中药DNA条形码分子鉴定技术的应用与展望

中药材品种广泛,存在多基原的情况,质量差异较大,使临床用药安全性和有效性难以得到保证。因传统中药鉴定方法的局限性,对准确鉴别多基原中药材带来了一定的挑战。为了保证中药临床用药安全有效可控,中药鉴定学已成为最重要的研究课题之一,也是当前中医药事业急需解决的关键技术要求。DNA基因鉴别是从基因层面对中药材进行快速、准确的鉴定,包括DNA分子标记法、核酸探针杂交法和DNA条形码技术,其中DNA条形码技术应用最为广泛。DNA条形码是利用标准的DNA片段对物种进行鉴定的技术,2015年版《中国药典》收载了DNA条形码技术指导原则,建立了动物类采用细胞色素C氧化酶亚基I(COI)序列为主,转录间隔区间(ITS)2为辅;植物类采用ITS2/ITS为主,叶绿体psb A-trn H为辅的中药材鉴定体系。该技术的广泛应用为中药鉴别提供更高效快速的方法,并且有效地应用于多基原中药材的鉴别中,使中药品种混乱现象得到极大改观。文章首先对DNA条形码技术的原理、目的及意义、标准片段的选择进行介绍,着重阐述该技术在中药鉴定中的应用以及存在的局限性,并提出展望,以期为中药材的鉴定研究提供参考。     

中药鼠妇虫品种考证及药材种类鉴定

目的:厘清鼠妇虫药材基原品种,考察市场中药材样品种类及混淆状况。方法:通过对鼠妇虫古籍文献、近代专著及标准收载情况进行整理,对鼠妇虫药材基原、历史沿革及品种进行考证;采用形态学鉴定方法对所收集鼠妇虫药材样本种类进行鉴定。结果:文献、标准记载的鼠妇虫药材基原品种主要为卷甲虫科动物普通卷甲虫和鼠妇科动物粗糙鼠妇;10批次药材样品中均含有多个种类来源,其中光滑鼠妇、普通卷甲虫占比最高,粗糙鼠妇仅占较少比例,其比例分别为47.4%、40.7%、6.9%。结论:鼠妇虫药材样品种类与基原品种存在差异,研究结果为开展鼠妇虫药材质量控制与评价提供了依据。     

基于1H-NMR和主成分分析法分类鉴别秦艽药材

目的:以多基原药材秦艽为研究对象,应用核磁共振氢谱(1H-NMR)和主成分分析方法(PCA)鉴别不同来源秦艽药材。方法:将5种不同秦艽药材在相同条件下进行溶剂提取,采用核磁共振波谱仪进行检测,图谱进行数据处理、聚类分析和PCA。结果:通过聚类分析可很好地区分5种秦艽药材;在PCA中提取了6个主成分,累计贡献率达98.9%,前2个主成分累积贡献率达76.9%,能解释原变量信息的76.9%,在以主成分1和主成分2为横纵坐标的得分散点图上实现了不同基原秦艽药材的区分。结论:1H-NMR结合PCA是一种有效的药材资源鉴别研究方法,能全面反映不同基原药材的全成分且前处理方便,可作为分类鉴别不同来源药材的手段之一。     

大黄产业链基原物种鉴定研究进展

大黄是传统常用中药材,市场需求较大,过度采挖使野生大黄几近濒危,市售大黄药材及饮片掺伪现象较严重。该文对近十年大黄产业链基原物种鉴定研究进行综述,展示其性状及显微鉴定特征,介绍以蒽醌类成分为主的理化分析和基于DNA条形码鉴定的研究成果,阐述大黄基原植物鉴定新突破。据此,总结大黄产业链基原物种鉴定技术路线,包括对大黄种子种苗进行DNA条形码鉴定保证源头正确、基于叶绿体基因组筛选高变位点来鉴定大黄基原植物、利用中药材二维DNA条形码监管体系对大黄药材及饮片来源进行监控、采用三代测序等新技术的中成药生物组分溯源体系等,将分子鉴定与传统鉴定方法联用,为大黄产业链基原物种鉴定研究提供新思路,对中药大黄安全性与有效性研究具有指导意义。     

半夏及其混伪品的鉴定方法研究进展

半夏作为一种常用中药材,具有燥湿化痰、清痞散结等功效。通过收集国内外相关研究资料,综述了近年来半夏及其混伪品鉴定方面的研究成果。DNA条形码技术在中药材基源植物及药材鉴定方面表现出极强的潜力,为此阐述了传统鉴定手段和现代分子生物学技术应用于半夏及其混伪品的最新研究进展;同时对各方法的优缺点及实用性进行了总结,以期为中药材的快速准确鉴定及质量控制提供一定的研究思路。     

基于ITS2序列鉴别中药材钩藤及其同属近缘混伪品

目的应用ITS2序列鉴定多基原药材钩藤及其同属近缘混伪品,确保临床用药准确、安全。方法收集钩藤药材基原物种实验材料16份,采用改良后的CTAB法提取总DNA,通过PCR扩增、测序、序列拼接和注释后获得各自的ITS2序列并进行相似性比对验证,结合NCBI下载的同属相关物种ITS2序列64条,基于MEGA 6.0进行序列分析,比较钩藤药材各基原物种的序列差异,计算种内及种间Kimura 2-Parameter(K2P)距离,以邻接(NJ)法构建系统发育树。综合应用相似性搜索法、最近距离法以及NJ树对钩藤药材及同属混伪品进行鉴定分析。结果钩藤药材各基原物种ITS2序列长度为220-221 bp,各基原物种种内最大K2P距离均小于与同属其他物种的种间最小K2P距离,系统NJ树不仅能准确将钩藤药材基原物种区分开,更能将该属在我国分布的绝大多数物种区分开。结论该研究建立了基于ITS2序列的多基原药材钩藤DNA条形码鉴定技术方法,能够成功用于钩藤药材真伪鉴定,为临床准确用药提供依据。     

石斛属优质道地药材生产技术概述

石斛是我国传统常用贵细中药材,市场需求量巨大,在野生资源日趋枯竭的情况下已经成功完成了野生变家种,为市场供应了大量的药材。但是,在种植技术发展的同时,一直存在着种质混乱、农药残留及重金属含量超标等问题,导致药材品质差异大,难以满足用药需求。明确基原及使用品种、规范栽培技术是解决该问题的有效手段,同时也是现阶段中药材种植产业的发展方向。通过汇总已有成熟技术及研究结果、梳理主要的石斛属药用植物的栽培技术体系（包括选址、良种繁育、科学种植及有效的病虫害防治技术等）,为指导石斛属药用植物种植、生产优质石斛药材提供参考。     

金头蜈蚣的本草考证及真伪鉴别研究

通过查阅历代本草、医籍、方书和近现代文献资料,对蜈蚣药材的名称、基原、道地性、品质评价、采收时间、炮制方法、真伪鉴别等进行系统梳理与考证,为蜈蚣药材的鉴别研究、炮制加工和临床安全用药提供参考。蜈蚣的药用价值始载于《神农本草经》。据考证,历代医家所用蜈蚣的主流基原均以红头红足蜈蚣(金头蜈蚣S.subspinipes mutilans L.Koch)作为优质蜈蚣药材的评价标准。蜈蚣资源分布广泛,主要产区为湖北、江苏、浙江,其中湖北产蜈蚣是市场上蜈蚣药材的主要来源。蜈蚣的采收加工通常在春夏二季,用竹片插入头尾,绷直,干燥,历代炮制方法主要“随病法制”,现代炮制方法以火炙为主。蜈蚣药材因其地域及品种原因长期存在混用、伪用现象,利用现代研究技术可弥补传统药材鉴别方面的不足。基于考证,建议选取金头蜈蚣为基原,对蜈蚣药材及其复方进行研究与开发。     

多基原药材龙胆和秦艽化学成分和药理作用研究概况

龙胆属植物具有广泛的应用价值,其中龙胆与秦艽最为重要,这两种同属多基源药材,所含化学成分相似,但存在一定区别,化学成分的差异必将导致药理作用的不同。种质是影响药材质量的最主要因素,通过对龙胆与秦艽药材的资源分布、药用历史、化学成分和药理作用进行差异分析,发现从化学成分来说,獐芽菜苦苷和獐芽菜苷的含量无显著差异,主要差异成分为龙胆苦苷和马钱苷酸。龙胆类药材龙胆苦苷含量较高,秦艽药材马钱苷酸含量较高。龙胆中条叶龙胆的龙胆苦苷含量最高,比秦艽高25%～70%,三花龙胆和滇龙胆含量较低;大叶秦艽和粗茎秦艽马钱苷酸的含量较高,小秦艽含量最低。从药理作用来说,龙胆主要药理作用为保肝;秦艽抗炎作用显著好于龙胆,但镇痛作用较龙胆差。龙胆和秦艽药理作用基本相同,药效作用存在差异。龙胆四种基原中条叶龙胆质量较佳,秦艽四种基原中大叶秦艽和粗茎秦艽品质较佳,而三花龙胆、滇龙胆及麻花秦艽、小秦艽品质较差。     

特异性PCR鉴别蜈蚣及其混伪品

目的:蜈蚣是我国传统的中药材,具有良好的药用价值。目前市场上蜈蚣的混伪品日益增多,临床用药的安全性和有效性难以保证。该研究建立了一种蜈蚣基原物种的特异性聚合酶链式反应(PCR)方法,以准确、简便的鉴别蜈蚣及其常见混伪品。方法:通过比较蜈蚣及其混伪品基原物种的COI基因序列差异,根据变异位点设计蜈蚣正品少棘巨蜈蚣的特异性鉴别引物WG-500.F和WG-500.R,采集蜈蚣原动物样本及药材样本,优化反应体系并对此方法进行耐受性和适用性的考察和验证。结果:少棘巨蜈蚣原动物样本及蜈蚣正品药材使用设计的蜈蚣鉴别引物经PCR扩增和凝胶电泳后出约500 bp的单一明亮条带,其他混伪品如多棘蜈蚣、模棘蜈蚣、哈氏蜈蚣、海南蜈蚣等均无条带出现。结论:PCR鉴别方法可准确鉴别蜈蚣原动物和药材的真伪,具有高度特异性,为中药材蜈蚣的真伪鉴别提供了良好的科学依据。该方法具有简单、直观等特点,有利于广泛的普及与应用,在中药材鉴定方面有着广阔的应用前景。     

中药材秦艽的X衍射图谱分析

为鉴别秦艽类中药材，本文应用粉末X衍射分析技术测定了8个样品的X衍射图谱，获得了秦艽类药材鉴别的特征标记峰与衍射模糊图形，结果表明各药材的衍射图不仅各具特征性，而且有较好的重现性。X衍射图谱对于性状与组织结构相似，化学成分相近的中药材的鉴别具有重要意义。可望作为中药材指纹图谱的方法之一。     

甘肃产秦艽的DNA指纹图谱鉴别

目的 对产于我国甘肃省的中药秦艽的3种基源植物秦艽、麻花秦艽与小秦艽进行RAPD分析,建立具有鉴别意义的DNA指纹图谱.方法 采用RAPD分子标记对秦艽的基因组DNA进行PCR扩增,利用NTSYSpc 2.1和Popgene 3.2软件分析3种秦艽间的亲缘关系,构建树系图.结果 从80条RAPD引物中筛选出4条具有鉴别意义的多态性引物,在3种秦艽中共得到39个DNA条带,其中共有条带2条,多态条带37条.据此获得了能有效区别3种秦艽的多态性RAPD指纹谱.结论 甘肃产秦艽的3种基源植物遗传分化明显,RAPD方法能有效地将它们区分鉴别.     

秦艽化学成分及药理活性研究进展

秦艽Gentianae Macrophyllae Radix是我国重要的常用传统中药品种之一,其资源丰富,成分多样,作用广泛,具有极大的药用价值。目前发现秦艽药材中化学成分主要有环烯醚萜类、三萜、木脂素、黄酮、生物碱、甾体、多糖等类型成分,药理作用主要有抗炎、镇痛、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、免疫调节、保护肝脏、抗氧化等药理活性。通过检索近20年国内外相关文献,对秦艽的成分和药理活性进行综述,旨在探究对秦艽成分和药理的客观认识,为其临床合理用药和质量评价等提供参考。     

中药龙胆的本草考证

中药龙胆药用历史悠久,早在《神农本草经》中就有记载,别名有陵游、草龙胆等,该文针对历代本草记载龙胆品种较为混乱,亦混有当地习用非龙胆科植物的现状,在系统查阅龙胆古今文献的基础上,通过分析历代本草书籍,对其名称、基源、产地分布、道地产区、采收时间及炮制方法进行全面考证。通过分析各类本草书籍中对龙胆的形态描述及附图,得出古代龙胆基原与今日龙胆药材原植物中的龙胆Gentiana scabra与条叶龙胆G. manshurica基本相符的结论,整理了各文献中出现的龙胆药材原植物的拉丁学名;龙胆的商品分为关龙胆和滇龙胆,其中关龙胆包括龙胆G. scabra,条叶龙胆G. manshurica与三花龙胆G. triflora.,现主产于东北;滇龙胆G. rigescens产自云南;由于历史变迁等各种原因,关龙胆的道地产区由江浙一带变为东北一带;龙胆炮制方法有酒炙、甘草汁炙、生姜汁炙等,目的皆为抑制其苦寒之性,其中酒炙龙胆历史最为悠久,并可促进龙胆有效成分的溶出,为较好的炮制方法。该研究为龙胆的正本清源、资源开发、正确使用、道地产区及炮制方法确定等提供了依据。     

陕西产秦艽质量变异与遗传多样性研究

目的研究陕西省不同产地秦艽的质量差异,对其遗传多样性进行检测,探讨药材质量和其遗传基础的关系。方法采用HPLC法测定不同产区秦艽药材中的指标成分,进行HPLC指纹图谱分析,计算并比较相似度。依据指纹图谱中的共有峰特征,对不同药材样品进行聚类分析。对药材中提取的总DNA进行RAPD分析,计算遗传距离并聚类。结果陕西省不同产区秦艽药材的质量具有一定的差异,不同产区秦艽药材也表现出一定的遗传多样性。陕西省不同产区的秦艽药材质量变异与遗传多样性之间不具有明显的相关性,而表现出与产地的相关性。结论产地对陕西秦艽药材质量的影响更为重要,提示道地秦艽质量的形成可能属于生境主导型。     

基于多指标成分分析野生与栽培秦艽药材商品规格等级

利用超高效液相色谱法测定秦艽药材所含7种主要化学成分的含量,通过典型对应分析和Fisher判别分析等现代统计学方法对药材化学指标进行聚类,划分质量等级,再结合相关性分析筛选药材品质指标,对野生和栽培秦艽药材不同商品规格和同一商品规格不同等级的药材质量进行综合定量化等级划分,为秦艽药材商品规格等级的合理划分提供依据。最终明确了以龙胆苦苷、马钱苷酸、獐牙菜苦苷等为主要指标成分的质量评价范围,并引入了中药材质量等级判别指数(herbal quality index,简称HQI),通过Fisher判别分析建立了基于药材品质的等级判别函数。经过分析,无论野生、栽培,萝卜艽质优、麻花艽质良、小秦艽质差。同一规格不同等级间,栽培萝卜艽一等质差、二等质良、三等质优;野生萝卜艽一等质良、二等质优;麻花艽一等质优、二等质良;小秦艽一等质良、二等质优,但均不显著。该研究对秦艽药材品质的定量化评价提供了思路和方法。     

不同提取方法对秦艽2种苦苷成分含量的影响

目的探讨不同提取方法对秦艽中獐牙菜苦苷和龙胆苦苷含量测定的影响。方法采用HPLC法,比较甲醇超声提取法、甲醇索氏提取法、药典法(2005版药典秦艽项下方法)三种提取方法对2种苦苷成分含量测定结果的影响。结果甲醇超声提取法优于其它二种方法。结论甲醇超声提取法操作简便易行,重现性好,准确度高,为科学控制秦艽质量提供一个可靠的方法。     

秦艽化学成分和药理作用研究进展及质量标志物(Q-marker)的预测分析

秦艽是我国传统的中药材,功效独特且资源丰富,在我国西北地区分布较为广泛。秦艽中含有多种化学成分,主要有环烯醚萜类、木脂素类、黄酮类、三萜类、生物碱类等成分,具有抗炎镇痛、保肝、抗病毒、抗肿瘤、免疫抑制、降压等活性。由于其化学成分种类多样且药理活性广泛,可作为一种极具开发利用价值的药用植物。随着秦艽资源需求大增,野生秦艽资源极度萎缩,且秦艽药用基原众多、药用部位各异造成药材来源混杂,造成药用成分不稳定及市场混乱,质量标准亟待提高。在对秦艽资源现状、化学成分及药理作用分析的基础上,结合质量标志物的概念,从化学成分与传统药性、传统功效、临床疗效、不同配伍等多方面对秦艽质量标志物进行预测分析,为秦艽质量评价体系的建立提供参考。     

秦艽药材的品质区划研究

通过文献查阅,明确中药秦艽分布信息,实地采集秦艽药材79份。基于采样信息,利用秦艽药材指标成分和环境因子之间的回归模型,结合MaxEnt对生态适宜区的预测结果和指标成分的主成分分析结果,应用ArcGIS的空间分析功能对秦艽药材的品质进行空间分布估算。结果显示,陕西南部、甘肃南部、四川中部及西藏东南部秦艽药材综合品质较高。研究结果与秦艽药材的产区一致,可以为秦艽资源保护、开发和利用提供参考依据。