肠道病毒71型VP1基因及蛋白结构与功能的生物信息学分析

目的 分析肠道病毒71型(EV71)VP1基因及其编码蛋白的结构与功能,以指导其生物学功能研究.方法 利用多种生物信息在线分析工具和分析软件包分析EV71 2008-GZCH07株VP1基因及编码蛋白与其他EV71代表株的序列,进行多序列同源比对,并构建分子进化树.预测该基因编码的蛋白质理化特性,二级结构、三维结构等结构特性,酶学特性和抗原表位等免疫学特性.结果 2008-GZCH07株与ZJ001株同源性最高(97%和98%),与人柯萨奇病毒A16同源性最低,与EV71 A、B、C型病毒的同源性为86%～98%.2008-GZCH07株与ZJ001株和 BJ08-Z025-5株的进化距离较近,属于C4亚型;A、B、C三型EV71的VP1编码蛋白中,2008-GZCH07株VP1编码蛋白与B、C型进化距离较A型近.VP1基因全长510 bp,开放读码框位于116～510 bp区域,编码132个氨基酸,等电点为4.39.VP1蛋白富含α螺旋和无规卷曲,无跨膜区域,含5个高疏水性区域,属于胞外蛋白.蛋白质同源建模分析表明该区域位于蛋白表面,形成环状结构,含有5个抗原簇,7个关键催化位点位于该区域内或其附近.结论 EV71-VP1基因编码蛋白分布有多个磷酸化位点,具有较多的生物功能位点和潜在的抗原表位区域,可能是免疫诊断、药物作用研究及疫苗研制的靶抗原,可为EV71诊断、治疗及预防方面的应用价值提供重要的参考依据.     

华支睾吸虫组织蛋白酶Cathepsin L1 样基因全长序列的克隆和生物信息学分析

目的预测华支睾吸虫全长cDNA质粒文库中cs002d09号EST序列的结构和功能特征及编码蛋白的应用前景。方法利用NCBI和ExPaSy等生物信息学网站在线分析工具和Vector NTIsuite及PcGene等软件包，分析华支睾吸虫全长cDNA质粒文库中cs002d09号EST序列及其编码蛋白的理化性质、结构与功能特征。结果BLASTx分析该ESF序列是组织蛋白酶Cathepsin L1的同源基因，全序列长为1458bp，包含完整的编码区80～1191，编码371个氨基酸，前18个氨基酸是分泌信号肽，蛋白的理化性质较稳定。该蛋白有2个空间构象相对独立功能域：N端的抑制功能域和C端的活性功能域，抑制功能域含有3个线性B细胞抗原表位，同源性较低；C端活性功能域同源性较高，Cys177，His318和Asn338组成催化中心，位于底物结合裂缝的底部。结论华支睾吸虫Cathepsin Ll基因与多个物种的Cathepsin L1基因同源，编码蛋白可能是重要的虫体分泌排泄抗原成分，在华支睾吸虫病的免疫诊断和疫苗研究方面有较好的应用前景。     

华支睾吸虫组织蛋白酶Cathepsin L1样基因全长序列的克隆和生物信息学分析

目的预测华支睾吸虫全长cDNA质粒文库中cs002d09号EST序列的结构和功能特征及编码蛋白的应用前景。方法利用NCBI和ExPaSy等生物信息学网站在线分析工具和Vector NTIsuite及PcGene等软件包，分析华支睾吸虫全长cDNA质粒文库中cs002d09号EST序列及其编码蛋白的理化性质、结构与功能特征。结果BLASTx分析该ESF序列是组织蛋白酶Cathepsin L1的同源基因，全序列长为1458bp，包含完整的编码区80～1191，编码371个氨基酸，前18个氨基酸是分泌信号肽，蛋白的理化性质较稳定。该蛋白有2个空间构象相对独立功能域：N端的抑制功能域和C端的活性功能域，抑制功能域含有3个线性B细胞抗原表位，同源性较低；C端活性功能域同源性较高，Cys177，His318和Asn338组成催化中心，位于底物结合裂缝的底部。结论华支睾吸虫Cathepsin Ll基因与多个物种的Cathepsin L1基因同源，编码蛋白可能是重要的虫体分泌排泄抗原成分，在华支睾吸虫病的免疫诊断和疫苗研究方面有较好的应用前景。     

5株内阿米巴14-3-3蛋白序列比较及生物信息学分析

目的 比较具有不同致病性以及毒力的5株内阿米巴的14-3-3蛋白序列,并选取溶组织内阿米巴HM1∶IMSS株进行相关生物信息学预测,用以指导进一步实验研究。方法 收集各虫株滋养体的基因组DNA,根据Gen-Bank收录的溶组织内阿米巴编码基因序列设计特异引物,以基因组DNA为模板扩增目的基因片段,测序后利用生物信息学网站的各种在线分析工具和Genetyx软件ver 13.0,对所得序列进行比较,构建分子进化树,并对溶组织内阿米巴HM1∶IMSS株的14-3-3蛋白进行相关的生物信息学分析。结果 5株内阿米巴属虫株均含有3个14-3-3基因,编码的氨基酸序列同源性较高,个别位点存在差异。取溶组织内阿米巴HM1∶IMSS株14-3-3-1序列与其他物种的同源蛋白比较并构建分子进化树,与种系进化过程非常吻合。根据生物信息学分析结果预测,溶组织内阿米巴HM1∶IMSS株14-3-3-1含720个碱基,编码239个氨基酸;14-3-3-2含717个碱基,编码238个氨基酸;14-3-3-3含723个碱基,编码240个氨基酸。3种异构体都带有2个14-3-3蛋白家族标记,含有多个潜在的磷酸化位点,但不含线粒体、过氧化物酶体等细胞器定位序列以及信号肽。该蛋白在大肠埃希菌中表达的半衰期〉10 h。结论 内阿米巴属14-3-3基因高度保守。生物信息学分析结果提示14-3-3蛋白是研究物种进化的理想分子。     

微小隐孢子虫LDH基因的克隆与序列分析

目的克隆微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum,Cp)南京株(NJ)乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)基因,测序并分析微小隐孢子虫NJ株CpLDH与其他隐孢子虫分离株LDH基因序列的差异。方法根据微小隐孢子虫已知LDH 基因序列设计合成2对引物, 应用巢式PCR 技术从微小隐孢子虫NJ株基因组DNA 中扩增LDH 基因, 并将其克隆到pMD18 T 载体上,阳性克隆的重组质粒经PCR及双酶切鉴定后, 用双脱氧链终止法对重组质粒中的插入序列进行测序,应用生物信息学方法分析 CpLDH 基因序列和其他物种LDH序列的同源性。结果巢式PCR 扩增得到特异的CpLDH 基因序列,经PCR及双酶切鉴定获得了正确的pMD18 T CpLDH 重组质粒。测序表明, NJ株微小隐孢子虫LDH 基因全长966 bp, 编码322个氨基酸,该基因序列已登录GenBank,登录号为 HM001298。序列分析表明, 我国微小隐孢子虫NJ株与国外分离的Iowa II株 LDH基因编码的氨基酸序列具有98%的同源性。结论成功克隆了微小隐孢子虫NJ株LDH 基因;序列测定及同源性分析表明, 微小隐孢子虫NJ株在LDH酶关键结构位点存在突变。     

乙型肝炎病毒前-S1蛋白结合蛋白小鼠同源基因的生物信息学分析

目的克隆、鉴定乙型肝炎病毒(HBV)前S1蛋白结合蛋白(PS1BP)小鼠同源基因,并进行初步的生物信息学分析。方法以克隆的人PS1BP基因序列作为参照,利用美国国立卫生研究院国立医学图书馆生物工程信启、学中心建立的的核苷酸数据库,以及在线核苷酸序列同源性比对分析软件BLASTn,与数据库中已经收录的小鼠cDNA序列进行比对,确定PS1BP小鼠同源基因,比较人和小鼠PS1BP的蛋白质一级结构序列的同源性。对小鼠PS1BP蛋白质一级结构的特点进行生物信息学分析,并确定小鼠PS1BP基因组DNA的结构特点。结果通过不同种属核营酸序列的同源性比对,确定小鼠PS1BP的cDNA由1455nt组成,编码产物由484aa组成。与人PS1BP蛋白质一级结构的同源性为84．92％(411／484)。对小鼠PS1BP蛋白一级结构序列进行生物信启、学分析,发现一系列潜在的蛋白修饰位点。以小鼠PS1BP的cDNA序列作为参照,对高通量基因序列数据库进行例源基因的搜索,发现小鼠的一段基因组DNA序列(AC117576．3)与之同源,进一步的分子结果表明,小鼠的PS1BP基因组DNA含有3段外显子序列,2段内含子序列。结论确定了小鼠PS1BP基因序列,为进一步研究其功能和生物学作用奠定了基础。     

鸭坦布苏病毒甲基转移酶的序列分析和结构预测

为了确定鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus,DTMUV)发挥甲基转移酶(methyltransferase,MTase)功能的氨基酸序列。本研究运用生物信息学方法,以已知的黄病毒MTase的序列和结构为模板,对GenBank上注入的DTMUV MTase序列进行同源比对分析和结构预测。分析结果表明,DTMUV MTase与WNV,DENV-2,JEV三种病毒MTase的核酸序列同源性分别为64.76%,64.55%,67.33%,氨基酸序列同源性分别为74.71%,68.45%,75.15%;其可能结构含有SAM结合位点且具有典型的4个α螺旋和7个β折叠的黄病毒MTase的结构特点;同时,DTMUV MTase序列上存在黄病毒MTase经典保守位点K-D-K-E;从而为确定DTMUV MTase属于黄病毒MTase家族成员提供一些理论依据。     

细粒棘球绦虫CD151蛋白的生物信息学分析及其编码基因在不同发育阶段的表达北大核心CSCD

目的分析细粒棘球绦虫四跨膜蛋白家族成员CD151(Eg-CD151)分子特性和各发育阶段表达水平,为研发包虫病疫苗奠定基础。方法从NCBI数据库下载Eg-CD151氨基酸序列,利用ProtParam、NetPhos 3.1 Server、GPS-SUMO 2.0、Euk-mPLoc 2.0、SOPMA、SWISS MODEL、SignalP 4.1 Server、TMHMM、SMART、Antibody Epitope Prediction在线生物信息学软件预测Eg-CD151蛋白的理化性质、磷酸化位点、棕榈酰化修饰位点、亚细胞定位、二级结构、三维结构、跨膜区域、结构域、B细胞抗原表位;利用DNAMAN和MEGA进行同源序列分析并建立系统发育进化树。利用实时荧光定量PCR检测不同发育阶段Eg-CD151 mRNA相对表达量。结果Eg-CD151蛋白由170 aa组成,为一种不稳定的跨膜蛋白,无信号肽,含2个跨膜区,分别位于6-28、136-158 aa,3个B细胞抗原表位位于非跨膜区域;存在14个磷酸化位点,包含3个酪氨酸磷酸化位点、5个苏氨酸磷酸化位点、6个丝氨酸磷酸化位点;含一个棕榈酰化位点(139-143 aa);二级结构主要为α-螺旋,占60.00%。同源序列比对显示,Eg-CD151与其终末宿主犬、赤狐及中间宿主牛的CD151进化关系较远。实时荧光定量PCR检测原头蚴、成虫两个发育阶段Eg-CD151 mRNA相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)。结论生物信息学分析Eg-CD151存在多个B细胞抗原表位,可作为包虫病诊断及疫苗候选抗原。     

间日疟原虫海南分离株乳酸脱氢酶基因的克隆与序列分析

用PCR扩增间日疟原虫海南分离株基因组DNA中乳酸脱氢酶(LDH)全长基因,命名为PvLDH/HN(GenBank登录号为FJ527750)。生物信息学分析表明,PvLDH/HN全长951bp,编码316个氨基酸残基,与间日疟原虫SalvadorI株、Belem株LDH等分离株核苷酸序列同源性均为99.89%(950/951),氨基酸序列同源性均为100%(316/316)。拓扑结构分析显示,该蛋白具有2个α螺旋跨膜区域,可能是膜蛋白。三级结构模型显示主要抗原表位82～95aa位于蛋白表面,构成特异性底物结合环,提示该位点是可能的药物作用靶点及免疫诊断抗原表位。     

细粒棘球绦虫CD151蛋白的生物信息学分析及其编码基因在不同发育阶段的表达

目的分析细粒棘球绦虫四跨膜蛋白家族成员CD151(Eg-CD151)分子特性和各发育阶段表达水平,为研发包虫病疫苗奠定基础。方法从NCBI数据库下载Eg-CD151氨基酸序列,利用ProtParam、NetPhos 3.1 Server、GPS-SUMO 2.0、Euk-mPLoc 2.0、SOPMA、SWISS MODEL、SignalP 4.1 Server、TMHMM、SMART、Antibody Epitope Prediction在线生物信息学软件预测Eg-CD151蛋白的理化性质、磷酸化位点、棕榈酰化修饰位点、亚细胞定位、二级结构、三维结构、跨膜区域、结构域、B细胞抗原表位;利用DNAMAN和MEGA进行同源序列分析并建立系统发育进化树。利用实时荧光定量PCR检测不同发育阶段Eg-CD151 mRNA相对表达量。结果 Eg-CD151蛋白由170 aa组成,为一种不稳定的跨膜蛋白,无信号肽,含2个跨膜区,分别位于6-28、136-158 aa, 3个B细胞抗原表位位于非跨膜区域;存在14个磷酸化位点,包含3个酪氨酸磷酸化位点、5个苏氨酸磷酸化位点、6个丝氨酸磷酸化位点;含一个棕榈酰化位点(139-143 aa);二级结构主要为α-螺旋,占60.00%。同源序列比对显示,Eg-CD151与其终末宿主犬、赤狐及中间宿主牛的CD151进化关系较远。实时荧光定量PCR检测原头蚴、成虫两个发育阶段Eg-CD151 mRNA相对表达量差异无统计学意义(P0.05)。结论生物信息学分析Eg-CD151存在多个B细胞抗原表位,可作为包虫病诊断及疫苗候选抗原。     

Identification and bioinformatics analysis of lactate dehydrogenase genes from Echinococcus granulosus

ObjectiveTo identify full length cDNA sequence of lactate dehydrogenase (LDH) from adult Echinococcus granulosus (E. granulosus) and to predict the structure and function of its encoding protein using bioinformatics methods.MethodsWith the help of NCBI, EMBI, Expasy and other online sites, the open reading frame (ORF), conserved domain, physical and chemical parameters, signal peptide, epitope, topological structures of the protein sequences were predicted and a homology tertiary structure model was created; Vector NTI software was used for sequence alignment, phylogenetic tree construction and tertiary structure prediction.ResultsThe target sequence was 1 233 bp length with a 996 bp biggest ORF encoding 331 amino acids protein with typical L-LDH conserved domain. It was confirmed as full length c DNA of LDH from E. granulosus and named as EgLDH (GenBank accession number: HM748917). The predicted molecular weight and isoelectric point of the deduced protein were 3 5516.2D a and 6.32 respectively. Compared with LDH s from Taenia solium, Taenia saginata asiatica, Spirometra erinaceieuropaei, Schistosoma japonicum, Clonorchis sinensis and human, it showed similarity of 86%, 85%, 55%, 58%, 58% and 53%, respectively. Eg LDH contained 3 putative transmembrane regions and 4 major epitopes (54aa-59aa, 81aa-87aa, 97aa-102aa, 307aa-313aa), the latter were significant different from the corresponding regions of human LDH. In addition, some NAD and substrate binding sites located on epitopes 54aa-59aa and 97aa-102aa, respectively. Tertiary structure prediction showed that 3 key catalytic residues 105R, 165D and 192H forming a catalytic center near the epitope 97aa-102aa, most NAD and substrate binding sites located around the center.ConclusionsThe full length c DNA sequences of Eg LDH were identified. It encoded a putative transmembrane protein which might be an ideal target molecule for vaccine and drugs.     

亚洲带绦虫成虫谷胱甘肽S-转移酶基因的克隆及生物信息学分析

目的分析亚洲带绦虫成虫谷胱甘肽S-转移酶（GST,glutathione S-transferase）基因结构并预测其编码蛋白的结构和功能。方法利用生物信息网站如美国国家生物技术信息中心（NCBI,http：//www.ncbi.nl m.nih.gov/）和瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统（ExPASY,http：//ca.expasy.org/）中生物信息学分析工具,并结合其它分析软件,从获得亚洲带绦虫成虫全长cDNA质粒文库的表达序列标签（EST,expression sequence tag）中识别GST基因,分析该基因的结构并预测其编码的蛋白质的结构和功能特征。结果该基因与猪带绦虫GST的一致性为94%,相似性为97%;全长810bp,编码区为28-687bp,编码219个氨基酸,无各种亚细胞定位序列,具有多个潜在的磷酸化位点,蛋白的理化性质稳定;预测三个主要的抗原表位89aa-94aa,27aa-32aa,119aa-124aa位于空间结构上相距较远的分子表面,前面两个表位属于绦虫共有的线性抗原表位。结论从亚洲带绦虫成虫cDNA文库中筛选出GST基因,预测为胞浆型蛋白,可能具有较好的免疫诊断抗原应用前景。     

Expression and immunoreactivity of an epitope of HCV in a foreign epitope presenting system

AIM: To construct and highly express an epitope of hepatitis C virus (HCV) in a foreign epitope presenting vector based on an insect virus, and to study the antigenicity of the epitope. METHODS: The HCV epitope sequence (amino acid residues 315 to 328: EGHRMAWDMMMNWS) of the El region was constructed at different positions of a foreign epitope presenting vector based on an insect virus, flock house virus (FHV) capsid protein encoding gene as a vector, and expressed in E. coli cells. Western blotting and ELISA were used to detect the immunoreactivity of these recombinant proteins. RESULTS: The gene encoding of the concerned B-cell epitope of HCV El envelope protein was expressed on FHV capsid carrier protein at positions I1 (aa 106), 12 (aa 153) and 13 (aa 305), respectively, on the surface of FHV capsid protein. The recombinant proteins in this system could be highly expressed in more than 40% of total cell protein of E. coli BL21. All the expressed recombinant proteins were in inclusion body form, and showed obvious immunoreactivity by Western blotting. Further purified recombinant proteins were detected by indirect ELISA as coating antigen respectively. All recombinant proteins could still show immunoreactivity. CONCLUSION: The epitope of HCV El envelope protein can be highly expressed in FHV carrier system as a chimeric protein with high immunoreactivity. This system has multiple entry sites conferring many possible conformations closer to the native one for a given sequence.     

Bioinformatics analysis of the structure and linear B-cell epitopes of aquaporin-3 from Schistosoma japonicum

ObjectiveTo analyze the structure of aquaporins-3(AQP-3) from Schistosoma japonicum(SJAQP-3) using bioinformatical methods, and to provid of references for vaccine targets research.MethodsProtparam, BepiPred, TMHMM Server, MLRC, Geno3d, DNA star software packages were used to predict the physical and chemical properties, hydrophilicity plot, flexibility regions, antigenic index, surface probability plot, secondary structure, and tertiary structure of amino acid sequence of SJAQP-3.ResultsSJAQP-3 had six transmembrane regions and two half-spanning helices that form a central channel. The half-spanning helices fold into the centre of the channel. Either of the half-spanning helix had a conserved motif of NPA common to all aquaporins. Predicted linear B-Cell epitopes were most likely at the N-terminal amino acid residues of 5aa-7aa, 59aa-62aa, 225aa-230aa, 282aa -288aa, 294aa -298aa and 305aa -307aa area. 59aa- 62aa, 225aa-230aa located outside the membrane, the others located inside the cell.ConclusionsSJAQP-3 is a integral membrane protein in Schistosoma japonicum tegument. There are six potential epitopes in SJAQP-3. It might be a potential molecular target for the development of vaccines.     

细粒棘球绦虫果糖二磷酸醛缩酶的生物信息学分析及其表达与活性检测

目的利用生物信息学方法分析细粒棘球绦虫果糖二磷酸醛缩酶(EgFBPA)的结构和功能特征,并利用基因工程技术进行克隆、表达、纯化,获得活性蛋白。方法利用多种生物信息学软件分析EgFBPA的拓扑结构、生物学以及免疫功能特征;用限制性内切酶EcoRⅠ和HandⅢ对重组质粒FBPA/P-blue酶切FBPA目的基因片段,亚克隆入表达载体pET30a,筛选重组克隆并测序,将测序正确的重组质粒转化入BL21(DE3)感受态细菌,用异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白;用Ni-NTA柱纯化重组蛋白,并建立酶反应体系,通过NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)的变化测定重组蛋白EgFBPA的酶催化活性。结果 EgFBPA基因全长1 092bp,编码363个氨基酸,软件分析其等电点(pI)为8.34,分子质量单位为39.8035ku。亚细胞定位分析该蛋白为无信号肽的细胞质蛋白,属于稳定蛋白;结构域和保守功能域的预测,FBPAI的激活位点为VYLEGTLLKPN(222aa-232aa),并含有TIMβ/α筒状结构(6aa-346aa),二级结构以α-螺旋和环状结构居多,无跨膜区,有10种类型的活性位点。经PCR、双酶切和测序证实pET30a(+)-EgFBPA构建成功。SDS-PAGE检测重组质粒表达产物分子质量与预期相符,且具有可溶性;Bradford法测定蛋白浓度为(0.50±0.02)mg/ml。酶活性检测Ni-NTA柱纯化后的FBPA具有良好的酶促活性,且存在量效关系。结论生物信息学预测EgFBPA可能是潜在的药物靶点。重组质粒Pet30a(+)-FBPA在大肠埃希菌BL21中成功表达,表达产物具有酶促活性,为进一步研究其生物学功能及药物靶点奠定了基础。     

Phenotypic and genetic analysis of dysprothrombinemia due to a novel homozygous mutation

Objective: We study the phenotype and genotype of a novel gene mutation of factor II (FII) that leads to dysprothrombinemia, and do the meta-analysis to illuminate its molecular pathogenesis. It will further contribute to our comprehension of the pathogenesis of this type of disease.

Methods: The prothrombin time (PT), activated partial thromboplastin time (APTT) and the activities of other factors were determined by the one-stage clotting method. The prothrombin antigen was measured with enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Function of the mutant protein was evaluated by thrombin generation tests. Potential mutations in exons, exon–intron boundaries and 5', 3' untranslated sequences of prothrombin gene were screened by polymerase chain reaction and direct sequencing. Suspected mutations were confirmed by reverse sequencing. The structure change of this protein was analyzed by model and bioinformatics analyses.

Results: Phenotypic analysis revealed that the proband had an obviously prolonged PT, APTT, reduced prothrombin activity but normal antigen levels. The other tests were normal. Sequencing analysis detected a homozygous g.26329T>G in the catalytic domain resulting in p.Tyr510Asp. His parents and uncle were heterozygous for this mutation. The thrombin generation test showed that the mutant protein had obstacles in thrombin generation. Bioinformatics and model analyses illuminated that the mutation will be probably damaging and perturbing the structure of Na+-binding site, which will affect the activation of prothrombin.

Conclusion: This was the first report of such a mutation in the position which was associated with dysprothrombinemia.     

亚洲牛带绦虫Spef1-Like基因及其蛋白结构特征的生物信息学分析

目的分析和预测亚洲牛带绦虫的Spef1-Like基因及其编码的蛋白质的结构和功能。方法利用生物信息学网站如美国国家生物技术中心(NCBI,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统(Ex-PASY,http://ca.expasy.org/)所提供的有关基因和蛋白序列和结构功能分析工具,以及专业的生物信息学软件包如pc-gene,VectorNTIsuite,从亚洲牛带绦虫成虫cDNA文库当中识别该基因及编码区,分析和预测该基因编码的蛋白质的理化性质,一级结构中的修饰位点及模序,亚细胞定位特征,二级结构特征以及蛋白三维空间构象,蛋白亲水性及潜在抗原表位。结果该基因全长1099bp,编码区为117-929bp,编码271个氨基酸,与GenBank当中的其他序列比对,预测该基因为全长基因。编码的蛋白质理化性质比较稳定,含有多个能被其他酶修饰的位点,无跨膜区,预测其主要含有三个亲水性较强的抗原表位,空间结构上相距较近。结论生物信息方法可从亚洲牛带绦虫成虫cDNA文库中筛选出Spef1-like基因并进行分析。