人Notch1受体胞内段重组腺病毒构建及转染

目的构建人Notch1受体胞内段重组腺病毒并转染人肝癌细胞株HepG2,为Notch信号对肝癌侵袭转移的影响研究奠定实验基础。方法构建Notch1受体胞内段(notch intracellular domain,NICD)基因的重组质粒pDC316-CMV-EGFP-CMV-Notch1-Myc,采用AdMax腺病毒包装系统将重组质粒与骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre共转染293细胞,同源重组产生重组腺病毒Ad-EGFP-NICD-Myc,RTPCR鉴定重组腺病毒EGFP及NICD基因表达。重组腺病毒转染人肝癌细胞株HepG2,荧光显微镜观察EGFP及NICD蛋白的表达。结果重组腺病毒Ad-EGFP-NICD-Myc经鉴定基因表达正确,此病毒转染人肝癌细胞株HepG2后阳性表达EGFP及NICD蛋白。结论人Notch1受体胞内段重组腺病毒成功构建,为进一步Notch信号对肝癌侵袭转移的影响研究奠定了实验基础。     

SEPT9基因在人肝细胞癌侵袭转移中的作用

目的研究SEPT9基因对人肝癌细胞侵袭转移的影响。方法通过westernblot法筛选SEPT9蛋白高表达肝癌细胞系,慢病毒转染沉默后检测细胞SEPT9蛋白表达量,通过EdU染色检测sh-SEPT9对肝癌细胞增殖的影响;Transwell和划痕实验检测沉默SEPT9表达后肝癌细胞的侵袭能力和迁移能力;westernblot分析沉默SEPT9表达对肝癌细胞HIF-1α、Ki67、PCNA、MMP-9、VEGF、Vimentin, N-cadherin、E-cadherin蛋白表达影响。结果 westernblot显示SEPT9蛋白在肝癌HepG2细胞存在高表达,慢病毒转然能够获得稳定遗传的HepG2-SEPT9-shRNA细胞系,sh-SEPT9转然后,EdU染色显示HepG2细胞增殖受到明显抑制(P0.05),细胞的侵袭能力和迁移能力显著降低(P0.05);HepG2细胞Ki67、PCNA、Vimentin、N-cadherin、HIF-1α、MMP-9及VEGF表达量明显降低,E-cadherin的蛋白水平明显上升(P0.05)。结论 SEPT9基因通过增强肝癌HepG2细胞的EMT机制,促进肝癌HepG2细胞的侵袭转移。     

Glypican-3对HepG2肝癌细胞增殖及侵袭转移的影响

目的探讨磷脂酰肌醇蛋白多糖-3(Glypican-3,GPC-3)在Hep G2肝癌细胞增殖及侵袭转移中的作用。方法构建并筛选沉默GPC-3最有效的shRNA,转染HepG2细胞,Western blot分析GPC-3蛋白表达水平;MTT、划痕实验和Transwell小室实验分别检测GPC-3基因沉默对HepG2细胞增殖、转移和侵袭能力的影响。结果 GPC-3-shRNA-1干扰效果最好,对GPC-3表达抑制率为77.7%;GPC-3沉默后HepG2细胞增殖显著受到抑制(P=0.014),细胞转移和侵袭能力显著减弱,侵袭抑制率为52.4%。结论 GPC-3基因沉默后Hep G2细胞增殖、转移和侵袭能力显著受抑制,提示GPC-3在肝癌的发生发展中起关键作用,可能成为肝癌靶向治疗的目标。     

MT1-MMP对人肝癌细胞株HepG2生物学行为的影响

目的 观察膜型基质金属蛋白酶-1(MT1-MMP)对人肝癌细胞株HepG2生物学行为的影响.方法 将稳定表达MT1-MMP基因转染至HepG2细胞中,应用RT-PCR、Ⅰ型胶原黏附和Matrigel侵袭小室实验,检测细胞MT1-MMP mRNA水平,体外黏附、侵袭和迁移能力的变化.结果 重组质粒转染株MT1-MMP mRNA表达水平明显高于空质粒组和对照组(P<0.01).MT1-MMP明显提高细胞Ⅰ型胶原黏附、迁移和Matrigel侵袭能力(P<0.01).结论 MT1-MMP过表达可促进HepG2细胞体外侵袭和转移,提示其可作为人肝癌抗侵袭治疗的分子靶点.     

IL-8对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响及其机制研究

目的探讨白细胞介素-8(IL-8)在肝癌细胞中的表达及其对增殖、迁移、侵袭的影响并分析其可能作用机制。方法采用qRT-PCR与Western blot方法分别检测肝癌细胞系HepG2、SMMC-7721及正常肝细胞L02中IL-8 mRNA和蛋白表达水平。将IL-8 siRNA转染至HepG2细胞,MTT检测沉默IL-8对HepG2细胞增殖能力的影响,Transwell迁移及侵袭实验检测沉默IL-8对HepG2细胞迁移及侵袭能力的影响,采用qRT-PCR与Western blot方法分别检测MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白表达水平。Western blot法检测沉默IL-8对磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路蛋白表达的影响。HepG2细胞中加入PI3K/Akt信号通路抑制剂(LY294002),观察其对HepG2细胞增殖、迁移及侵袭的影响。结果相较于L02相,肝癌细胞系HepG2、SMMC-7721中IL-8 mRNA及蛋白表达均显著升高(P 0. 05); HepG2细胞中敲低IL-8后细胞增殖、迁移及侵袭能力均明显减弱,MMP-2、MMP-9及PI3K、p-AKT表达水平均明显降低;加入LY294002可明显抑制HepG2细胞增殖、迁移及侵袭能力。结论 IL-8可能通过激活PI3K/Akt信号通路进而增强肝癌细胞增殖、迁移、侵袭能力。     

RhoA短发夹状双链RNA对肝癌细胞HepG2生物学行为的调控研究

[目的]探讨肝癌细胞HepG2中RhoA的表达水平,以及载体表达的短发夹状双链RNA(shRNA)特异性抑制RhoA在HepG2中的表达后,对肝癌细胞侵袭迁移和增殖能力的影响。[方法]RT-PCR和Western-blot方法检测RhoA在HepG2及L02中的表达;构建RhoA shRNA真核表达载体;脂质体法转染至高表达RhoA的HepG2细胞中;筛选得到稳定低表达RhoA的HepG2细胞株,用侵袭小室法(transwell)检测该细胞株侵袭和迁移能力的改变;并用染料羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记该细胞株,流式细胞仪检测细胞增殖能力的变化。[结果]HepG2中RhoA mRNA和蛋白的表达水平均显著高于正常人肝胚胎细胞系L02(两者均P0.05)。转染pshRNARhoA真核载体特异性抑制RhoA的表达后,HepG2细胞分别在侵袭实验和迁移实验中穿过微孔膜的细胞个数均远少于对照组细胞(两者均P0.05),增殖能力也明显减弱(P0.05)。[结论]抑制肝癌细胞HepG2中RhoA基因的表达能降低细胞的侵袭迁移和增殖能力,部分逆转肝癌细胞的恶性表型,为进一步研究肝癌侵袭转移和增殖机制提供了实验基础。     

敲减LncRNA TPT1-AS1抑制肝癌细胞侵袭及迁移

背景长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)肿瘤蛋白翻译调节因子1-反义RNA1(tumor protein translationally controlled regulator 1-antisence RNA 1,TPT1-AS1)TPT1-AS1可通过不同的作用方式影响肿瘤的侵袭转移,但其在肝癌中的具体作用和相关作用机制还有待进一步的实验验证.目的探讨lncRNA TPT1-AS1在肝癌中的表达及其对肝癌细胞侵袭迁移能力的影响.方法实时荧光定量PCR检测肝癌组织及肝癌细胞系(Huh7、SMMC-7721、HCCLM3和HepG2)中lncRNA TPT1-AS1的表达.靶向TPT1-AS1的小分子干扰RNA(siRNA targeted for TPT1-AS1,si-TPT1-AS1)转染后,经Transwell实验和划痕实验检测HepG2细胞侵袭及迁移能力的变化;Western blot评估上皮-间充质转分化进程(epithelial-mesenchymal transition,EMT)以及磷酸肌醇3激酶(phosphotylinosital 3 kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/AKT)信号通路的活性.结果肝癌组织及肝癌细胞系(Huh7、SMMC-7721、HCCLM3和HepG2)中均可检测到lncRNA TPT1-AS1的高表达.转染siRNA-TPT1-AS1可抑制肝癌细胞HepG2的侵袭及迁移,同时抑制HepG2细胞的EMT进程.此外,下调lncRNA TPT1-AS1可抑制MMP-9的表达及PI3K/AKT信号通路的活性.结论LncRNA TPT1-AS1在肝癌中高表达.敲减lncRNA TPT1-AS1可抑制肝癌细胞HepG2的侵袭迁移,其作用机制可能与下调PI3K/AKT信号通路的活性以及下游基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)的表达,进而抑制细胞的EMT进程有关.     

表没食子儿茶素没食子酸酯抗肿瘤侵袭转移相关机制的探讨

目的观察茶多酚的有效成分表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对人肝癌细胞侵袭转移的影响及探讨其相关机制。方法用免疫细胞化学检测黏蛋白1的表达、人工重组基底膜侵袭小室及明胶酶谱法观察其对人肝癌细胞株HepG2细胞侵袭转移的影响。结果EGCG能抑制HepG2细胞黏蛋白1的表达，对照组HepG2强阳性细胞数为15个，而EGCG组的强阳性细胞数为1个，差异有统计学意义；EGCG能抑制侵袭基底膜的能力，对照组的侵袭细胞数为（53．2±12．6）个，而EGCG组侵袭细胞数为（8．0±5．1）个，差异有统计学意义。EGCG能抑制MMP-2、MMP-9的分泌。结论EGCG具有明显的抗癌侵袭和转移的作用，其机制可能与黏蛋白1的降低有关。     

乙型肝炎病毒X蛋白相关lncRNA NEAT1促肝癌增殖和转移的研究北大核心CSCD

目的探讨乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)相关lncRNA NEAT1表达与肝癌患者临床特征及预后的关系,及其对肝细胞癌(HCC)增殖和转移的影响。方法从本院行肝切除术的肝癌患者的标本中收集肝癌组织和相应的邻近非肿瘤肝组织各125份。构建稳定转染HBx基因的HepG2细胞和相应阴性对照,采用微阵列分析鉴定HBx差异调控的lncRNAs。采用实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测肝癌组织和HCC细胞中NEAT1的表达,MTT法测定细胞增殖,Transwell分析细胞迁移和侵袭能力。通过功能获得和功能丧失试验确定NEAT1/miR-128-3p在HCC细胞迁移和侵袭中的作用。结果微阵列分析显示,NEAT1在稳定转染HBx基因的HepG2细胞上调。NEAT1与HBx/HBV相关,并在体外和体内HCC中上调。临床病理分析表明,NEAT1与肝血管浸润、不良肿瘤分化和HBV感染显著相关(P<0.05),并且NEAT1在HCC组织中过表达与患者预后不良相关(P<0.05)。亚组生存分析表明,HBV阴性HCC患者的预后较好(P<0.05),而HBV+/NEAT1+亚组患者的预后较差(P<0.05)。体外试验证实,NEAT1过表达显著促进HepG2增殖(P<0.05),并增强细胞的迁移和侵袭能力(P<0.01);NEAT1敲除显著抑制Hep3B增殖(P<0.05),并降低细胞的迁移和侵袭能力(P<0.01)。双荧光素酶报告基因试验证实NEAT1靶向miR-128-3p,且miR-128-3p在很大程度上逆转NEAT1对HCC细胞迁移和侵袭能力的作用。结论 NEAT1通过竞争结合miR-128-3p作为ceRNA,促进肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。     

葛根素对人肝癌细胞HepG2侵袭与迁移能力的影响

目的探索葛根素对人肝癌细胞HepG2侵袭与迁移能力的影响及其相关分子机制。方法将人肝癌细胞HepG2分为两组,实验组用60μg/ml、30μg/ml的葛根素进行培养,对照组用加入等体积的葛根素溶解剂二甲基亚砜(DMSO)的培养基培养;利用细胞划痕实验检测两组细胞的迁移能力;利用Transwell小室检测两组细胞的侵袭能力;通过蛋白免疫印迹检测波形蛋白(vimentin)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、基质金属蛋白酶2/9(matrix metalloproteinase2/9,MMP2/9)。结果人肝癌细胞HepG2在经过葛根素培养后,细胞划痕的愈合能力下降,Transwell小室细胞的侵袭能力下降;E-cadherin表达上升(P<0.05),vimentin、MMP2和MMP9的表达下调(P<0.05)。结论葛根素通过上皮细胞间质转化(EMT)途径导致人肝癌细胞HepG2侵袭转移能力下降。     

骨形态发生蛋白9对肝细胞癌肿瘤干细胞干性、增殖和侵袭的影响及机制

目的 探讨骨形态发生蛋白9 (BMP9)对肝细胞癌（HCC）肿瘤干细胞（CSCs）干性、增殖和侵袭的影响及机制。方法 取对数生长期的正常肝细胞、肝癌细胞、肝癌CSCs,采用RT-qPCR法检测BMP9 mRNA表达,采用Western blotting法检测BMP9蛋白表达。采用慢病毒干扰载体转染肝细胞癌肿瘤干细胞（HepG2-CSCs）以敲低BMP9表达,并分成HepG2-CSCs组、HepG2-CSCs-BMP9敲低组。加入MAPK/ERK信号激动剂（DIPQUO）后,将细胞分为三组：HepG2-CSCs组、HepG2-CSCs敲低组及HepG2-CSCs敲低+DIPQUO组。采用RT-qPCR实验检测HepG2-CSCs干性相关分子CD44、SOX2和OCT4表达,采用CCK-8实验检测细胞增殖能力,采用Transwell实验检测细胞侵袭能力,采用蛋白印迹法检测MAPK/ERK通路关键蛋白表达。结果 与正常肝细胞比,肝癌细胞和肝癌肿瘤干细胞（HepG2-CSCs）中BMP9表达上调（P<0.05）。HepG2 CSCs细胞中BMP9 mRNA和蛋白表达高于HepG2细胞（P...     

miR-5188在肝癌细胞中的作用及网络调控机制研究

目的 探究miR-5188在肝癌细胞中的作用及网络调控机制。方法过表达或敲低miR-5188表达后,检测肝癌细胞HepG2的增殖能力。利用miRNA靶基因预测数据库miRDB获取miR-5188潜在的靶基因,使用小干扰RNA(siRNA)敲低HepG2细胞中的上述靶基因后检测细胞增殖能力。采用实时荧光定量PCR法检测正常肝细胞LO2和HepG2细胞中mi R-5188、pre-miR-5188和pri-miR-5188的表达水平,并分析长链非编码RNA NEAT1（下文简称NEAT1）、NONO/PSF复合体对pri-miR-5188的影响。结果过表达mi R-5188后,HepG2细胞的增殖能力增强;敲低miR-5188表达后,HepG2细胞的增殖能力减弱,差异均有统计学意义（P均<0.05）。敲低DIDO1表达后,HepG2细胞的增殖能力增强;过表达DIDO1后,HepG2细胞的增殖能力减弱,差异均有统计学意义（P均<0.05）。过表达miR-5188后,HepG2细胞中DIDO1的表达水平降低;敲低miR-5188表达后,HepG2细胞中DIDO1的表达水平升高,差异...     

VEGF基因沉默对肝癌HepG2细胞侵袭和迁移的影响

目的观察VEGF基因沉默对人肝癌细胞株HepG2迁移和侵袭的影响。方法采用siRNA技术沉默HepG2细胞内血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因。体外成功构建针对VEGF的3种siRNA表达载体和1个阴性对照,分别命名为pGenesil-1-VEGF-shRNA-1、2、3和pGenesil-1-VEGF-shRNA-scramble。Lipofectamine 2000介导转染HepG2,用RT-PCR筛选出沉默效果最好的siRNA片断(pGenesil-1-VEGF-shRNA-2),将其重组质粒转染HepG2(观察组),以空质粒细胞(空载组)和空白细胞(空白组)作为对照。采用细胞创伤愈合试验、Transwell小室体外侵袭试验分别检测三组细胞迁移、侵袭能力。结果细胞创伤愈合试验显示,观察组细胞迁移速度为(3.02±0.03)μm/h,显著慢于空载组的(8.67±0.02)μm/h和空白组的(8.78±0.03)μm/h,P均<0.05;细胞侵袭试验显示,观察组穿膜细胞数为(14.0±1.3)个,显著低于空载组的(35.0±2.3)个和空白组的(36.0±2.5)个,P均<0.05。结论 VEGF基因沉默可抑制肝癌细胞株HepG2的迁移和侵袭能力。     

MiR-122通过靶向SIRT1抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭

目的?探讨微小RNA-122（microRNA-122, miR-122）通过靶向沉默信息调节因子1（silent information regulator 1, SIRT1）对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法?用实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR, RT-qPCR）法检测肝癌组织和细胞中miR-122和SIRT1 mRNA表达水平；用生物信息学和双荧光素酶报告基因分析并验证miR-122和SIRT1靶向关系。培养肝癌细胞HepG2，将其分为空白对照组（control组）、miR-122过表达阴性对照组（miR-NC mimic组）、miR-122过表达组（miR-122 mimic组）、miR-122过表达和SIRT1过表达阴性对照组（miR-122 mimic+pcDNA组）、miR-122过表达和SIRT1过表达组（miR-122 mimic+pcDNA-SIRT1组）。用细胞计数试剂（cell counting kit-8, CCK-8）和5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷分析各组细胞增殖情况；划痕愈合实验和Transwell实验分析各组细胞迁移和侵袭能力；用Western blot法分析各组细胞中增殖、迁移和侵袭相关蛋白p53、细胞周期蛋白D1、E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白和波形蛋白及SIRT1蛋白表达水平。结果?MiR-122表达水平在肝癌组织和细胞中下调，SIRT1 mRNA表达水平在肝癌组织和细胞中上调（P＜0.05）。MiR-122负靶向调控SIRT1表达（P＜0.05）。过表达miR-122抑制HepG2细胞增殖、迁移和侵袭，降低SIRT1、细胞周期蛋白D1、N-钙粘蛋白和波形蛋白蛋白水平，升高p53和E-钙粘蛋白蛋白水平（P＜0.05）。然而，SIRT1过表达可部分逆转过表达miR-122对HepG2细胞的作用（P＜0.05）。结论?MiR-122通过负靶向调控SIRT1抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭。     

分泌型卷曲相关蛋白2对HepG2细胞生物学行为的影响

目的 了解分泌型卷曲相关蛋白2(sFRP2)对HepG2细胞增殖、侵袭和迁移等生物学行为的影响.方法 采用sFRP2重组腺病毒感染HepG2细胞,四甲基偶氮唑盐法检测HepG2细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期分布,免疫组织化学法检测肿瘤转移相关因子的表达,Westernblot检测β连环素的表达,Tmnswell小室检测细胞迁移能力.结果 sFRP2明显抑制HepG2细胞增殖,限制细胞周期从Go/G<,1>期进入S期;sFRP2显著增强nepG2细胞CD44和CD82/KAI1等与肿瘤转移抑制相关蛋白的表达,而明显降低有助于肿瘤侵袭转移的细胞外基质金属蛋白酶诱导因子的表达; sFRP2可降低HepG2细胞的迁移能力.sFRP2感染前后,HepG2细胞均有β连环素的表达,且其表达差异无统计学意义.结论 sFRP2的重组腺病毒能成功感染HepG2细胞,并对H印G2细胞的增殖、侵袭和转移具有抑制效应.     

下调miR-421靶向Sirt3调控HepG2肝癌细胞生长和侵袭的机制研究

目的探讨下调miR-421靶向Sirt3调控肝癌细胞生长和侵袭的机制。方法 RT-PCR方法测定肝癌细胞和正常肝细胞中miR-421表达变化。在肝癌细胞中转染miR-421 inhibitor,MTT测定细胞增殖变化,Transwell小室检测细胞侵袭和迁移能力变化,Western blotting检测细胞中MMP-9和MMP-2蛋白表达变化。在线靶基因预测软件发现Sirt3可能是miR-421的靶基因,荧光素酶报告系统鉴定靶向关系。在肝癌细胞中共转染miR-421 inhibitor、Sirt3 siRNA,利用上述方法测定细胞增殖、侵袭、迁移能力和MMP-9、MMP-2蛋白表达水平。结果 miR-421在肝癌细胞中的表达水平高于正常肝细胞。miR-421 inhibitor转染后的肝癌细胞增殖能力下降,细胞侵袭和迁移能力降低,细胞中MMP-9和MMP-2蛋白表达减少。Sirt3受到miR-421的靶向负调控作用。Sirt3 siRNA能够逆转miR-421 inhibitor对肝癌细胞增殖、侵袭、迁移和MMP-9、MMP-2表达的抑制作用。结论下调miR-421靶向Sirt3抑制HepG2肝癌细胞生长和侵袭。     

小干扰RNA沉默甲胎蛋白基因对HepG2细胞迁移及侵袭的影响

目的研究甲胎蛋白(AFP)对肝癌HepG2细胞迁移和侵袭能力的影响及其机制。方法应用合成的靶向沉默AFP小干扰RNA(siRNA)转染肝癌HepG2细胞,分为空白对照、阴性对照组及AFP siRNA组,各组细胞干预48 h后,采用实时定量PCR(qRT-PCR)和ELISA法检测细胞转染后的沉默效率,Transwell小室实验检测沉默AFP基因后HepG2细胞的侵袭、迁移能力,用Western blotting法观察沉默AFP基因的表达对上皮-间质转化(EMT)相关蛋白(N-cadherin、Vimentin和E-cadherin)、AKT和p-AKT蛋白表达的影响。计量资料多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。结果转染沉默后,与空白对照组相比,AFP siRNA组中AFP mRNA的相对表达量明显降低(P 0.01),抑制率达86.440%,同时AFP siR NA组细胞上清液中AFP蛋白表达水平同样明显降低(P 0.01)。与空白对照组相比,AFP siRNA组的迁移细胞数和侵袭细胞数显著下降,差异具有统计学意义(P值均0.01)。沉默HepG2细胞中AFP基因的表达后,与空白对照组比较,AFP siRNA组EMT相关蛋白E-cadherin蛋白的表达水平升高(P 0.01),而N-cadherin及Vimentin表达水平均明显降低(P值均0.05),且PI3K/AKT信号通路相关蛋白p-AKT的表达水平明显降低(P 0.01)。结论沉默AFP可抑制肝癌细胞转移,基于HepG2细胞株的机制研究可能与阻断PI3K/Akt通路抑制EMT相关。     

葛花解酲方对肝癌细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡及上皮间质转化的影响

目的 探讨葛花解酲方含药血清对肝癌细胞侵袭、迁移和上皮间质转化的影响及其可能的作用机制。方法 以稳定高表达、高侵袭的HepG2肝癌细胞为体外研究模型,用不同浓度的葛花解酲方含药血清进行干预。CCK8法检测含药血清对HepG2细胞增殖的抑制作用,Transwell法观察含药血清对HepG2细胞的迁移和侵袭能力的影响,Western印迹法检测HepG2细胞中上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)和神经型钙黏蛋白(N-cadherin)表达水平。结果 CCK8法检测结果显示含药血清可显著抑制HepG2细胞的增殖,抑制作用呈时间和剂量依赖性(P<0.05)。不同浓度的含药血清可显著抑制HepG2细胞的迁移和侵袭,显著下调肝癌细胞中N-cadherin的表达,显著上调E-cadherin的表达(P<0.05)。结论 葛花解酲方含药血清能抑制肝癌细胞的侵袭、迁移,其作用机制可能与抑制上皮间质转化有关。     

NCEH1基因在肝癌组织与细胞系中的表达及生物学作用

目的了解中性胆固醇酯水解酶1(neutral cholesterol ester hydrolase 1,NCEH1)基因在肝癌组织及人肝癌细胞系中表达水平,观察NCEH1基因敲减对SMMC-7721人肝癌细胞系增殖、凋亡、侵袭及转移能力的影响。方法选取2013年1月—2019年6月在暨南大学附属广州红十字会医院手术治疗的32例肝癌患者标本及对应的癌旁组织,采用实时荧光定量PCR方法检测NCEH1基因的相对表达量。从ICGC数据库下载截至2020年9月份的肝癌样本基因表达数据,应用R软件整理数据,筛选出每个样本中NCEH1基因表达量,分别采用配对Wilcoxon符号秩检验和Wilcoxon秩和检验分析肝癌与癌旁组织间的差异。采用实时荧光定量PCR方法检测NCEH1基因在SMMC-7721、Bel-7402、HepG2、Hep3B人肝癌细胞系和HL7702正常人肝细胞系中的表达水平。通过慢病毒介导的小干扰RNA(siRNA)技术构建NCEH1基因敲减的SMMC-7721人肝癌细胞系,分为NCEH1敲减组(KD组)和阴性对照组(NC组),以实时荧光定量PCR法检测NCEH1基因的敲减效率,再以MTT检测实验、Annexin V-APC单染法流式细胞仪检测、划痕愈合实验、Transwell实验和Transwell侵袭小室实验检测2组SMMC-7721肝癌细胞的增殖、凋亡、转移和侵袭能力,采用t检验对两组间数据进行统计学分析。结果 NCEH1基因在肝癌组织中的平均表达量高于癌旁组织(本院标本Z=2263,P=0.024,ICGC数据库U=18 768,P 0.001)。NCEH1基因在中等侵袭转移潜能的SMMC-7721细胞系中的表达量最高;在低侵袭转移潜能的Bel-7402和HepG2细胞系中的表达水平次之,在无侵袭转移潜能的Hep3B细胞系中的表达水平最低。KD组SMMC-7721细胞中NCEH1基因的表达水平明显低于NC组(t=11.578,P=0.000 3),NCEH1基因的敲减效率高达740%。较之NC组,KD组细胞生长速度明显减缓(t=32.10,P 0.001);细胞凋亡率明显升高(t=27.303,P 0.001);迁移率、转移和侵袭细胞数均明显降低(t值分别为9.51、38.123、22.331,P值均0.001)。结论 NCEH1基因在肝癌组织及细胞系中的表达明显升高,且可促进肝癌细胞的生长增殖及侵袭转移并抑制凋亡,提示其可能是一个潜在的肝癌治疗靶点。     

HBx和癌胚抗原相关细胞黏附分子1在乙型肝炎相关性肝癌中的作用及病理特征

目的 探讨HBx和癌胚抗原相关细胞黏附分子1(CEACAM1)在乙型肝炎相关性肝癌中的表达及意义.方法 采用免疫组织化学方法(SP法)检测81份乙肝相关性肝癌组织中HBx及CEACAM1的表达情况,分析HBx和CEACAM1与乙肝相关性肝癌的临床病理特征.Western印迹检测人正常肝细胞系QZG、肝癌细胞HepG2及稳定转染HBx的肝癌细胞HepG2(HepG2-X)中CEACAM1的表达.结果 81份乙肝相关性肝癌组织中HBx表达阳性率为74.07％ (60/81),CEACAM1表达阳性率为71.60％ (58/81),二者与门静脉侵袭、淋巴结转移和TNM分期存在显著相关,HBx与CEACAM1的表达呈负相关(rs=-0.310,P＜0.01);在HepG2-X中,CEACAM1蛋白表达水平与肝癌细胞HepG2及人正常肝细胞系QZG相比显著降低.结论 HBx的高表达和CEACAM1的低表达与乙肝相关性肝癌的侵袭、转移密切相关,HBx有可能通过抑制CEACAM1的表达而诱导乙肝相关性肝癌的侵袭与转移.