Yes相关蛋白在胃腺癌中的表达及其下调对胃癌细胞增殖和转移的影响

目的 检测Yes相关蛋白(YAP)在人胃腺癌、胃腺瘤及正常胃黏膜组织中的表达,探讨YAP对胃癌细胞增殖和转移的作用及其分子机制.方法 免疫组织化学法和实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测YAP在78例人胃腺癌、39例人胃腺瘤及46例正常人胃黏膜组织的表达.利用建立慢病毒小发夹RNA(shRNA)靶向YAP基因的胃癌SGC-7901细胞株,Western blot法检测增殖细胞核抗原(PCNA)和基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的蛋白表达水平.噻唑蓝(MTT)比色法和Transwell试验检测YAP下调对胃癌细胞增殖和转移的影响.结果 YAP在69.23％的胃腺癌组织中高表达,与正常胃黏膜(0.33 ±0.15)和胃腺瘤(0.42 ±0.20)比较,YAP mRNA在胃腺癌(1.74±0.46)的表达水平明显增高(P＜0.001).体外实验显示,YAP下调减少PCNA和MMP-2蛋白的表达,并抑制胃癌细胞增殖活性和转移能力.结论 YAP在人胃腺癌组织中高表达,并且YAP下调抑制胃癌细胞的增殖和转移.     

慢病毒介导的miPSC-EC YAP基因过表达及稳定感染细胞系的建立

目的建立稳定过表达Yes相关蛋白(YAP)的小鼠诱导性多能干细胞来源的内皮细胞(miP SC-EC)系,为miP SC-EC过表达YAP基因的体内外实验研究奠定基础。方法将模板质粒(p CMV-Flag-YAP2-5SA)改建成慢病毒表达质粒(p PGK-2Flag-YAP2-Puro);将慢病毒表达质粒与包装质粒组成共包装系统转染293FT细胞;包装慢病毒,收集病毒原液,超滤浓缩,测定滴度。诱导miP SC分化为EC,观察其形态特征,并行组织化学鉴定。包装好的慢病毒感染miP SC-EC,嘌呤霉素筛选稳定感染的细胞系miP SC-EC/YAP,并用RT-PCR及Western blot方法验证。结果慢病毒表达质粒(p PGK-2Flag-YAP2-Puro)构建成功,并成功包装YAP基因过表达慢病毒,滴度达到1.2×109 TU/ml。miP SC诱导分化所得细胞符合EC形态特征,几乎都表达EC标志CD31。转染YAP的miP SC-EC中YAP m RNA表达水平较未转染细胞明显升高,YAP蛋白高表达(未转染细胞中YAP蛋白几乎不表达)。结论成功构建YAP基因慢病毒过表达载体,诱导miP SC分化为EC,成功建立YAP基因稳定感染细胞系miP SC-EC/YAP。     

Raptor调节前列腺癌上皮-间质转化机制研究

目的探讨Raptor调节前列腺癌上皮-间质转化(EMT)作用及机制研究。方法构建Raptor-shRNA慢病毒载体并筛选具有稳定转染Raptor-shRNA DU145细胞株,应用transwell观察沉默Raptor后DU145细胞株侵袭力的变化,Western Blot观察沉默Raptor后DU145细胞E-cadherin,β-catenin,N-cadherin和vimentin表达,以及RhoA活性表达。结果成功构建Raptor-shRNA DU145细胞株;transwell检测稳定转染Raptor-shRNA后DU145细胞侵袭力下降(P0.01);Western Blot检测显示该细胞株E-cadherin和β-catenin表达下降,N-cadherin和vimentin表达升高,RhoA活性表达下降。结论 Raptor与前列腺癌细胞EMT的发生有关,其作用可能是通过RhoA信号途径。     

左归丸和右归丸对大鼠脂肪干细胞增殖及成骨分化影响的比较

目的 比较左归丸、右归丸对大鼠脂肪干细胞( ASCs)增殖和成骨性分化的影响。方法 成年大鼠15只,随机分为3组,分别以左归丸(ZGW组)、右归丸(YGW组)和生理盐水(CON组)连续灌胃后制备含药血清。胶原酶消化法分离大鼠脂肪干细胞,成骨诱导21 d后,茜素红染色对细胞进行鉴定。分别采用CCK-8法、PNPP法测定加药诱导后ASCs的增殖能力及碱性磷酸酶表达差异;比色法检测细胞外钙离子浓度。Western Blot法测定加药诱导7d后的Runx2蛋白表达量。结果ASCs细胞呈长梭形生长,增殖旺盛;茜素红染色显示为阳性。CCK-8法检测结果显示,加药24 h及48 h时,YGW组OD值显著高于ZGW组及CON组(P<0.05);加药72 h时,ZGW组、YGW组OD值均显著高于CON组(P<0.05),而两个加药组间并无显著性差异(P > 0. 05)。PNPP检测结果显示,ZGW组、YGW组OD值均显著高于CON组(P<0.05);其中YGW组OD值显著高于ZGW组(P < 0. 05)。YGW组细胞外钙离子浓度显著升高(P < 0. 05 )。 Western Blot结果显示,YGW组Runx2蛋白表达显著上调(P<0.05)。结论 与滋肾阴法相比,温肾阳法在促进ASCs增殖及成骨分化方面均表现出明显优势。     

神经生长因子β亚基基因修饰大鼠脂肪源干细胞的构建

目的构建过表达神经生长因子β亚基(h NGFβ)大鼠脂肪源性干细胞(ADSCs),为基因修饰ADSCs移植治疗神经损伤性勃起功能障碍(ED)大鼠模型提供种子细胞。方法获取人NGFβ基因,并与线性化的慢病毒载体p LV5-EGFP定向克隆连接。构建p LV5-h NGFβ-EGFP穿梭质粒转染HEK293T细胞,采用Western Blot检测h NGFβ基因在HEK293 T细胞中的表达情况。利用LV5慢病毒包装系统包装产生重组慢病毒,包装后扩增纯化并测定病毒滴度。h NGFβ基因重组慢病毒转染大鼠ADSCs,观察EGFP表达情况,用Western Blot检测h NGFβ基因表达情况。结果经实时荧光定量(PCR)鉴定、限制性酶切分析、测序鉴定和目的质粒Western Blot表达检测鉴定,证实p LV5-h NGFβ-EGFP重组慢病毒载体构建成功。重组慢病毒包装成功且病毒滴度为1.0×10~9 PFU/ml。Western Blot于大鼠ADSCs中检测到约13.5 KDa大小条带,其与h NGFβ蛋白分子量大小相一致。结论h NGFβ基因修饰的ADSCs构建成功,从而为基因修饰ADSCs移植治疗ED提供了良好的基因工程细胞。     

慢病毒介导的KLF5转染对RKO细胞增殖和侵袭的影响

目的 构建Kruppel-like factor 5(KLF5)慢病毒载体并转染人结肠癌RKO细胞中,观察KLF5对结肠癌细胞RKO生物学行为的影响.方法 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从人小肠黏膜中扩增出KLF5基因编码区1374 bp的片段,随后将扩增KLF5片段插入慢病毒转移载体pCDH-CMV-KLF5 -Efl -copGFP,构建KLF5-pCDH-CMV-KLF5-EF1-copGFP.在脂质体介导下将构建成功的重组慢病毒转染人胚肾细胞株(293T)包装生产慢病毒,测定病毒滴度,感染结肠癌RKO细胞.RT-PCR和Western blot法分别检测KLF5 mRNA和蛋白的表达.随后将实验分为空白对照组和实验转染组进行实验.细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测转染前后RKO细胞增殖的变化以及Transwell实验检测转染前后细胞增殖和侵袭能力的变化.结果 成功合成KLF5-pCDH-CMV-KLF5-EF1 -copGFP并转染入RKO细胞中.RT-PCR以及Western blot结果提示与对照组比较,KLF5-pCDH-CMV-KLF5-EF1 -copGFP成功在RKO细胞中得到合成和表达.同时高表达的KLF5可以明显抑制RKO细胞的增殖(P＜0.05).另外KLF5可以明显抑制RKO细胞的迁移能力(50.26±2.17比25.12 ±2.27,t=17.66,P＜0.05)和侵袭能力(45.48±1.53比22.13 ±2.25,t=3.37,P＜0.05).结论 KLF5可以有效抑制结肠癌RKO细胞的增殖、迁移和侵袭.     

靶向RNA干扰骨桥蛋白基因的慢病毒载体对血管平滑肌细胞增殖凋亡的影响

目的 构建大鼠骨桥蛋白(OPN)基因的shRNA慢病毒表达载体,并观察其对大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)增殖和凋亡的影响.方法 针对OPN基因的不同部位设计3对shRNA的寡核苷酸片段,克隆到慢病毒载体PLKO.1中,构建靶向OPN基因的慢病毒载体PLKO.1-OPN-shRNA,检测并筛选最佳抑制效率的shRNA干扰载体.并将其转染大鼠血管平滑肌细胞,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测VSMCs OPN mRNA表达水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测VSMC OPN蛋白表达水平;噻唑蓝(MTT)比色法和流式细胞仪检测沉默OPN基因后对VSMC增殖和凋亡能力的影响.结果 靶向OPN慢病毒表达载体构建成功.重组慢病毒载体PLKO.1-OPN-shRNA转染后可显著抑制VSMCs的OPN mRNA及蛋白的表达水平,OPN蛋白表达明显下降,其中以PLKO.1-OPN2-shRNA最为明显,达到90％以上;转染PLKO.1-OPN2-shRNA后72 h的细胞增殖能力[吸光度(A)值=0.365 ±0.011]明显低于未处理组(A值=0.941±0.028)和阴性对照组细胞(A值=0.941±0.040,P＜0.05);而早期细胞凋亡率(20.44±2.69)％和晚期细胞凋亡率(16.79±1.01)％均明显高于未转染组和阴性对照组(P＜0.01).结论 成功构建并筛选最佳抑制效率的靶向OPN慢病毒表达载体PLKO.1-OPN2-shRNA,该载体能有效抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖,并促进细胞凋亡.     

RhoA/SRF信号通路介导Nelin诱导人血管平滑肌细胞表型转化

目的 探讨Nelin基因对人血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)表型转化的调控机制.方法 应用过表达慢病毒载体[Nelin-VSMC]及干扰慢病毒载体[LV-Nelin-SiRNA-VSMC]制备稳定转染的VSMC细胞模型,通过荧光定量PCR以及蛋白质印迹分析(Western blotanalysis,WB)等技术手段,观察Nelin蛋白过表达及表达抑制对人VSMC表型转化的影响及其调控机制.结果 Nelin-VSMC组细胞呈收缩表型,细胞细长,成“谷-峰”样生长,Nelin mRNA、Nelin蛋白和平滑肌分化标志蛋白平滑肌α-肌动蛋白(SMoα-actin)表达显著增加,同时SMα-actin相关调控因子-血清反应因子(SRF)入核转位,RhoA总蛋白表达上调,经Rho激酶特异性抑制剂Y-27632作用后,SRF在细胞核中表达显著减少,同时SMα-actin表达下调;LV-Nelin-SiRNA-VSMC组细胞呈合成表型,细胞体积变大,细胞极性消失,生长状态无序,Nelin mRNA、Nelin蛋白和SMα-actin蛋白表达显著降低,同时伴有SRF出核转位及RhoA总蛋白表达下调.结论 在体外培养的人VSMC中,Nelin依次激活SMα-actin蛋白相关调控因子RhoA和SRF引起SMα-actin表达增加,促进VSMC向收缩表型转换.     

核因子E2相关因子2过表达对间充质干细胞抗缺氧和抗凋亡能力的影响

目的研究核因子E2相关因子2(Nrf2)对间充质干细胞(MSCs)的抗缺氧及抗凋亡能力的影响。方法将过表达Nrf2的重组质粒及辅助质粒转染人胚肾细胞(293FT),获得过表达Nrf2的高滴度慢病毒。MSCs分别转染过表达Nrf2慢病毒以及空载体慢病毒,构建稳定过表达Nrf2的Nrf2-MSCs(Nrf2过表达组)以及绿色荧光蛋白(GFP)-MSCs(对照组)。采用荧光显微镜观察两组细胞的绿色荧光表达情况。采用蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测两组细胞中Nrf2蛋白的表达水平。采用光学显微镜观察两组细胞的抗缺氧能力,采用流式细胞术检测两组细胞的抗凋亡能力。结果成功构建了稳定过表达Nrf2的Nrf2-MSCs,Western Blot法检测结果显示Nrf2过表达组细胞的Nrf2蛋白表达水平明显高于对照组(P0.01)。缺氧处理15 h后,Nrf2过表达组的细胞活力明显高于对照组。流式细胞术检测表明Nrf2过表达组细胞的凋亡率为(30.9±1.4)%,明显低于对照组细胞的(61.3±1.3)%(P0.05)。结论稳定过表达Nrf2的Nrf2-MSCs在低氧环境中具有一定的抗缺氧、抗凋亡能力。     

基质细胞衍生因子1对于血管内皮细胞增殖影响及其相关机制研究

目的探讨人退变髓核细胞(nucelus pulposus cells,NPCs)分泌的基质细胞衍生因子1(stromal cell derived factorl,SDF-1)对血管内皮细胞(vascular endothelial cells,VECs)的增殖影响及其相关分子机制。方法将术中摘取的椎间盘组织分离、培养人退变NPCs,取第1代转染SDF-1过表达慢病毒。取第2代细胞,转染或未转染过表达SDF-1慢病毒后,种植于alvetex?三维培养支架上行三维培养,并与人HMEC-1细胞(即VECs)共培养。共培养72 h扫描电镜观察NPCs在支架上的生长情况;细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)法分别检测12、24、48、72 h转染组与非转染组HMEC-1增殖情况,以及加入Akt特异性抑制剂GSK690693后24 h HMEC-1增殖情况;膜联蛋白Ⅴ/碘化丙啶法分别检测共培养72 h后转染组和非转染组中VECs凋亡率;ELISA法分别检测转染组和非转染组培养基中VEGF含量;Western blot法检测转染组、未转染组和抑制剂组磷酸化Akt(p-Akt)和总Akt蛋白表达。结果扫描电镜观察示NPCs在三维支架中维持了细胞表型,分泌大量细胞外基质;慢病毒成功转染后,Western blot检测示SDF-1在NPCs中表达明显升高。在共培养体系中,NPCs过表达SDF-1后可使HMEC-1增殖上升,凋亡率下降,并在细胞外培养基检测中发现VEGF含量显著上升;而在进一步分子机制检测中发现,SDF-1的过表达使HMEC-1中p-Akt水平升高,采用GSK690693特异性抑制Akt表达后,SDF-1对HMEC-1促细胞增殖作用明显降低。结论人退变NPCs高表达的SDF-1有利于VECs增殖,这一调控机制或许与SDF-1-Akt信号通路有关。     

Expression of connective tissue growth factor in human renal fibroblasts: regulatory roles of RhoA and cAMP

The induction of connective tissue growth factor (CTGF) was investigated in a human renal fibroblast cell line that exhibited many characteristics of primary human renal fibroblasts. Induction of CTGF mRNA was observed after treatment of the cells with transforming growth factor-beta (TGF-beta) or, even more prominently, lysophosphatidic acid (LPA). LPA induced a rapid transient increase in CTGF mRNA expression, with maximal levels being observed after 1 to 2 h. This increase was accompanied by CTGF protein synthesis. Induction of CTGF was insensitive to pertussis toxin and was not dependent on the activation of p42/44 mitogen-activated protein kinases. Inhibition of the proteins of the Rho family with toxin B from Clostridium difficile abrogated basal and LPA-mediated induction of CTGF. Specific targeting of RhoA with C3 exotoxin or of the Rho kinases with the inhibitor Y-27632 similarly prevented induction of CTGF, implicating RhoA as a signaling module downstream of LPA. Inhibition of RhoA depolymerized the actin cytoskeleton, as did treatment with cytochalasin D. Preincubation of the human renal fibroblasts with cytochalasin D prevented induction of CTGF by LPA, indicating a strong contribution of an intact cytoskeleton. Interference with RhoA signaling similarly inhibited the induction of CTGF by TGF-beta. Elevation of intracellular levels of cAMP and thus activation of protein kinase A prevented induction of CTGF expression. The cytoskeletal effects of cAMP, however, were reversed by LPA. These data indicate complex interactions involving LPA-mediated activation of RhoA- and protein kinase A-dependent signaling pathways. The data thus demonstrate the regulatory functions of the small GTPase RhoA and of an intact cytoskeleton in the expression of CTGF after stimulation with LPA or TGF-beta. Analogous signal transduction pathways were previously demonstrated in rat mesangial cells, suggesting a more general role for RhoA in the regulation of CTGF expression.     

长链非编码RNA-MALAT1在高糖诱导的人腹膜间皮细胞纤维化过程中的作用

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)- MALAT1在人腹膜间皮细胞(HPMCs)高糖损伤导致的腹膜纤维化中的作用。 方法将永生化的HPMCs分为对照组及高糖(50 mmol/L葡萄糖)刺激1、3、5、7 d组,使用实时荧光定量PCR及Western印迹方法,检测MALAT1、表型转换及纤维化相关分子E-钙黏素(E-cad)、ɑ-平滑肌肌动蛋白(ɑ-SMA)、胶原蛋白I(ColⅠ)、胶原蛋白Ⅲ(Col Ⅲ)、纤连蛋白(Fn)、结缔组织生长因子(CTGF)在mRNA及蛋白水平的表达变化;给予HPMCs转染MALAT1的过表达慢病毒,检测MALAT1、表型转换及纤维化相关分子E-cad、ɑ-SMA、ColⅠ、ColⅢ、Fn、CTGF在mRNA及蛋白水平的表达变化;给予高糖刺激72 h后的HPMCs转染MALAT1siRNA,再检测以上成分的mRNA及蛋白水平的表达变化。采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析。 结果高糖刺激HPMCs后,随时间的延长,MALAT1及间质标志分子ɑ-SMA、纤维化相关分子ColⅠ、ColⅢ、Fn、CTGF的表达明显增加与对照组比较差异有统计学意义(mRNA水平MALAT1、α-SMA、ColⅠ、ColⅢ、Fn、CTGF第7天时分别为t＝ 7.080、t＝6.325、t＝7.205、t＝11.70、t＝5.739、t＝9.221,P<0.05;蛋白水平α-SMA、ColⅠ、ColⅢ、Fn、CTGF第7天时分别为t＝3.429、t＝3.846、t＝5.274、t＝3.751、t＝4.093,P<0.05),上皮标志分子E-cad mRNA及蛋白水平表达逐渐下降(第7天时mRNA t＝7.270、P＝0.0019,蛋白水平t＝5.658、P＝0.0048);慢病毒转染使MALAT1上调后,MALAT1、ɑ-SMA、ColⅠ、ColⅢ、Fn、CTGF的表达增加(mRNA水平MALAT1 α-SMA、ColⅠ、ColⅢ、Fn、CTGF分别为t＝7.151、t＝6.495、t＝6.068、t＝8.660、t＝5.283、t＝3.230,P<0.05;蛋白水平α-SMA、ColⅠ、ColⅢ、Fn、CTGF分别为t＝3.980、t＝3.623、t＝3.351、t＝4.965、t＝5.804,P<0.05),E-cad表达下降(mRNA水平t＝5.511,P＝0.0053;蛋白水平t＝6.397, P＝0.0031);使用siRNA下调MALAT1后,MALAT1、ɑ-SMA、ColⅠ、ColⅢ、Fn、CTGF的表达下降(mRNA水平MALAT1、ɑ-SMA、ColⅠ、ColⅢ、Fn、CTGF分别为t＝2.854、t＝5.511、t＝3.442、t＝2.442、t＝4.407、t＝6.556,P< 0.05;蛋白水平ɑ-SMA、ColⅠ、ColⅢ、Fn、CTGF分别为t＝3.241、t＝7.589、t＝7.427、t＝4.319、t＝3.976,P< 0.05), E-cad表达增加(mRNA水平t＝2.865、P＝ 0.0457;蛋白水平t＝2.823、P＝0.0477)。 结论MALAT1参与高糖刺激所引起的HPMCs的纤维化过程,并且可以促进腹膜纤维化的发生。     

CTGF对破骨前体细胞RAW264.7增殖及碳酸酐酶Ⅱ分化的影响

目的研究结缔组织生长因子(CTGF)对体外培养的破骨细胞前体细胞RAW264.7增殖及对核因子Kappa B配体受体(RANKL)诱导体外培养的破骨细胞前体细胞RAW264.7分化为成熟多核破骨细胞的影响。方法使用200 ng/mLCTGF干预培养的破骨细胞前体细胞RAW264.7,采用3H-TdR掺入法检测RAW264.7细胞增殖率;使用200 ng/mL CTGF与RANKL单独或共同处理RAW264.7细胞,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色观察TRAP阳性多核细胞,Western blot检测碳酐酶Ⅱ蛋白的表达。结果 CTGF可显著促进RAW264.7细胞增殖;200 ng/mLCTGF与RANKL共同处理RAW264.7细胞可促进RAW264.7细胞分化为成熟多核破骨细胞;200 ng/mL CTGF与RANKL共同处理RAW264.7细胞可促进RAW264.7细胞碳酐酶Ⅱ蛋白的表达。结论 CTGF促进体外培养的破骨细胞前体细胞RAW264.7增殖,促进RANKL诱导的破骨细胞前体细胞RAW264.7分化为成熟多核破骨细胞。     

神经纤维瘤组织中致纤维化生长因子和胶原的表达

目的：观察结缔组织生长因子（CTGF）在神经纤维瘤组织中的表达情况及与其上、下游效应基因表达的关系,探讨CTGF在神经纤维瘤组织中的促纤维化机制。方法：收集神经纤维瘤组织、瘢痕疙瘩组织及正常皮肤组织标本,免疫组化检测CTGF的表达,逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）方法检测组织CTGF、TGF-β1、Ⅰ型胶原（ColⅠ）及Ⅲ型胶原（ColⅢ）mRNA表达,Western blotting检测组织CTGF蛋白的表达。结果：免疫组织化学染色发现,CTGF在瘤细胞中有强阳性表达,在汗腺和皮脂腺细胞中有阳性表达。神经纤维瘤组织及瘢痕疙瘩组织中CTGF、TGF-β1、ColⅠ和ColⅢ的mRNA过表达,而正常皮肤组织无或仅有极弱表达。Western blotting结果显示神经纤维瘤组织有明显的CTGF蛋白表达条带。结论：在神经纤维瘤发病过程中,CTGF可能是重要的调控因子之一,与TGF-β1协同促进细胞外基质合成。     

YAP 基因干扰对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨干扰YAP基因的表达对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响。 方法：通过逆转录病毒介导的方法,分别用YAP shRNA（实验组）或阴性对照shRNA（对照组）转染MCF-7乳腺癌细胞,用qRT-PCR和Western blot方法检测干扰效率;溴脱氧核苷尿嘧啶（BrdU）结合实验和MTT法检测细胞增殖活性;流式细胞术和DAPI染色检测细胞凋亡情况。 结果：干扰效率检测显示,转染72 h后,实验组MCF-7细胞YAP mRNA表达量明显降低（P<0.05）,同时YAP蛋白表达也明显下调;细胞增殖检测显示,与对照组比较,实验组MCF-7细胞BrdU结合与OD值明显降低（P<0.05）,转染后24、48、72 h增殖抑制率分别为19.1%、38.5%、53.5%;凋亡检测显示,实验组细胞凋亡率与凋亡细胞数较对照组明显增加（均P<0.05）。 结论：干扰YAP基因的表达能有效抑制乳腺癌细胞的增殖并促进凋亡,YAP可能是乳腺癌潜在治疗靶点。     

结缔组织生长因子对Kupffer细胞诱导的肝星状细胞激活的影响

目的 探讨肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)表达对Kupffer细胞(Kc)诱导的HSC激活的影响.方法 构建含CTGF的RNA干扰载体.将肝星状细胞系rHSC-99分为3组:对照组、空载体组和RNA干扰组.采用RT-PCR方法 检测HSC的CTGF表达.分离培养KC,建立各组HSC与KC的共培养体系,MTT检测HSC的增殖情况;RT-PCR检测HSC的TGF-β1、I型前胶原的表达;Western Blot检测HSC的TGF-β1表达,ELISA检测共培养上清中I型胶原的表达;免疫荧光化学检测HSC的α-SMA的表达. 结果 构建CTGF的RNA干扰载体Psilencer 3.1H1-Neo-CTGF.RNA干扰后CTGF表达降低22%.KC得率为5×107,活率＞98%.在HSC和KC共培养体系中,RNA干扰HSC的CTGF表达后,与KC共培养的HSC活化和增殖明显被抑制,与对照组相比,HSC的增殖降低29%(t:20.17,P＜0.01).Ⅰ型前胶原和α-SMA的表达下降38%,细胞培养上清中Ⅰ型胶原的分泌量下降48%(t=12.18,t=7.81,t=15.96,均P＜0.05).TGF-β表达则没有明显的变化.结论 阻断HSC的CTGF表达能抑制由KC诱导的HSC激活.     

Simvastatin inhibits transforming growth factor‐β1‐induced expression of type I collagen,CTGF, and α‐SMA in keloid fibroblasts

Simvastatin, a 3‐hydroxy‐3‐methylglutaryl coenzyme‐A reductase inhibitor, is used to reduce cholesterol levels. Accumulating evidence has revealed the immunomodulatory and anti‐inflammatory effects of simvastatin that prevent cardiovascular diseases. In addition, the beneficial effects of statins on fibrosis of various organs have been reported. However, the functional effect of statins on dermal fibrosis of keloids has not yet been explored. The objective of this study was to determine whether simvastatin could affect dermal fibrosis associated with keloids. We examined the effect of simvastatin on transforming growth factor (TGF)‐β1‐induced production of type I collagen, connective tissue growth factor (CTGF or CCN2), and α‐smooth muscle actin (α‐SMA). Keloid fibroblasts were cultured and exposed to different concentrations of simvastatin in the presence of TGF‐β1, and the effects of simvastatin on TGF‐β1‐induced collagen and CTGF production in keloid fibroblasts were determined. The type I collagen, CTGF, and α‐SMA expression levels and the Smad2 and Smad3 phosphorylation levels were assessed by Western blotting. The effect of simvastatin on cell viability was evaluated by assessing the colorimetric conversion of 3‐[4,5‐dimethylthiazol‐2‐yl]‐2,5‐diphenyltetrazolium bromide. Simvastatin suppressed TGF‐β1‐induced type I collagen, CTGF, and α‐SMA production in a concentration‐dependent manner. The TGF‐β1‐induced Smad2 and Smad3 phosphorylation levels were abrogated by simvastatin pretreatment. The inhibition of type I collagen, CTGF, and α‐SMA expression by simvastatin was reversed by geranylgeranyl pyrophosphate, suggesting that the simvastatin‐induced cellular responses were due to inhibition of small GTPase Rho involvement. A RhoA activation assay showed that preincubation with simvastatin significantly blocked TGF‐β1‐induced RhoA activation. The Rho‐associated coiled kinase inhibitor Y27632 abrogated TGF‐β1‐induced production of type I collagen, CTGF, and α‐SMA. However, Y27632 had no significant effect on TGF‐β1‐induced phosphorylation of Smad2 and Smad3. In conclusion, the present study suggests that simvastatin is an effective inhibitor of TGF‐β1‐induced type I collagen, CTGF, and α‐SMA production in keloid fibroblasts.     

胶质细胞源性神经营养因子慢病毒载体体外转染嗅鞘细胞MOI值的研究

目的 探讨胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)慢病毒载体(lentivirus vector)体外转染嗅鞘细胞(OECs)并能稳定表达目的 蛋白的最佳感染复数(MOI).方法 构建GDNF-lentivirus,体外转染293T细胞,获得高滴度的慢病毒浓缩液,测定病毒滴度达2×108 TU/ml.不同MOI的情况下,GDNF-lentivirus体外转染OECs,Western blot检测GDNF的表达.结果 相差显微镜明视野下动态观察转染后的OECs生长状态良好,荧光显微镜下见大量绿色荧光蛋白(GFP)标记的转染成功的OECs.MOI=100时,OECs的转染率最高,约为75%,MOI=50时约为68%,MOI=10和MOI=1时分别为25%和13%,阴性对照组未见有绿色荧光表达.转染后第5天,收集OECs进行Western blot检测,MOI=100和MOI=50时GDNF表达最强,两者差异无统计学意义(P＞0.05),MOI=10表达较少,而MOI=1表达最少,对照组无GDNF表达.结论 GDNF-lentivirus在体外既能高效转染OECs又不影响细胞活性,且转染后的OECs可以长期稳定表达GDNF的适宜MOI为50～100之间.     

miR-21在TGF-β1引起的肝卵圆细胞上皮间质转化中的作用

[摘 要] 目的 探讨microRNA-21（miR-21）在TGF-β1引起的肝卵圆细胞（hepatic oval cell,HOC）上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition,EMT）中的作用。方法 体外培养大鼠肝卵圆细胞,用10 ng/mL TGF-β1刺激HOC 1、3、5、7 d后,Western blotting检测EMT相关蛋白（E-cadherin、N-cadherin和Vi-mentin）表达情况;用10 ng/mL TGF-β1刺激HOC 5 d后,实时荧光定量PCR检测miR-21的表达情况;分别用miR-21增强和抑制慢病毒转染HOC构建稳定的细胞株,PCR检测miR-21的表达情况;接着用TGF-β1刺激miR-21抑制慢病毒转染的HOC 5 d,Western blotting检测E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表达;用miR-21增强慢病毒转染HOC后,Western blotting检测E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表达。结果 TGF-β1刺激HOC 1、3、5、7 d后,E-cadherin逐渐减低,N-cadherin和Vimentin逐渐升高。TGF-β1刺激HOC 5 d后miR-21的表达增强了4.32倍。分别用增强和抑制慢病毒转染HOC后,miR-21的表达增强了3.82倍和抑制了0.22倍。下调miR-21表达后,TGF-β1致HOC的EMT作用减弱。miR-21过表达后,HOC发生了EMT。结论 抑制miR-21的表达可以减少TGF-β1引起的HOC的EMT作用,从而减轻肝纤维化。