抗Caspase-12核酶的制备与体外活性鉴定

目的 设计针对小鼠内质网应激凋亡途径中caspase-12mRNA的锤头状核酶(Rz138、Rz218)，通过靶基因及核酶的体外转录、切割，进行核酶活性鉴定，评估其应用前景。方法 小鼠Caspase-12基因的逆转录聚合酶链反应(RTPCR)扩增片段克隆于PGEMT载体的T7启动子下游，通过α-^32P UTP标记的体外转录物作为靶RNA。设计合成针对小鼠Caspase-12 mRNA的核酶，通过PCR方法扩增核酶的转录模板，采用非同位素标记法行体外转录，核酶与靶RNA进行体外切割实验。结果在37℃，Rz138、Rz218均有切割活性，Rz138的切割效率较高，几乎100％。结论 Rz138在体外具有良好的特异催化切割活性，它有望通过切割Caspase-12 mRNA而抑制内质网应激介导的细胞凋亡发生。     

抗血小板衍生生长因子受体β亚单位核酶的体外制备与活性鉴定

目的 研究针对血小板衍生生长因子（PDGF）受体β亚单位基因的核酶的制备与体外切割活性鉴定。方法 将大鼠PDGF受体β亚单位基因的PCR片段克隆于T载体T7启动子下游,^32P标记的体外转录物作为靶RNA;设计并合成针对大鼠PDGF受体β亚单位胞外区的核酶,将核酶基因克隆于自我切割核酶载体P1．5的5′－cis核酶和3′-cis核酶之间,并进行^32P标记的转录。核酶与靶RNA按一定比例和条件进行切割反应电泳,放射自显影。结果 核酶制备正确,在最适条件下具有切割活性。其Km=13.20nM,Kcat=0.28min^-1。最高切割效率达78．3％。结论 体外制备的核酶具有良好的特异催化切割活性。     

抗半胱氨酸蛋白酶-7核酶的克隆、体外表达与切割活性的研究

目的 设计并合成抗小鼠半胱氯酸蛋白酶-7(Caspaso7)的锤头状核酶,并对它们的体外表与体外切割活性进行研究。方法 采用计算机软件对锤头状核酶和小鼠Caspase 7基因的二级结构进行分析,核酶的DNA序列在体外由自动合成仪合成,小鼠Caspase-7日的基因通过RTPCR扩增获得,将核酶基因和caspase-7基因分别克隆入载体pBSKneoU6’和pGEM-T中,通过体外转录得到核酶和caspase-7 mRNA,通过体外切割筛选出具有切割活性的核酶。结果 针对目的基因的333和394位点设计合成了两个核酶：Rz333和Rz394。成功获得caspase-7 mRNA的表达载体PC7及含有核酶的重组质粒PU6Rz333和pU6Rz394,通过体外转录表达出含有caspase7mRNA的987nt的靶mRNA及完整的核酶Rz333(47nt)和Rz394(50nt)。体外切割实验证实Rz333能够定点切割caspase-7mRNA,产生243nt和744nt的切割产物,切割效率为67．98％。Rz394不能切割靶基因。结论 核酶Rz333能够位点特异性的切割caspase-7 mRNA。     

丙型肝炎病毒特异性锤头样核酶体外转录及切割活性的初步研究

目的　研究针对丙型肝炎病毒 (HCV)特异性锤头样核酶 (Rz)的体外转录及切割活性。方法　设计 3种锤头样核酶 :Rz1、Rz2 分别作用于HCVRNA 5′ 非编码区 (5′ NCR)上核酸序列 136～16 0、313～ 337,Rz3 作用于核心 (C)区上核酸序列 373～ 388。为区别于反义核酸的封闭作用 ,设计在Rz3 的催化环上存在点变异 (G取代A)的变异核酶Rzm用作对照。体外转录出靶HCVRNA和核酶RNA ,在一定条件下 ,将3 2 P标记的靶HCVRNA与核酶RNA按不同浓度比例进行切割反应 ,电泳后放射自显影 ,通过同位素扫描成像分析仪分析来评价核酶切割效率。结果　除Rzm外 ,在生理温度下 ,3种核酶均有活性 ,并随核酶浓度增加而提高 ;核酶切割靶位点距HCV起始密码子近切割效率高。结论　设计并观察到体外具有HCV特异性切割活性的锤头样核酶 ,为进行核酶的细胞内应用研究奠定基础     

HBV特异性核酶与HDV重组体的体外转录及切割活性研究

目的利用基因重组技术,用核酶基因置换HDV部分基因,分别用HBV特异性核酶(rRZ)和核酶-HDV重组体(rHDVRZA、rHDVRZB和rHDVRZC)研究体外转录与剪切HBV的活性。方法 将含有83lbp的HBV C基因片段的质粒pTA-HBV用BamHI消化成线性后,体外转录获取5’端32P标记靶HBV C RNA。将获得的3个核酶-HBV重组体rHDVRZA、rHDVRZB和rHDVRZC克隆于pGEM-T载体T7启动子下游进行非标记的大量转录。分别将rRZ、rHDVRZA、rHDVRZB和rHDVRZC与卫32P-HBV C RNA按一定比例和条件保温切割。结果 体外实验证明rRZ、rHDVRZA、rHDVRZB和rHDVRZC在37℃具有酶切活性。提示所设计的核酶-HDV重组体rHDVRZA和rHDVRZB中核酶结构正确。结论在HDV基因组不同位置插入核酶,能够维持酶正确结构的核酶-HDV具有体外特异性切割HBV的活性。     

U1 snRNA嵌合体核酶的抗丙型肝炎病毒作用

目的鉴定特异性抗丙型肝炎病毒(HCV)核酶与具有细胞核靶向性的U1 snRNA组成的嵌合体在体外切割HCV RNA的活性。方法通过聚合酶链反应及克降的力。法用HCV特异性核酶(Rz)序列戢代质粒pBSIISK U1(含有人类野生型U1 snRNA基因全序)中U1 snRNA第三个茎环结构，重组质粒命名为pBSIISK (U1-Rz)。再将pBSIlSK (U1-Rz)中核酶与U1 snRNA组成的嵌合体基因止向充隆于pGEM-T载体T7启动子的下游，重组质丰立命名为pGFM(U1-Rz)。质粒pGEM-(U1-Rz)和pGEM Rz[含有与pGEM(U1-Rz)相同的核酶序列]体外转录后，转录产物与靶RNAs在一定条件下进行切割反应，电泳后放射自显影。结果U1 snRNA嵌合体核酶构建成功。嵌合体核酶与核酶对靶RNAs均有切割活性，且二者的切割活性相似。随着时间的延长和工具酶体积比的增加切割效率增加。结论特异性抗HCV核酶与U1嵌合体在体外具有良好的持异性催化切割活性。     

特异性脱氧核酶对丙型肝炎病毒的体外消化作用

目的研究特异性脱氧核酶对丙型肝炎病毒（HCV）的体外消化作用。方法设计3个分别作用于HCV RNA 5＇非编码区（5＇ NCR）上157、168、173位点的脱氧核酶（DRz），分别命名为DRz1，DRz2,DRz3，均以5＇GGCTAGCTACAACGA-3’为脱氧核酶的催化活性中心，用内切酶XbaⅠ将含有HCV病毒序列的质粒pCMV/T7 NCRC,△Luc消化成线性，以此为模板体外转录出用α-^32PIUTP进行标记的靶HCV RNA。在37℃,PH7.5，Mg^2 10mmol/L等条件下，将HCV RNA（10nmol/L）与3个脱氧核酶（1μmol/L）分别混合进行切割反应，并进一步比较不同Mg^2浓度下DRz3的切割反应效率，反应产物在8%变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离并行放射自显影，应用凝胶成像分析仪评价脱氧核酶的切割效率。结果在设定反应条件下，3个脱氧核酶对HCV病毒均有切割活性，随着Mg^2浓度的增加，DRz3的切割活性增强，结论特异性脱氧核酶可有效切割HCV RNA 5＇NCR的RNA，且切割效率与Mg^2浓度呈正相关。     

乙型肝炎病毒特异性核酶与丁型肝炎病毒重组体的体外转录及切割活性

研究乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）特异性核酶（简称ｒＲＺ）体外转录及切割ＨＢＶ的活性。方法将８３１ｂｐ的ＨＢＶＣ基因片段克隆于Ｔ载体Ｔ７启动子下游，３２Ｐ标记转录后作为靶ＲＮＡ（３２Ｐ－ｒＨＢＶ）。ｒＲＺ、ｒＨＤＶＲＺＡ插入有核酶结构的丁型肝炎病毒基因组重组体）和ｒＨＤＶＲＺＰ（部分ＨＤＶ基因组重组体）进行非标记的大量转录，转录产物经凝胶纯化后，与３２Ｐ－ｒＨＢＶ按一定比例和条件保温切割，电泳后放射自显影。结果ｒＲＺ，ｒＨＤＶＲＺＰ，ｒＨＤＶＲＺＡ在３７Ｃ有活性，并随温度升高而提高，体外观察到重组体的切割活性，证明所设计的核酶结构是正确的。结论将核酶基因插人到ＨＤＶ基因组中，使其具有特异性切割ＨＢＶ的活性，可实现核酶的保护性和靶向性运载，为下一步重组体的体内应用研究奠定了基础。     

乙型肝炎病毒特异性核酶与丁型肝炎病毒重组体的体外转录及切？…

日的 研究乙型肝炎病毒特异性核酶体外转录及切割ＨＢＶ的活性。方法 将８１ｂｐ的ＨＢＶ Ｃ基因片段克隆于Ｔ载体Ｔ７启动子下游，＾３２Ｐ标记转录后作国靶ＲＮＡ（＾３２Ｐ－ｒＨＢＶ）。ｒＲ２，ｒＨＤＶＲＺＡ（插入有核酶结构的丁型肝炎病毒基因组重组体）和ｒＨＤＶＲＺＰ（部分ＨＤＶ基因组重组体）进行非标记的大量转录，转录产物经凝胶纯化后，与＾３２Ｐ－ｒＨＢＶ按一定比例和条件保温切割，电泳后放射自显影。     

丁型肝炎

丁型肝炎病毒基因组RNA包埋锤头状核酶的活性研究——李晓娟等（广东深圳市东湖医院、深圳市肝病研究所518020）：《中华实验和临床病毒学杂志》，2005，19（1）：12-15[目的：探讨用丁型肝炎病毒（HDV）基因组来包埋HBV靶向性核酶对核酶体内外活性产生的影响。方法：用和HBV靶基因体外转录产物在不同反应条件下温育对HDV-核酶重组体的体外切割活性定量分析：     

犬贾第虫病毒转染载体介导的锤头状核酶对KRR1基因体外转录体切割效果的研究

目的 检测犬贾第虫病毒介导的锤头状核酶对犬贾第虫滋养体核仁功能性蛋白KRR1基因体外转录体切割效率。 方法 将两端携带反义KRR1基因的锤头状核酶(ribozyme, R酶)插入犬贾第虫病毒（Giardia canis virus, GCV）转染载体中, 构建两个核酶嵌合型犬贾第虫病毒载体： 短反义序列, 上游及下游均为21个碱基, 形成重组质粒KRzS； 长反义序列, 上游为288个碱基, 下游为507个碱基, 形成重组质粒KRzL。 另设两种阴性对照, 即重组质粒TRzL(即R酶两端含虫体反义磷酸丙糖异构酶基因, 上游为324个碱基, 下游为380个碱基)和重组质粒PKR(即犬贾第虫病毒转染载体中仅有KRR1 基因的反义片段而无R酶功能区)。应用荧光实时定量RT?鄄PCR法检测嵌合型锤头状核酶体外对KRR1 基因mRNA切割活性。 结果 KRzS、 KRzL转录体对KRR1 基因体外转录RNA切割效率分别达到74.0%和81.1%。而PKR对KRR1 mRNA反转录的影响较小, RT-PCR效率仅降低12.0%。TRzL对KRR1 mRNA反转录几乎无影响。 结论 犬贾第虫病毒介导的锤头状核酶对KRR1基因体外转录体能进行有效切割, 为以后的体内锤头状核酶对KRR1基因表达抑制试验提供依据。