抗-HIV单克隆抗体的筛选与鉴定

我们用HIV抗体阳性者血浆包被聚苯乙烯条,加入纯化的HIV组织培养抗原,通过夹心ELISA法,筛选出3株能分泌抗HIV单克隆抗体杂交瘤细胞,传代稳定。培养上清经Western blot染色鉴定含有抗-HIV gag蛋白。夹心ELISA法测得杂交瘤细胞培养上清中单克隆抗体滴度达到1∶6400,接种BALB/C小鼠获腹水抗体效价为1∶2430000。实验表明,用此单克隆抗体检测HIV病人血清抗体敏感、特异、稳定、重复性好,是一种良好的试剂。     

产毒大肠杆菌不耐热肠毒素单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立及初步应用

用亲和层析纯化的产毒大肠杆菌(ETEC)不耐热肠毒素(LT)免疫BALB/C小鼠,将小鼠脾细胞与SP_(2/0)骨髓瘤细胞(1:8)在PEG(MW1000)作用下融合,采用ELISA筛选抗-LT抗体阳性孔,细胞融合率为50％,抗体阳性率为4.5％,经3～5次克隆后筛选出2株分泌抗-LT杂交瘤细胞株(2D_、2E_5),用ELISA测定杂交瘤细胞培养上清及腹水的效价,后者约为前者的100倍,高达90万～110万。通过平板免疫溶血试验和ELISA双抗夹心法分别对2株杂交瘤分泌的抗LT单克隆抗体(McAb)的特异性进行了试验,结果表     

产生抗单纯疱疹病毒单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立

用HSV-1 SM44株免疫C×S/1小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/O融合,经HAT选择培养,细胞融合率为100％。ELISA筛选后获得53孔产生抗HSV抗体的杂交瘤阳性孔。对1A12,2A8,1G8,1D10,2C5 5株细胞系用有限稀释法做2～5次克隆化,阳性克隆率均达到100％。杂交瘤细胞系经连续传代培养4个月,仍能稳定产生单克隆抗体,冻存的细胞系经复苏后亦能稳定产生抗体。应用ELISA及IF试验证明,5种单克隆抗体均与HSV-1和HSV-2标准株呈特异性反应。ELISA测定,杂交瘤培养上清抗体效价为10~(-2)～10~(-3),制备免疫腹水效价为10~(-4)～10~(-7)。5种单克隆抗体与EBV,CMV,JEV和HFRSV无交叉反应。     

抗PSMA7单克隆抗体的制备和初步鉴定

目的制备抗蛋白酶体α7亚基(PSMA7)的单克隆抗体,为PSMA7的功能研究奠定基础。方法以纯化的重组蛋白PSMA7为抗原免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术制备PSMA7单克隆抗体,并用间接ELISA法和Western blot法对单克隆抗体的特性进行鉴定。结果成功建立两株稳定分泌抗PSMA7蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为B013和B001。检测杂交瘤细胞培养上清抗体效价为1∶128和1∶256,腹水效价为1∶25600和1∶32000。两株单克隆抗体的免疫球蛋白亚类均为IgG1。Westernblot及免疫组化实验证实,两株单克隆抗体均能特异性结合真核细胞内源性PSMA7蛋白。结论成功建立了两株效价高、特异性好的抗PSMA7单克隆抗体杂交瘤细胞,制备的单克隆抗体可用于PSMA7蛋白的鉴定,为其生物学功能研究奠定了基础。     

抗人IgK和Igλ链单克隆抗体的制备及临床初步应用

用初乳和血清IgA免疫Balb/c小鼠的脾细胞与SP_2/O和NS-1瘤细胞融合,以ELISA双抗原夹心法检测获得5株杂交瘤细胞。其中3株(1D1、5C3、11A7)分泌抗人游离和结合型λ轻链;2株(4G12、14A6)分泌抗人游离和结合型K轻链。4G12与结合型K链反应比游离K链好。这些细胞株在长达1年的培养中仍能稳定分泌特异性单克隆抗体,经液氮冻存10个月后杂交瘤细胞仍保持原有的特性。用固相抗原竞争ELISA试验表明,两个抗K链McAb是针对不同的抗原位点,而3株抗λ链则针对相同的抗原位点。用于检测副蛋白和本周氏蛋白具有很好的特异性和敏感性。把McAb4G12-HRP和1D1-HRP混合,用于检测-EB病毒早期抗原(EA)和壳抗原(VCA)抗体被证明是满意的,同时试用于抗核抗体的检测也获得了初步的结果。     

抗伏马菌素B1单克隆抗体的制备和特性

目的建立敏感、特异和快速的针对伏马菌素B1(fumonisin B1, FB1)的酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay ,ELISA)检测方法,形成具有我国自主知识产权的快速检测试剂盒.方法利用B细胞杂交瘤技术,建立能分泌抗伏马菌素B1单克隆抗体的杂交瘤细胞株.结果用伏马菌素B1-牛血清白蛋白(FB1-BSA)偶联物免疫8～10周龄雌性BALB/c小鼠后,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0融合,经过3～4次亚克隆建立了1个稳定分泌抗伏马菌素B1毒素抗体的杂交瘤细胞株,命名为5A9.将杂交瘤细胞打入BALB/c小鼠腹腔,获得含抗伏马菌素B1毒素单克隆抗体的腹水,并将腹水用饱和硫酸铵法进行纯化,得到单克隆抗体.该单克隆抗体的Ig亚类为IgG1,腹水中抗体的滴度分别为2.56×106,参考工作浓度为3.2×105.纯化后抗体的IgG含量为10.4 g/L,亲和常数为8.3×10-8 mol/L.该抗体与其他结构类似物无交叉反应,具有较高的特异性.结论制备了具有高特异性和亲和力的抗伏马菌素B1单克隆抗体,初步形成了针对伏马菌素B1的ELISA检测试剂盒.     

白念珠菌烯醇化酶单克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备并鉴定抗白念珠菌烯醇化酶单克隆抗体杂交瘤细胞株。方法：提取白念珠菌标准株ATCC-9002胞内烯醇化酶做抗原,再用细胞融合技术制备单克隆抗体,采用间接ELISA法对单克隆抗体进行筛选和鉴定。结果：建立了1株持续分泌抗白念珠菌烯醇化酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其中Mab07．4G6-F3-C7小鼠腹水单克隆抗体的最高稀释度达1：12800,单克隆抗体的重链属IgG1亚类,轻链属K型;Western blot证实单抗能与自念珠菌烯醇化酶抗原特异性地结合。结论：本研究建立了抗白念珠菌烯醇化酶杂交瘤细胞株单克隆抗体,为快速诊断白念珠菌感染奠定了实验基础。     

分泌抗人肝铁蛋白单克隆抗体的淋巴细胞杂交瘤FP-1和FP-2培育成功

我们用K(?)hler和milstein创建的杂交瘤技术,成功地得到两株抗人肝铁蛋白单克隆抗体的淋巴细胞杂交瘤,命名为FP-1和FP-2。经体外培养,均能稳定分泌抗体。FP-1分泌的抗体_1(Ab_1)是针对人正常肝铁蛋白的单克隆抗体。FP-2分泌的抗体:(Ab_2)对肝癌组织铁蛋白起反应,同时对正常肝铁蛋白也有轻度反应。此两种单克隆抗体,可供研究人肝脏病理学和免疫组织化学。     

定量检测肝细胞生成素Cn的双抗体夹心ELISA检测方法的建立

目的 建立定量检测肝细胞生成素Cn (HPPCn)的双抗体夹心ELISA方法.方法 利用杂交瘤方法获得8个抗HPPCn单克隆抗体(mAb),并行SDS-PAGE和Western印迹对纯化抗体特性进行鉴定.利用镀金芯片法对8个抗体进行配对检测.通过方阵滴定法确定包被抗体和酶标抗体的最适工作浓度.以纯化的HPPCn抗原为标准品建立标准曲线.结果 得到了8株稳定分泌抗人HPPCn抗体的杂交瘤细胞株,分别为Ab 65-29-6,Ab_3-3-3,Ab_9-34-1,Ab_4-8-12,Ab_7-8-10,Ab_2-30-23,Ab_1 1-11-12和Ab_12-27-23.8个抗体均能够特异结合HPPCn抗原,其中Ab_65-29-6与细胞中HPPCn结合的特异性最好.经抗体配对检测证实最佳配对组合为:Ab_2-30-23和Ab_4-8-12.包被抗体Ab_2-30-23和识别抗体Ab 4-8-12的最适工作浓度为2.5 μg/ml,最适稀释度为1∶2000,标准曲线检测的线性范围为5.0～60 ng/ml.结论 制备了可特异性检测人HPPCn蛋白的单克隆抗体,并建立了一种可用于定量检测人HPPCn的双抗体夹心ELISA方法.     

抗T-2毒素单克隆抗体的制备及特性

目的 :建立敏感、特异和快速的针对T 2毒素的ELISA检测方法 ,形成具有我国自主知识产权的快速检测试剂盒。方法 :利用B细胞杂交瘤技术 ,建立抗T 2毒素的单克隆杂交瘤细胞株。结果 :用T 2 羊免疫球蛋白 (T 2 GIgG)偶联物免疫 8～ 10周龄雌性BALB/c小鼠后 ,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系Sp2 /0融合 ,经过 3～ 4次亚克隆建立了 2个稳定分泌抗T 2毒素抗体的杂交瘤细胞株 ,分别命名为 2A7和 6E4。将上述 2株杂交瘤细胞分别注入BALB/c小鼠腹腔 ,获得含抗T 2毒素单克隆抗体的腹水 ,并将腹水用饱和硫酸铵法进行纯化 ,得到 2A7和 6E4单克隆抗体。两株单克隆抗体的Ig亚类为IgG1,腹水中抗体的滴度分别为 6 .4× 10 6和 1.1× 10 7,参考工作浓度分别为1.0× 10 6和 3.2× 10 6。纯化后 2A7抗体的IgG含量为 16 .4g/L ,亲和常数为 8× 10 -8mol/L。 2A7抗体与其他结构类似物无交叉反应 ,具有较高的特异性。结论 :制备了具有高特异性和亲和力的抗T 2毒素单克隆抗体 ,初步建立了针对T 2毒素的ELISA检测方法。     

抗PEA受体结合区单克隆抗体的制备及鉴定

目的探讨绿脓杆菌外毒素A(PEA)中和性单克隆抗体在预防和治疗绿脓杆菌感染中的免疫保护作用.方法以重组绿脓杆菌外毒素A受体结合区蛋白免疫Balb/c小鼠,将免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用ELISA方法筛选细胞培养上清,采用有限稀释法对阳性孔进行克隆,3次克隆后获得4株能稳定分泌抗PEA单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1C4,1D4,2E12和3C6.结果细胞培养上清ELISA效价为4000～8000,腹水ELISA效价可达25600～51200,其中3C6抗体在细胞上的中和试验显示具有较高的中和效价,其亲和常数为8.93×108.结论获得的单克隆抗体可在抗烧伤绿脓杆菌感染中发挥重要作用.     

盐酸克仑特罗单克隆抗体的制备及特性鉴定

目的:制备抗盐酸克仑特罗(clenbuterol ,CL)的单克隆抗体并进行免疫学特性鉴定.方法:用重氮化法将盐酸克仑特罗偶联于载体牛血清白蛋白(BSA),形成的结合抗原BSA-CL作为免疫原免疫BALB/c小鼠,同时将CL与卵清白蛋白(OVA)偶联制备检测原(OVA-CL).应用杂交瘤技术建立分泌抗盐酸克仑特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株,体内诱生腹水并进行纯化.用竞争性ELISA法测定抗体的亲和常数及交叉反应性.结果及结论:获得了18株稳定分泌抗盐酸克仑特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株,挑选其中E9-C11、C11-E3、E7-G8三株高亲和力的细胞株进行免疫学特性鉴定.三株抗体的亚类均为IgG1.细胞上清的间接ELISA效价分别为1:1 280、1:1 000、1:800,三株腹水效价都约为1×10-6.亲和常数分别为2.4×10-8mol/L、2.83×10 -8 mol/L 、3.28×10-8 mol/L .E9-C11单抗对CL的IC50为6.1035μg/L;对沙丁胺醇的IC50大于781.25 μg/L,交叉反应性小于0.78%;对肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素、莱克多巴胺及部分维生素和抗生素均无交叉反应性.蛋白免疫印迹分析证明三株单抗特异性均很高,可用于与其相关的免疫检测或应用研究.     

抗大鼠HSP70蛋白单克隆抗体的制备及特性研究

目的制备大鼠HSP70蛋白单克隆抗体并对其性质进行研究。方法利用PCR技术扩增大鼠全长hsp70,插入表达质粒pET-28a,pMAL-c2x,诱导表达,采用亲和层析纯化融合蛋白;用HIS-HSP70融合蛋白免疫BALB/c小鼠,杂交瘤技术制备大鼠HSP70单克隆抗体;采用Western印迹和免疫组化方法对抗体性质进行鉴定,ELISA方法确定抗体的表型。结果亲和层析纯化HIS-HSP70蛋白纯度在97.6%,获得6株可稳定分泌抗HSP70mAb的杂交瘤细胞系;抗体的亚类均是IgG1类κ链的。Western印迹结果显示6株单抗均能识别天然的大鼠HSP70蛋白;免疫组化结果显示3株抗体可以识别组织的HSP70蛋白。结论成功获得6株有活性HSP70单克隆抗体,可以识别HSP70蛋白不同表位,为进一步研究HSP70单克隆抗体在疾病中的作用奠定基础。     

酶联免疫法与金标法检测抗-HIV的比较

目的 观察ELISA(间接法、双抗原夹心法)快速诊断金标法(胶体金免疫分析技术)在检测抗-HIV中试剂质量比较,并分析其原因。方法 用2001年卫生部免疫检验室间质评HIV质控血清10份,其中6份为阳性血清(经Weet-Blot确诊),用两厂家生产的ELISA间接法、双抗原夹心法、金标法做比较。结果 两厂家生产的ELISA间接法一份阳性标本不能检出,但两厂家生产的ELISA双抗原夹心法和金标法阳性检出率为100％。结论 试剂的质量对保证大量的献血员、高危人群的HIV筛查工作至关重要。     

抗登革病毒单抗的独特型抗体的制备与鉴定

从19种抗登革病毒单克隆抗体(简称单抗)中筛选出4种具有中和活性的单抗。经过纯化免疫新西兰大白兔制备多克隆抗独特型抗体(Ab2)。制备的4种抗独特型抗体血清有很高的特异性,其中具有全交叉反应的3种单抗的抗血青中Ab2的水平较高。采用简便的去除抗血清中的同种型和同种异型抗体的方法,用夹心ELISA法检测Ab2的水平取得了满意的结果。     

产生抗登革4型病毒单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立

用登革4型H241株病毒免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,获得了5个产生抗登革4型病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞系。这些杂交瘤细胞的上清液及小鼠腹水抗体均用间接免疫荧光法检测。其中两个杂交瘤细胞系产生的抗体对登革4型病毒具有型特异性,它们的荧光抗体滴度分别为1:10,240～1:20,480和1:2,560。另两个细胞系产生的抗体对登革2型病毒有交叉;另1个对登革1型病毒有交叉。     

单克隆与多克隆双抗体夹心ELISA法测定白细胞介素6

鉴于白细胞介素-6(IL-6)对免疫、代谢和病理过程的重要作用,笔者利用淋巴细胞融合技术获得了4株抗IL-6单克隆抗体(McAb),并建立了灵敏的双抗体夹心ELISA法用于测定人IL-6。主要步骤为以鼠抗     

8－氮鸟嘌呤诱变3D_5杂交瘤细胞的初步研究

小鼠杂交瘤３Ｄ５为一株分泌抗人红细胞非凝集性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，用８－氮鸟嘌呤（８－ＡＧ）诱变处理可以使之成为具有模拟骨髓瘤性质的次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺失的杂交瘤细胞系，并且保留杂交瘤细胞系分泌抗体的能力，在利用自身血细胞凝集试验对各种病原体的快速诊断中应用广泛。实验表明，用不同剂量的８－ＡＧ进行诱变，在不同剂量水平上３Ｄ５杂交瘤细胞主要呈现细胞生长抑制、部分细胞衰老死亡、存活细胞分裂生长成为多细胞克隆及细胞适应８－ＡＧ诱变后恢复正常生长能力等一系列的变化过程。利用间接免疫荧光方法检测３Ｄ５分泌抗体结果表明，诱变后３Ｄ５杂交瘤细胞株仍然保持有分泌抗人红细胞非凝集性单克隆抗体的能力，此细胞系的建立不仅为研制自身血细胞凝集试验的双功能抗体奠定了基础，同时也具有一定理论意义     

鸡抗HBs抗体的制备及在人HBsAg检测中的应用

对所制备的抗鸡蛋黄IgY单克隆抗体1G11和3A6进行鉴定,标记后建立了检测鸡蛋黄IgY的间接ELISA方法.用乙型肝炎疫苗免疫25周龄蛋鸡,血清及蛋黄中第8d出现特异性抗体,在第60d效价达1×10~(-5).利用鸡抗HBs抗体,建立了检测血清HBsAg的夹心ELISA方法.检测HBsAg的最低浓度达0.5ng/ml.且特异性较目前商业化试剂盒高     

酶联免疫法与金标法检测抗-HIV的比较

目的 观察EUSA(间接法、双抗原夹心法)快速诊断金标法(胶体金免疫分析技术)在检测抗-HIV中试剂质量比较，并分析其原因。方法用2001年卫生部免疫检验室间质评HIV质控血清10份，其中6份为阳性血清(经Weet-Blot确诊)，用两厂家生产的EUSA间接法、双抗原夹心法、金标法做比较。结果两厂家生产的ELISA间接法一份阳性标本不能检出。但两厂家生产的EUSA双抗原夹心法和金标法阳性检出率为100％。结论试剂的质量对保证大量的献血员、高危人群的HIV筛查工作至关重要。