及快速检测的研究

目的：研究结核分支杆菌异烟肼、利福平耐药的分子机制，探索快速检测结核分支杆菌异烟肼、利福平耐药性的分子生物学方法。方法：应用聚合酶反应－单链构象多态性（PCR-SSCP）检测结核分支杆菌异烟肼、利福平耐药株与katG基因、rpoB基因突变。结果：46株结核分支杆菌临床分离株均未发现katG基因序列的缺失，30株异烟肼耐药株中，17株检测到katG基因突变，耐药株中katG基因的突变率为57％；87株结核分支杆菌利福平耐药临床分离株的PCR－SSCP结果显示，所有39株利福平敏感菌无突变检出，48株利福平耐药菌中，36株高度利福平耐药菌和7株低度利福平耐药菌检测量到rpoB基因突变；利福平耐药株中rpoB基因的突变检出率为89．6％。结论：证实katG和rpoB基因突变分别是结核分支杆菌异烟肼和利福平耐的主要分子机制。应用聚合酶链反应－单链构象多态性（PCR－SSCP）可快速检测结核分支杆菌异烟肼、利福平耐药性。     

利用发光自显影技术快速筛选结核杆菌的利福平耐药性

目的　利用发光自显影技术建立一种快速、简便的结核分支杆菌利福平耐药性筛选方法。方法 利用重组的分支杆菌噬菌体可在活菌内增殖的原理,来检测结核杆菌在含利福平液体培养基中的生长状况;采用发光自显影方法检测发光强度并确定活菌数,对43份结核杆菌样本进行快速检测,并与L-J培养基检测结果进行对比。结果 发光自显影方法与L-J培养法相比,阳性率和真阴性率分别为95.7%、90%,最佳检测的细菌浓度为10⁷～10⁸CFU/ml,最佳药敏试验的利福平浓度为1mg/ml,利福平与结核分支杆菌孵育48小时后即可进行发光自显影分析。结论 生物发光方法可用于快速筛选结核分支杆菌的利福平耐药性,是一种简单、快速、灵敏、实用的利福平药敏筛选方法。     

地高辛核酸探针在分支杆菌菌种鉴定中的应用

地高辛标记的结核分支杆菌全染色体核酸探针膜呈色杂交法的建立,表明该探针显示良好的灵敏度和特异性。此种探针具有效期长、操作方便、反应快速等特性,优于同位素标记探针。其全染色体核酸细胞杂交法可适用于结核分支杆菌复合群和非结核分支杆菌的临床分离株的菌种鉴定。     

基因释放剂对痰中耐利福平结核分支杆菌rpoB基因突变检出率的影响

结核分支杆菌DNA依赖性RNA聚合酶β亚单位编码基因(rpoB)是单拷贝基因,提高其检测灵敏度对直接检出痰中耐利福平结核分支杆菌具有重要意义。我们在聚合酶链反应-单链构象多态性分析中(PCR-SSCP)采用基因释放剂和套式PCR,提高痰标本中结核杆菌rpoB基因突变检出率,以快速确定是否为耐药菌感染。     

利用发光自显影技术快速筛选结核杆菌的利福平耐药性

目的 利用发光自显影技术建立一种快速、简便的结核分支杆菌利福平耐药性筛选方法。方法 利用重组的分支杆菌噬菌体可在活菌内增殖的原理，来检测结核杆菌在含利福平液体培养基中的生长状况；采用发光自显影方法检测发光强度并确定活菌数，对43份结核杆菌样本进行快速检测，并与L－J培养基检测结果进行对比。结果 发光自显影方法与L－J培养法相比，阳性率和真阴性率分别为95．7％、90％，最佳检测的细菌浓度为10^7-10^8CFU/ml，最佳药敏试验的利福平浓度为1mg/ml，利福平与结核分支杆菌孵育48小时后即可进行发光自显影分析。结论 生物发光方法可用于快速筛选结核分支杆菌的利福平耐药性，是一种简单、快速、灵敏、实用的利福平药敏筛选方法。     

用DNA芯片快速检测结核分支杆菌对异烟肼的耐药性

目的 研制一种新型DNA芯片，用于结核分支杆菌对异烟肼耐药性的快速检测。方法 根据结核分支杆菌与异烟肼耐药性有关的三个基因的序列信息设计信息设计探针并制作DNA芯片，PCR扩增并荧光标记包含突变热点的目的基因片段，与芯片杂交，同时与临床背景资料及DNA测序法相对照。结果 随机抽取5株结核分支杆菌敏感株和40株结核分支杆菌耐异烟肼菌株进行检测，其中5株敏感株均未发生突变，4株耐药株中有29株发生突变，覆盖率达到72．5％；另抽取10株进行DNA测序（包括2株未检测到信号的耐药株），与芯片检测结果完全相符。结论 用DNA芯片检测结核分支杆菌对异烟肼的耐药性具有较高的特异性和灵敏度，该法快速，精确，可以应用于结核病临床药性检测。     

应用硝酸盐还原试验快速检测结核分支杆菌耐药性的研究

目的 建立一种快速结核分支杆菌耐药性试验方法。方法 以绝对浓度法为“金标准”，对已知耐药的结核分支杆菌菌株及敏感株采用硝酸盐还原试验(NRA)检测其耐药性。结果 两种方法可比性好，与绝对浓度法比较，硝酸盐还原试验敏感性为96.5％以上，特异性100％；NRA法比绝对浓度法平均提前3周出结果。结论 硝酸盐还原试验可作为一种快速结核分支杆菌耐药性试验方法。     

荧光探针杂交技术检测临床标本内结核人支杆菌的价值

目的：评价聚合酶链反应（PCR）荧光探针杂交技术（TaqMan技术）检测临床标本中结核分支杆菌的应用价值。方法：应用细菌学方法（涂片镜检和培养）及TaqMan法检测133份结核病患者痰标本，53份非结核呼吸系疾病患者痰标本。结果：细菌学方法检测结核病患者临床标本中结核分支杆菌阳性率为36．1％，TaqMan法阳性率为61．7％，高于细菌学检测法，经统计学处理，两者有显著性差异（P＜0．05），用TaqMan法检测临床标本特异性为96．2％，结论：TaqMan技术将PCR扩增、荧光探针杂交及检测一体化，在单一管内完成，具有简便，快速、防污染，敏感性及特异性较高等优点，是结核病辅助诊断的有效方法之一。     

应用多重PCR技术快速鉴定牛分支杆菌卡介苗株

目的:建立快速鉴定牛分支杆菌卡介苗(Bacillus Calmette Guerin,BCG)菌株的方法.方法:依据最近研究发现的牛分支杆菌BCG菌株不存在命名为缺失区1(deleted region 1,RD1)的基因区,而其它牛分支杆菌菌株和其它结核分支杆菌复合群(MTC)菌种(结核分支杆菌、非洲分支杆菌和田鼠分支杆菌)存在RD1基因区的遗传学信息,应用多重聚合酶链反应(PCR)检测RD1基因区存在与否,鉴别BCG菌株与其它牛分支杆菌菌株及其它MTC菌种.RD1区编码约9.5kbDNA片段,至少含8个开放阅读框架.     

痰液标本结核分支杆菌RNA恒温扩增检测及临床应用

目的探讨实时荧光核酸恒温扩增检测法（SAT）在肺结核患者实验诊断中的应用。方法设计特异性引物和探针,建立并优化SAT检测体系,对131例临床确诊并接受治疗的肺结核患者、73例非结核性肺部感染者痰液标本中的结核分支杆菌（TB）RNA进行检测,并与PCR法检测TB DNA,痰培养法、痰涂片抗酸染色法检测TB的结果进行比较。结果 131例肺结核患者痰液标本中,SAT对TB检出率为52.67%,高于痰培养法（39.69%,P=0.035）和痰涂片抗酸染色法（35.11%,P=0.004）;以PCR法为参考标准,SAT的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值依次是95.38%、90.91%、91.18%、95.24%。结论 SAT检测痰液标本中TB RNA灵敏度高,特异性强,操作简便、快速,具有临床推广应用价值。     

应用多重聚合酶链反应技术快速鉴定牛分支杆菌卡介苗株

目的 建立快速鉴定牛分支杆菌卡介苗(BCG)菌株的方法。方法 依据最近研究发现的牛分支杆菌BCG菌株不存在命名为缺失区1(deleted region 1，RD1)的基因区，而其他牛分支杆菌菌株和其他结核分支杆菌复合群(MTC)菌种(结核分支杆菌、非洲分支杆菌和田鼠分支杆菌)存在RD1基因区的遗传学信息，应用多重聚合酶链反应(PCR)检测RD1基因区存在与否，以鉴别BCG菌株与其他牛分支杆菌菌株及其他MTC菌种。结果 所试5株BCG疫苗生产用标准菌株和近期国内发生的1例小儿BCG接种后全身播散性感染致死病例的2株BCG分离菌株，均缺失RD1基因区；其他牛分支杆菌菌株，包括3株牛分支杆菌标准菌株、5株分别从结核病牛或鹿分离的牛分支杆菌菌株，1株从结核病患痰标本分离的牛分支杆菌菌株，以及其他MTC菌种，包括结核分支杆菌H37Rv和H37Ra标准菌株、48株从结核病患痰标本分离的结核分支杆菌菌株、3株非洲分支杆菌标准菌株，均存在RD1区。结论子多重PCR技术用于牛分支杆菌BCG菌株的鉴定简便、快速、特异，适于在临床实验室应用。     

噬菌体裂解法与BACTEC-460法在结核分支杆菌快速检测中的比较

目的：比较噬菌体裂解法与BACTEC－460法在结核分支杆菌快速检测及鉴定中的价值。方法：应用噬菌体裂解法和BACTEC－460法分别检测30株结构分支杆菌临床分离株、10株非结核分支杆菌和7株非分支杆菌，以及60份临床确诊的肺结核患者的痰标本，结果：所有结核分支杆菌临床分离株噬菌体裂解试验均为阳性，而非结核分支杆菌和非分支杆菌均为阴性。41份BACTEC－460培养阳性和19份BACTEC－460培养阴性的痰标本中，噬菌体裂试验分别有34份（82．9％）和5份（26．3％）阳性。结论：噬菌体裂解法可以简便，快速地检测结核分支杆菌，并且具有较高的敏感性的特异性。