针对人STAT1基因的RNA干扰有效靶点的设计与筛选

目的:设计并筛选针对人STAT1基因有效的RNA干扰靶点。方法:根据人STAT1基因序列,设计3个干扰序列,将oligo退火成双链并连接穿梭载体pLKO-1-EGFP-puro-shRNA,构建shRNA慢病毒载体质粒,并转化至感受态细胞DH5a,进行测序验证。在脂质体介导下转染293T细胞,包装生产慢病毒。慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L的STAT1过表达瘤株(MHCC97L-stat1),用Real-timePCR检测干扰效果。结果:测序证实3个STAT1基因RNAi病毒载体质粒构建成功;慢病毒载体经293T细胞包装成功;3个慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L-stat1瘤株48h后,STAT1基因在mRNA水平表达均受到抑制,其中MHCC9-L-stat1-shRNA-1序列效果最佳,对STAT1基因表达的干扰效率可达81.4%。结论:成功构建并筛选了人STAT1基因RNAi慢病毒载体及有效靶点,为进一步深入研究STAT1基因与抗肿瘤药物药效关系奠定基础。     

人VEGF基因慢病毒介导RNA干扰有效靶点的设计及筛选

目的:设计并筛选人血管内皮生长因子(VEGF)有效RNA干扰片段,构建VEGF慢病毒表达载体。方法:对人VEGF基因编码区分析,筛选序列3条,阴性对照序列l条,通过连接线性化的plenti6.3-MIR载体,构建miRNA慢病毒载体质粒,并转化至感受态细胞DH5α,进行测序验证。在脂质体介导下转染293T细胞,包装生产慢病毒,测定其滴度。慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L,用Real-time PCR检测干扰效果。结果:测序证实3个VEGF基因RNAi慢病毒载体质粒构建成功。慢病毒载体经293T细胞包装成功,测定病毒的滴度分别为3.23×109、3.30×109、3.73×109TU/mL。3个慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L后,VEGF基因在mRNA水平受到抑制,其中miR-200序列效果最佳,对VEGF基因表达的干扰效率可达72%。结论:成功构建并筛选了人VEGF基因RNAi慢病毒载体及有效靶点,为进一步深入研究VEGF基因与抗肿瘤药物药效关系提供实验基础。     

参芪扶正注射液联合IFN-α对肝癌细胞STAT1基因表达的影响

目的:研究参芪扶正注射液与干扰素α(IFN-α)联用时对肝癌细胞STAT1基因表达的影响,探讨其对IFN-α协同增效的作用机制。方法:运用MTT法检测IFN-α注射液单独或与参芪扶正注射液联合对MHCC97-L细胞增殖的影响;运用Real-time PCR和Western-blot分别检测IFN-α单独或与参芪扶正注射液联用对STAT1 RNA和蛋白质表达的影响;构建STAT1干扰慢病毒载体并实现其在MHCC97-L中表达,通过RT-PCR、We s te rn-Blot验证其干扰STAT1表达的有效性;MTT法检测IFN-α单独或联合参芪扶正注射液对STAT1基因"沉默"细胞株增殖的影响。结果 :与单独使用IFN-α相比,参芪扶正注射液与IFN-α联用可以增强IFN-α对人肝癌MHCC97-L的抑制作用(P<0.01),并上调STAT1 mRNA(P<0.05)和蛋白质的表达(P<0.05);成功构建STAT1基因"沉默"的MHCC97-L细胞株;参芪扶正注射液协同IFN-α对STAT1基因"沉默"MHCC97-L的抑制率与单独使用IFN-α差异无统计学意义(P>0.05)。结论:参芪扶正注射液可上调人肝癌细胞MHCC97-L中STAT1的表达,从而提高IFN-α的疗效。     

ELL慢病毒表达载体的构建及其感染前列腺癌PC3细胞的研究

目的构建ELL基因的慢病毒表达质粒,探讨其感染人前列腺癌PC3细胞的可行性。方法将含有全长ELL的质粒和慢病毒表达载体经双酶切后连接,构建成重组慢病毒载体质粒pCDH1-MCS1-EF1-copGFP-ELL。对慢病毒载体质粒进行双酶切和测序鉴定后,制备包装病毒并转染人前列腺癌细胞系PC3。结果慢病毒载体质粒pCDH1-MCS1-EF1-copGFP-ELL的酶切和测序结果与预计的序列一致。慢病毒感染人前列腺癌PC3细胞后能稳定高表达ELL。结论成功构建了ELL的慢病毒表达载体,ELL可被成功转染入人前列腺癌细胞。     

LMP-1基因慢病毒载体构建及其在大鼠骨髓间充质干细胞的表达

目的：构建人LMP-1重组慢病毒载体,体外转染大鼠骨髓间充质干细胞,检测LMP-1基因在大鼠骨髓间充质干细胞的表达。方法：利用PCR法从cDNA文库中钓取LMP-1基因,将其与经AgeI酶切线性化的慢病毒载体pGC-FU-EGFP相连接,转化感受态大肠杆菌,筛选出阳性克隆pGC-FU-LMP-1-EGFP,基因测序对其鉴定。经293T细胞包装后,收集富舍病毒颗粒LV-LMP-1-EGFP的细胞上清,浓缩并标定滴度,RT-PCR检测并鉴定。以最佳MOI值体外转染大鼠骨髓间充质干细胞,荧光显微镜观察转染是否成功,流式细胞仪检测转染效率,RT-PCR和Westernblot检测转染细胞LMP-1基因的表达。结果：①基因测序及RT-PCR检测证实携带人LMP-1基因的慢病毒载体构建成功,包装后获得滴度为2×10^8 TU／ml的LV-LMP-1-EGFP。②以MOI=100转染大鼠骨髓间充质干细胞,荧光显微镜下可见大量绿色荧光蛋白表达,转染效率可达93．5％,经RT-PCR与Westernblot检测,被转染细胞内有LMP-1基因表达。结论：成功构建携带人LMP-1基因的慢病毒载体,可高效转染大鼠骨髓间充质干细胞,被转染细胞可高效表达LMP-1基因。     

人色素上皮衍生因子慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的构建人色素上皮衍生因子(human pigment epithelium-derived factor,hPEDF)慢病毒载体,包装过表达PEDF的慢病毒,构建过表达PEDF的人角质形成细胞(human keratinocyte, Ha Ca T)的细胞株。方法将PEDF基因插入慢病毒载体p LVX-IRES-puro,构建p LVX-IRES-puro-PEDF慢病毒重组质粒并转染293T细胞,包装获得病毒上清,进行病毒扩增,收集病毒上清液,测定扩增后的病毒滴度。扩增后的病毒上清液以最佳感染复数感染体外培养的Ha Ca T细胞作为Ha Ca T-PEDF组(实验组),同时以含有空载体的慢病毒感染Ha Ca T细胞株作为Ha Ca T细胞组(对照组),扩增72 h后收集两组细胞及条件培养基,通过实时荧光定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)和蛋白质免疫印迹(western blot, WB)技术检测各组细胞PEDF基因m RNA以及蛋白的表达情况,通过酶联免疫吸附试验检测两组细胞PEDF蛋白分泌情况。结果经限制性内切酶酶切鉴定、Sanger测序证实,成功构建了携带PEDF基因的重组慢病毒表达载体,且包装的慢病毒滴度可达1×107pfu/ml。RT-PCR和WB检测结果显示,实验组细胞中PEDF的m RNA和蛋白均显著高于对照组(P0.05),并能分泌至细胞外。结论成功构建了表达PEDF基因的慢病毒载体,在体外培养条件下可以成功感染Ha Ca T细胞,并高表达PEDF蛋白。     

稳定沉默Rictor表达的前列腺癌CWR22RV1的构建

目的 应用RNA沉默技术下调前列腺癌CWR22RV1细胞株的Rictor基因表达,并筛选具有稳定转染Rictor-shRNA的细胞株,为进一步研究Rictor在前列腺癌中的作用打下基础.方法 针对Rictor基因设计合成siRNA序列;鉴定、测序并转染293T细胞观察基因表达情况;构建Rictor-shRNA慢病毒载体;进行Rictor-shRNA慢病毒包装及滴度测定;筛选稳定表达Rictor-shRNA的前列腺癌CWR22RV1细胞株;Western blot检测稳定转染前列腺癌CWR22RV1细胞株Rictor的表达水平.结果 Rictor-shRNA慢病毒成功包装后转染前列腺癌CWR22RV1细胞,进行嘌呤霉素筛选,获得沉默Rictor基因的前列腺癌CWR22RV1细胞株,Western blot检测显示该细胞株Rictor水平明显降低(P＜0.01).结论 成功构建了稳定沉默Rictor表达的前列腺癌CWR22RV1细胞株,为后续的实验了打下坚实的基础.     

尾型同源盒转录因子2 shRNA慢病毒表达载体的构建及其转染对结肠癌细胞生长的影响

目的:构建尾型同源盒转录因子2(CDX2)shRNA慢病毒表达载体,并观察下调CDX2基因其对结肠癌细胞生长的影响。方法:根据CDX2 m RNA序列设计shRNA,并合成shRNA的互补序列,通过连接酶链接到GV248载体上,用测序方法鉴定阳性克隆后,将构建好的慢病毒表达载体与慢病毒包装载体用Lpofectamine 2000共转染293T细胞,产生慢病毒颗粒并用稀释法进行滴度测定。将CDX2 shRNA慢病毒表达载体转染人结肠癌细胞SW480、HT29后,分别用q RT-PCR和Western blot检测CDX2 m RNA及蛋白水平,CCK8实验及克隆形成实验检测细胞增殖能力。结果:DNA测序鉴定证实,CDX2 shRNA表达片段正确插入GV248载体中,包装后的病毒滴度为1×109TU/m L;SW480、HT29细胞转染CDX2-shRNA慢病毒表达载体后,CDX2 mRNA及蛋白表达水平均明显降低(均P0.05),但细胞的增殖与克隆形成能力无明显改变(均P0.05)。结论:成功构建shRNA慢病毒表达载体,其转染结肠癌细胞后能有效地抑制CDX2基因的表达;下调CDX2基因对人结肠癌细胞的增殖无明显影响。     

靶向人VEGF165的SiRNA慢病毒的构建和鉴定

目的：构建靶向VEGF基因的SiRNA慢病毒载体,并包装病毒。方法：针对已经筛选确定的SiRNA有效靶序列,合成靶序列的OligoDNA,经双酶切后与PGC SIL-GFP慢病毒载体连接,构建慢病毒载体PGCSIL-SiVEGF,以293T细胞包装得到干扰病毒LV-SiVEGF,根据细胞表达绿色荧光蛋白水平计算病毒滴度;病毒感染人脐静脉内皮细胞HUVEC,通过定量RT-PCR检测VEGF的mRNA表达。结果：测序结果表明,靶向人VEGF的SiRNA慢病毒载体构建成功,包装后的慢病毒滴度为2×109 ifu/μl;感染HUVEC细胞后,实验组和对照组相比VEGF mRNA表达水平显著降低。结论：成功构建人VEGF SiRNA慢病毒LV-SiVEGF。     

人生长因子受体结合蛋白2相关的接头蛋白1基因重组慢病毒RNA干扰载体的构建及鉴定

目的 探讨构建人类生长因子受体结合蛋白2相关的接头蛋白1(Gab1)基因重组慢病毒RNA干扰载体的方法,研究其对人脐静脉血管内皮细胞株EA.hy926的沉默效率.方法 针对人类Gab1基因设计5个靶点的小干扰RNA (siRNA)序列,并分别合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Hpa I和Xho I限制性内切酶双酶切后的GV118载体连接,产生Gab1-RNA干扰(RNAi)转化子,聚合酶链反应(PCR)筛选阳性克隆并进行测序鉴定.将测序正确的Gab1-RNAi、pHelper 1.0和pHelper 2.0质粒共转染239T细胞,包装产生LV-Gab1-RNAi慢病毒并测定其滴度.将获得的慢病毒分别转染EA.hy926细胞,通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,测定其转染效率;通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染后的EA.hy926细胞中Gab1 mRNA表达水平来验证慢病毒干扰载体的基因沉默效率.结果 经PCR分析和测序证实,成功构建LV-Gab1-RNAi慢病毒载体;病毒滴度为3×109 TU/ml;荧光显微镜下转染组细胞GFP荧光表达强烈,转染效率达70％以上;RT-PCR证实干扰组细胞Gab1 mRNA表达水平(0.088 ±0.003)较对照(0.947±0.087)组和空白组(0.999±0.067)显著降低(P＜0.01).结论 成功构建人Gab1基因RNAi慢病毒载体并能在293T细胞中扩增获得足够的病毒滴度,能明显抑制Gab1基因在EA.hy926细胞株中的表达.     

人PPFP基因的重组慢病毒载体的构建和表达

目的 构建含人PAX8/PPARγ/融合基因(PPFP)基因重组慢病毒载体并检测其表达性能.方法 从已构建好的含PPFP的质粒克降模板PEGFP-C-PPFP中,利用聚合酶链反应(PCR)方法钓取目的 基因PPFP,将该基因克隆到慢病毒载体表达质粒pGC-FU(含Flag基因)中,得到重组的pGC-FU-PPFP,通过PCR、酶切、测序和分析比对验证PPFP基因后,将pGC-FU-PPFP质粒和包装质粒pHelper1.0、pHelper2.0共同转染人胚胎肾上皮细胞株293T细胞,获得携带PPFP基因和Flag基因的重组慢病毒,收集并浓缩病毒上清液,测定重组病毒的滴度.通过Western blot鉴定PPFP-Flag融合蛋白在靶细胞内的表达进一步验证目的 基因在靶细胞中的表达.结果 经PCR扩增获得2591 bp的目的 基因片段,构建的重组质粒经PCR、酶切及测序和分析比对鉴定正确;该质粒与包装质粒共转染293T细胞获取的慢病毒滴度达3.5×10~7转导单位TU/ml;感染的293T细胞,Western blot结果显示条带大小为90 KDr,可判断目的 基因PPFP在293T细胞中表达.结论 成功构建PPFP基因慢病毒载体质粒pGC-FU-PPFP,并建立慢病毒过表达系统.     

过表达人SLC2A9基因的慢病毒载体对HK-2细胞尿酸转运功能的影响

目的构建含人SLC2A9基因的过表达慢病毒载体,探讨其对人肾脏近曲小管上皮细胞株HK-2尿酸转运功能的影响。方法 PCR反应扩增目的基因后连入慢病毒表达载体中构建重组载体pLEX-SLC2A9,使用PCR及测序的方法对其进行鉴定,并与辅助包装质粒共感染293T细胞。慢病毒颗粒感染HK-2细胞后,用PCR和Western blot检测SLC2A9基因的过表达效率,并检测SLC2A9过表达对其尿酸转运功能的影响。结果 PCR及测序结果表明重组慢病毒载体pLEX-SLC2A9的插入序列完全正确,重组慢病毒载体感染HK-2细胞后,细胞内的mRNA及蛋白水平增高,并且可以增强HK-2细胞对尿酸的转运。结论过表达SLC2A9基因后能显著增强HK-2细胞对尿酸的转运。     

靶向STAT3的慢病毒表达载体的构建及其对血管平滑肌细胞增殖凋亡的影响

目的 构建大鼠STAT3基因的shRNA慢病毒表达载体,并观察其对大鼠血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响.方法 针对STAT3基因的不同部位设计4对shRNA的寡核苷酸片段,克隆到慢病毒载体PLKO.1中,构建靶向STAT3基因的慢病毒载体PLK0.1-STAT3-shRNA,检测并筛选最佳抑制效率的shRNA干扰载体.并将其转染大鼠血管平滑肌细胞,用噻唑蓝法和流式细胞仪检测沉默STAT3基因后对血管平滑肌细胞增殖和凋亡能力的影响.结果　靶向STAT3慢病毒表达载体构建成功.转染PLKO.1-STAT3-shRNA后,STAT3蛋白表达明显下降,其中以PLKO.1-STAT3-S1最为明显,达到90%以上;转染PLKO.1-STAT3-S1的细胞增殖能力(A值=0.25±0.05)明显低于未转染组(A值=0.62±0.12)和阴性对照组细胞(A值=0.59±0.11)(P＜0.05);而早期细胞凋亡率(26.9±2.8)%和晚期细胞凋亡率(9.5±1.6)%均明显高于未转染组和阴性对照组(P＜0.01).结论　成功构建并筛选最佳抑制效率的靶向STAT3慢病毒表达载体PLKO.1-STAT3-S1,该载体能有效抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖,并促进细胞凋亡.

Abstract：

Objective To construct a recombinant short hairpin RNA (shRNA) lentiviral vector carrying STAT3 gene in rats, and to investigate its effects on proliferation and apoptosis of vascular smooth muscle cells by silencing STAT3. Methods Four oligonucleotides targeting STAT3 gene were synthesized and cloned into lentivirus vector PLKO. 1. The shRNA lentiviral vector with best transfection efficiency was detected and identified, which was transfected into vascular smooth muscle cells in rats, and its effects on proliferation and apoptosis of vascular smooth muscle cells were measured by MTT and flow cytometry after silencing STAT3. Results The recombinant lentivirus vector PLKO. 1-STAT3-shRNA was constructed successfully. PLKO. 1-STAT3-shRNA knocked down the expression of STAT3 protein dramatically, especially PLKO. 1-STAT3-S1, whose transfection efficiency was more than 90%. The proliferation capacity of vascular smooth muscle cells transfected with PLKO. 1-STAT3-S1 (A value =0. 25 ±0. 05 ) was significantly lower than no-transfected group (A value =0. 62 ±0. 12) and negative control group (A value =0. 59 ±0. 11 )(P ＜ 0. 05). Meantime the early apoptosis rate (26. 9 ± 2. 8 ) % and late apoptosis rate (9. 5 ± 1.6 ) % in PLKO. 1-STAT3-shRNA-transfected group were significantly higher than in no-transfected group and negative control group (P ＜ 0. 01 ). Conclusion The recombinant lentivirus shRNA vector targeting STAT3,PLKO. 1-STAT3-S1, with best transfection efficiency, is constructed successfully. PLKO. 1-STAT3-S1 can inhibit the proliferation of vascular smooth muscle cells, and promote the cell apoptosis. This study lays the foundation for further studying on targeting treatment of vascular restenosis.     

FOXP3 shRNA3对肝癌细胞趋化因子及受体CXCL12、CXCL11、CXCR4、CXCR7作用的研究

目的研究FOXP3 shRNA对肝癌细胞株SMMC-7721和MHCC-97H的趋化因子及受体CXCL12、CXCL11、CXCR4、CXCR7的影响。方法设计三种编码FOXP3 shRNA的FOXP3干扰慢病毒,sh-FOXP3-1-pGreenPuro、sh-FOXP3-2-pGreenPuro和sh-FOXP3-pgreenpuro并分别转染SMMC-7721和MHCC-97H细胞。q-PCR检测各组CXCL12、CXCL11、CXCR4、CXCR7 mRNA的表达情况;Western Blot检测各组CXCL12、CXCL11、CXCR4、CXCR7蛋白的表达情况。结果经菌落PCR和测序验证证明三个FOXP3干扰慢病毒载体构建正确;三种干扰序列中sh-FOXP3-1干扰效果最明显,因此后期实验都使用sh-FOXP3-1进行下面的实验。研究显示:(1)与对照组相比,sh-FOXP3-1组的CXCL12、CXCL11、CXCR4、CXCR7 mRNA表达明显下降,差异具有统计学意义。(2)与对照组相比,sh-FOXP3-1组的CXCL12、CXCL11、CXCR4、CXCR7蛋白表达明显下降,差异具有统计学意义。结论干扰FOXP3的表达后,能减少趋化因子CXCL12、CXCL11、CXCR4、CXCR7的表达。     

PIAS-NY稳定转染小鼠精母细胞株的构建与鉴定

目的:构建PIAS-NY基因慢病毒质粒,并将包装所得慢病毒感染小鼠精母细胞,获得稳定过表达PIAS-NY的细胞株。方法:应用PCR技术扩增目的基因,并将扩增产物插入慢病毒载体质粒pGC-FU上,对阳性克隆进行PCR筛选及测序鉴定。将重组质粒与两种辅助包装原件载体质粒共转染293T细胞,获得含慢病毒颗粒的细胞上清,用慢病毒感染小鼠精母细胞,并用Western印迹方法检测细胞中PIAS-NY蛋白的表达。结果:成功构建了pGC-FU-PIAS-NY慢病毒表达质粒,获得了稳定过表达PIAS-NY的小鼠精母细胞株。结论:PIAS-NY过表达慢病毒质粒及稳定转染小鼠精母细胞株的构建,为进一步体外研究PIAS-NY基因在精子发生中的功能奠定了基础。     

c-myc基因慢病毒载体的构建及其意义

目的 构建携带c-myc基因野生型及T58A突变型的慢病毒载体.方法 应用聚合酶链反应(PCR)方法 扩增c-myc野生型及T58A突变型基因,利用Gateway技术构建携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的慢病毒载体,经PCR及基因测序鉴定后,转染293FT包装细胞,产生相应慢病毒,测定其滴度.结果 PCR和测序证实,构建分别携带c-myc野生型及T58A突变型基因的慢病毒载体,并包装慢病毒,病毒滴度测定结果　分别为6.10 × 107、5.65×107 TU/ml.结论　成功构建含有c-myc野生型及T58A突变型基因的慢病毒载体并包装出具高效感染力的慢病毒颗粒.

Abstract：

Objective To construct a lentiviral vector with c-myc gene, including wild type and mutation type. Methods The lentiviral vector with green fluorescent protein (GFP) was constructed by polymerase chain reaction (PCR) and gateway technology and identified by PCR and gene sequencing,then transfecte dinto the package cells 293FT by lipofectin to produce mature lentivirus. The virus titer was measured. Results According to PCR and gene sequencing, the myc-lentiviral vectors were successfully constructed with the virus titer being 6. 10 × 107 ( wild type) and 5.65 × 107 ( mutation type) TU/ml, respectively. Conclusion The myc-lentiviral vector was successfully constructed and efficient lentivirus particles were packaged.     

免疫基因CD1d和绿色荧光蛋白融合基因慢病毒载体的构建

目的:构建人免疫基因CD1d与绿色荧光蛋白(GFP)融合基因慢病毒载体。方法:实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增获得CD1d的全外显子片段,使之克隆到带GFP荧光报告基因慢病毒表达载体质粒中,慢病毒包装质粒和穿梭质粒转染293T细胞,包装成功后收集上清,浓缩,鉴定。取浓缩纯化后的病毒上清感染293T细胞,荧光显微镜观察荧光表达。结果:电泳鉴定结果与目的基因表达条带完全吻合,克隆测序结果与NCBI收录的CD1d基因序列完全一致。重组慢病毒质粒可高效转染293T细胞,荧光显微镜下可观察到大量绿色荧光。结论:成功构建了CD1d与GFP融合基因慢病毒表达载体,为进一步研究CD1d基因的相关功能提供了适合的稳定转染载体。