猪带绦虫Ts14-3-3.2重组蛋白诱导小鼠免疫应答的研究

目的 观察猪带绦虫Ts14-3-3.2重组蛋白在小鼠体内诱导的免疫应答情况。方法 将60只雌性昆明小鼠随机分为5组,分别为Ts14-3-3.2重组蛋白50 μg剂量组、100 μg剂量组和150 μg剂量组以及弗氏佐剂对照组和磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)对照组,于首次免疫后0 d、28 d、56 d收集血清和脾淋巴细胞,采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测血清中特异性IgG及其亚类(IgG1、IgG2a)水平,采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测脾淋巴细胞增殖反应,以及通过ELISA法检测脾淋巴细胞培养上清液中IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10水平。结果 Ts14-3-3.2重组蛋白免疫昆明小鼠后,50 μg、100 μg和150 μg剂量组血清特异性IgG、IgG1和IgG2a水平均在首免后28~56 d内升高且56 d均高于28 d,均呈现剂量-效应关系;脾淋巴细胞增殖水平和脾淋巴细胞培养上清液IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10水平在28~56 d升高(IL-10在56 d恢复至正常水平),均在28 d达到峰值,均呈现剂量-效应关系。结论 Ts14-3-3.2重组蛋白可诱导小鼠产生特异性的细胞免疫和体液免疫应答,并呈现剂量-效应关系。     

阿苯达唑联合IFN-α抗小鼠细粒棘球蚴病的实验研究

目的 在BALB/c小鼠体内评价阿苯达唑(ABZ)联合干扰素(interferon, IFN)-α对于CE的治疗效果。方法 Balb/c小鼠原头蚴腹腔继发感染5个月后,小鼠被随机分配到4组:ABZ组、IFN-α组、ABZ+IFN-α组和未经处理对照组。不同处理组分别给药2个月。在治疗的第0、7、14、28、36、48、60 d从小鼠尾静脉采血检测血清中抗体水平变化。治疗结束后处死小鼠,检测相关指标评价治疗效果。结果 与对照组(P<0.01)或ABZ组(P<0.05)相比,ABZ+IFN-α组包囊的数量、大小及重量都显著减少。对不同处理组的包囊进行透射电镜观察(TEM)发现,ABZ+IFN-α组的包囊的超微结构发生了明显的改变。ELISA实验结果表明,ABZ+IFN-α组的血清与脾细胞分泌的白细胞介素(interleukin, IL)-10显著下降(P<0.01);血清中IgE、IgG抗体及其亚型浓度与对照组相比显著降低(P<0.01)。结论 本研究证实ABZ联合IFN-α可能成是一种有效的CE治疗方案。     

应用RNAi技术探讨CAP10基因在新型隐球菌感染小鼠中对Th1-Th2型免疫的影响

目的 设计siRNA表达质粒干扰CAP10基因的合成,将siRNA干扰前与干扰后的新型隐球菌菌液经呼吸道感染小鼠分别建立动物模型,行组织病理学检查与细胞因子检测,探讨CAP10基因对Th1/Th2 免疫应答的影响。方法 建立小鼠吸入感染隐球菌模型,在感染后第7 d(急性期),PAS染色观察小鼠肺组织病理变化,并采用酶联免疫吸附试验定量检测小鼠血液中的Th1(IFN-γ、TNF-α)、Th2细胞因子(IL-10)水平。结果 急性期小鼠血液内IFN-γ、TNF-α及IL-10浓度测定分别为:对照组(uninfected组)(19.24±1.31)pg/mL,(36.94±2.04)pg/mL及(18.32±3.00)pg/mL,新型隐球菌未干扰组(WT组)(14.34±1.26)pg/mL,(25.37±1.37)pg/mL及(72.96±8.83)pg/mL,新型隐球菌干扰组(siRNA-CAP10组)(14.63±0.95)pg/mL,(26.22±1.55)pg/mL及(38.73±4.61)pg/mL。与对照组相比,WT组和siRNA-CAP10组Th1因子IFN-γ及TNF-α水平明显降低(P<0.01),Th2细胞因子IL-10水平明显增高。WT组与siRNA-CAP10组相比,IFN-γ及TNF-α水平未见明显增高而IL-10水平明显增高(P<0.01)。IFN-γ/IL-10及TNF-α/IL-10的比率分别为:对照组1.08±0.21,2.07±0.34,WT组0.20±0.03,0.35±0.05,siRNA-CAP10组0.38±0.04,0.69±0.09。WT组和siRNA-CAP10组IFN-γ/IL-10及TNF-α/IL-10的比率较对照组明显减少(P<0.01);WT组IFN-γ/IL-10及TNF-α/IL-10的比率亦明显低于siRNA-CAP10组(P<0.01)。结论 在新型隐球菌感染小鼠中,CAP10基因的表达与抗真菌的免疫反应有关,其下调有利于控制新型隐球菌播散,有利于Th1/Th2比率趋于平衡,在调节炎症反应方面有重要作用,有望成为新的分子治疗靶点。     

视频化健康教育在乙型肝炎病毒相关性肾炎患者中的应用效果研究*

目的 研究视频化健康教育在乙型肝炎病毒相关肾炎（HBV-GN）患者中的应用效果。方法 2014年12月~2016年12月我院肾内科收治的HBV-GN患者61例,采用随机数字表法将患者分为对照组30例和观察组31例。给予对照组常规健康教育,在观察组,给予视频化健康教育,观察24 w。采用ELISA法检测血清γ干扰素（IFN-γ）和白细胞介素-4（1L-4）。采用Zung抑郁自评量表（SDS）和焦虑自评量表（SAS）进行焦虑和抑郁评分。结果 干预后,观察组患者血肌酐（sCr）水平为（214.6±111.2）μmol/L,明显低于对照组的[（365.4±103.9） μmol/L,P<0.01];24 h尿蛋白定量为（0.5±1.2） g/L,显著低于对照组的[（1.2±1.1）g/L,P<0.05];血清IL-4水平为（67.9±15.5） pg/L,显著低于对照组的 [（89.±29.7） pg/L,P<0.05],而IFN-γ水平为（49.6±12.1） pg/L,显著高于对照组的[（30.2±11.4） pg/L,P<0.05];观察组患者SAS和SDS评分分别为（35.6±4.2）和（40.3±3.2）,显著低于对照组[分别为（43.6±4.7）和（47.9±5.8）,P<0.05]。结论 视频化健康教育能够帮助改善HBV-GN患者肝肾功能,降低血清细胞因子水平,减轻患者焦虑和抑郁情绪。     

恩替卡韦与水飞蓟宾胶囊联合治疗慢性乙型肝炎患者临床效果分析

目的 探讨恩替卡韦与水飞蓟宾胶囊联合治疗慢性乙型肝炎患者的临床效果。 方法 2015年6月~2016年7月我院收治的140例慢性乙型肝炎患者,按照随机分组法将所有患者分为观察组（n=70)和对照组（n=70）。对照组患者口服恩替卡韦片治疗,在观察组,采用恩替卡韦片联合水飞蓟宾胶囊治疗。采用时间分辨免疫荧光法检测血清HBeAg,采用荧光定量PCR法检测血清HBV DNA,采用ELISA法检测血清白细胞介素-6 （IL-6）、TNF-α）和转化生长因子-β （TGF-β,使用FACSCalibur流式细胞仪检测外周血淋巴细胞亚群。 结果 在治疗24 w末,观察组临床症状如乏力、食欲不振、腹胀复常率分别为87.1%、90.0%、82.9%,显著高于对照组的41.4%、71.4%、58.6% （P<0.05）;观察组血清HBeAg和HBV DNA转阴率分别为0.0%和88.6%,与对照组的0.0%和68.6%比,无统计学差异（P>0.05）;观察组血清TBIL、ALT和AST水平分别为（16.49±3.17） μmol/L、（47.36±8.24） U/L和（40.58±5.26） U/L,显著低于对照组的（23.56±3.48） μmol/L、（68.25±7.93） U/L和（66.24±8.24） U/L（P<0.05）;观察组血清IL-6、TNF-α和TGF-β水平分别为（204.8±27.4） μg/L、（68.2±12.5） μg/L和（158.2±15.2） μg/L,显著低于对照组的（264.2±29.2） μg/L、（107.4±13.7） μg/L和（193.5±17.3） μg/L （P<0.05）;观察组外周血CD4+细胞百分比和CD4+/CD8+细胞比值分别为（40.36±3.61）%和（1.50±0.32）,显著高于对照组的【（33.46±3.17） %和（1.33±0.27）,P<0.05】。 结论 恩替卡韦片与水飞蓟宾胶囊联合治疗慢性乙型肝炎患者效果确切,可有效抑制HBV DNA复制,缓解机体炎症反应,提高患者的免疫功能。     

灯盏花素对肝脏缺血再灌注损伤大鼠肝脏和肠黏膜屏障功能的保护作用*

目的 探讨灯盏花素对肝脏缺血再灌注损伤（IRI）大鼠肝脏和肠黏膜屏障功能的保护作用。方法 随机将45只SD大鼠分为对照组、模型组和灯盏花素干预组,制备肝脏缺血再灌注损伤和肠缺血再灌注损伤模型,采用ELISA法检测肠黏膜分泌型（S）IgA和血浆内毒素水平,检测肠组织诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）、内皮型一氧化氮合成酶 （eNOS）和一氧化氮（NO）水平,使用试剂盒检测血浆降钙素原（ PCT）、二胺氧化酶（DAO）、TNF-α和IL-1β,采用Western Blotting法检测肝组织Toll样受体-4（TLR4）和核因子（NF）-κB表达水平。结果 模型组大鼠肠粘膜SlgA水平为（0.2±0.1）μg/kg,显著低于对照组【（0.7±0.1）μg/kg,P<0.01】,血清内毒素水平为（0.8±0.1）EU/ml,显著高于对照组【（0.2±0.1） EU/ml,P<0.01】,肠组织iNOS为（0.7±0.1） U/g,显著高于对照组 【（0.2±0.1） U/g,P<0.01】,而eNOS为（0.2±0.1） U/g,显著低于对照组【（0.4±0.1）U/g,P<0.01】, NO为（0.2±0.1）μmol/g,显著低于对照组【（0.4±0.0）μmol/g,P<0.01】, PCT为（5.0±1.2） ng/ml,显著高于对照组【（3.5±0.98）ng/ml,P<0.01】,DAO为（10.5±1.6） Ku/l,显著高于对照组【（6.5±1.2） Ku/l,P<0.01】;灯盏花素干预组SlgA为（0.7±0.1）μg/kg,显著高于模型组【（0.2±0.1）μg/kg,P<0.01】,内毒素为（0.3±0.1） EU/ml,显著低于模型组【（0.8±0.1） EU/ml,P<0.01】,iNOS 为（0.3±0.1） U/g,显著低于模型组 【（0.7±0.1） U/g,P<0.01】, eNOS为（0.8±0.2） U/g,显著高于模型组【（0.2±0.1）U/g,P<0.01】,NO为（0.8±0.1）μmol/g,显著高于模型组【（0.2±0.1）μmol/g,P<0.01】,PCT为（3.9±1.0） ng/ml,显著低于模型组【（5.0±1.2） ng/ml,P<0.01】,DAO为（7.5±1.3） Ku/L,显著低于模型组【（10.5±1.6） Ku/l,P<0.01】;模型组大鼠肝组织TLR4和NF-κB表达及血清TNF-α和IL-1β水平显著高于对照组（P<0.01）,而灯盏花素干预组大鼠肝组织TLR4和NF-κB及血清TNF-α和IL-1β水平显著降低,差异有统计学意义（P<0.01）。结论 灯盏花素通过促进eNOS／NO表达和下调TLR4和NF-κB表达能降低血浆内毒素对肝脏的损伤,对IRI动物具有保护作用。     

结核分枝杆菌Rv3621c原核表达及免疫功能研究

目的 以结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)H37Rv基因组为模板,构建、纯化及鉴定原核表达质粒pPROEX-Rv3621c,通过人群、小鼠试验进行免疫原性评价。方法 构建重组质粒pPROEX-Rv3621c,并以全血干扰素释放分析技术(Whole-blood IFN-γ release assay,WBIA)检测其能否被安徽省淮南市M.tb感染者T细胞特异性识别。rRv3621c混合佐剂MTM[母牛分枝杆菌(M.vaccae),人工合成海藻糖-6'6,二分枝菌酸(TDB),单磷酰脂质A(MPLA)]免疫小鼠后,检测血清中特异性抗体分泌水平、脾细胞中抗原特异性Th1型细胞因子分泌水平及肺脏细胞因子mRNA表达水平。结果 成功构建重组质粒pPROEX-Rv3621c,并使之诱导表达、纯化和鉴定。在rRv3621c蛋白诱导下,活动性结核(Active tuberculosis, ATB)患者外周血淋巴细胞释放的IFN-γ水平明显较高(t=4.813, P<0.01),且ATB患者产生的IFN-γ水平高于潜伏性结核(Latent tuberculosis infection, LTBI)人群(t=4.442, P<0.01)。BCG+Rv3621c/MTM组小鼠产生的特异性抗体滴度水平明显高于Rv3621c/MTM组(P<0.01)和BCG组(P<0.01),Rv3621c/MTM组和BCG+Rv3621c/MTM组小鼠的IgG2a/IgG1比值大于1,明显高于MTM组和BCG组。BCG+Rv3621c/MTM组小鼠均分泌高水平IFN-γ、TNF-α和IL-2。Rv3621c/MTM组小鼠肺脏组织中IFN-γ、TNF-α及iNOS表达水平较高。结论 M.tb感染者外周血T细胞可特异性识别rRv3621c蛋白,rRv3621c混合佐剂MTM可以诱导较强烈的抗原特异性Th1型免疫应答。     

乙型肝炎肝硬化并发自发性细菌性腹膜炎患者血清白蛋白和肝纤维化指标的变化

目的 分析乙型肝炎肝硬化并发SBP患者血清肝纤维化指标及白蛋白水平的变化。方法 在我院2013年1月~2015年6月收治的31例乙型肝炎肝硬化并发自发性细菌性腹膜炎（SBP）患者和同期住院的31例乙型肝炎肝硬化未发生SBP患者,采用放射免疫法检测纤维化指标。结果 SBP组血清PCⅢ、Ⅳ-C、LN和HA水平分别为307.4±20.2μg/L、230.6±20.3μg/L、251.3±16.3μg/L、472.6±22.6μg/L,均显著高于非SBP组（269.8±16.5μg/L、181.6±17.9μg/L、215.6±13.3μg/L、436.1±20.3μg/L （均P<0.05）;SBP组血清和腹水ALB水平分别为23.3±2.2 g/L和10.0±1.3g/L,均显著低于非SBP组（28.9±2.7 g/L和15.9±1.5 g/L（均P<0.05）;SBP患者血清PCⅢ、Ⅳ-C、LN和HA水平均与ALB呈负相关（均P<0.05）。结论 乙型肝炎肝硬化患者并发SBP时可能影响血清肝纤维化指标水平。     

手术治疗胆石症并发急性胰腺炎患者血清炎症和氧化应激介质的变化

目的 探讨胆石症并发急性胰腺炎（AP）患者在病情稳定后接受腹腔镜胆囊切除术（LC）治疗血清炎性和氧化应激介质的变化。 方法 150例胆石症并发AP患者,在内科治疗病情稳定后,84例接受LC术,66例接受开腹胆囊切除术。采用ELISA法检测血清白介素-6（IL-6）、IL-10和C反应蛋白（CRP）;采用ELISA法检测血清丙二醛（MDA）、氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）和对氧磷酶-1（PON-1）;采用高效液相色谱法检测血清8-羟基鸟嘌呤（8-OHG）。 结果 术后第5天,LC组血清IL-6水平为（42.3±4.8）μg/L,显著低于开腹组的【（57.7±5.1）μg/L,P<0.05】,IL-10水平为（64.3±5.3） pg/ml,显著高于开腹组的【（51.2±4.2） pg/ml,P<0.05】,CRP水平为（15.8±5.7）μg/L,显著低于开腹组的【（38.4±6.8） μg/L,P<0.05】;MDA水平为（3.3±0.9） nmol/mL,显著低于开腹组的【（5.4±1.8） nmol/mL,P<0.05】,ox-LDL水平为（63.2±11.7） ng/ml,显著低于开腹组的【（72.3±11.0） ng/ml,P<0.05】,PON-1水平为（116.3±10.2） U/ml,显著高于开腹组的【（104.5±11.4） U/ml,P<0.05】,8-OHG水平为（0.5±0.2）ng/ml,与开腹组的（0.6±0.2） ng/ml比,无显著性相差（P>0.05）。 结论 对于胆石症并发AP患者,在内科控制AP病情后,及时行LC手术治疗,去除结石,可以减轻患者的氧化应激反应,安全可行。     

结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白免疫小鼠效果初步评价

目的 融合表达和纯化结核分枝杆菌(MTB)CFP10-ESAT6(CE),初步评价免疫效果。方法 构建pET32a(+)-CE重组质粒,E.coli BL21(DE3)中融合表达,Ni-NTA层析纯化。用CE加铝佐剂,50 μg CE/只/次,分3次免疫BALB/c小鼠。ELISA测定血清IgG抗体;ELISpot与Luminex检测细胞因子,进行MTB体外生长抑制试验。卡介苗(BCG)为阳性对照。结果 CE免疫小鼠,能诱导产生高效价的IgG、IgG1和IgG2a,且IgG1(t=19.1,P<0.000 1)和IgG2a(t=8.7,P<0.000 1)抗体水平均高于BCG组。CE组与BCG组诱导产生的分泌IFN-γ的斑点形成细胞(SFC)数量差异无统计学意义(t=0.4, P>0.05),但诱导分泌IL-4的SFC数量高于BCG组(t=8.0, P<0.000 1)。CE组诱导分泌GM-CSF(t=8.4,P<0.05)、IL-6(t=8.3,P<0.05)、IL-10(t=2.5,P<0.05)和IL-4(t=7.0,P<0.05)均高于BCG组,而CE组诱导分泌IFN-γ(t=1.4,P>0.05)、TNF-α(t=1.8,P>0.05)、IL-2(t=2.0,P>0.05)、IL-12(t=0.9,P>0.05)和IL-17(t=1.3,P>0.05)均与BCG组相似,差异无统计学意义。CE组小鼠脾细胞的MTB体外生长抑制结-果与BCG组相似(t=0.8,P>0.05)。结论 CE免疫小鼠可诱导较强的Th1与Th2混合型免疫反应,且有较强的体外抑制MTB生长的能力,表明CE具有良好的结核疫苗研制应用价值。     

基于登革病毒prME序列mRNA候选疫苗的构建与评价

目的 利用mRNA结合脂质纳米颗粒(lipid nanoparticle,LNP)包裹递送技术,设计构建mRNA疫苗,以期为登革热疫苗研发提供新思路。方法 以DENV1 Hawaii株prME序列为靶基因,体外合成D1ME-mRNA,利用流式细胞术及免疫荧光染色鉴定其在细胞内表达后,用LNP包裹mRNA,制备D1ME mRNA-LNP候选疫苗;利用C57BL/6小鼠模型,肌肉注射10 μg进行二剂次免疫接种,评价疫苗的保护作用及免疫原性。结果 流式细胞术及免疫荧光检测证实D1ME-mRNA在细胞内高效表达;经颅内注射DENV1攻毒后,疫苗组小鼠体重下降幅度明显小于对照组,且无明显临床症状;疫苗组小鼠的中和抗体平均效价为1∶20,高于对照组;疫苗组小鼠的脾淋巴细胞经特异性抗原刺激可分泌高水平的Th1细胞相关的细胞因子IFN-γ、TNF-α。结论 本研究成功构建了针对DENV1的mRNA-LNP疫苗,二剂次免疫接种可诱导小鼠产生DENV1特异性的、以Th1型细胞免疫为主的免疫应答,并可为小鼠提供保护作用以抵抗DENV1的感染。     

结核分枝杆菌亚单位疫苗Ag85b-ESAT-6+Hsp65-IL-2的安全性评价研究

目的评价结核分枝杆菌亚单位疫苗Ag85b-ESAT-6+Hsp65-IL-2在小鼠和豚鼠体内的安全性。方法小鼠慢性毒性实验:C57BL/6J小鼠间隔2周、皮下3次注射100 μg亚单位疫苗(Ag85b-ESAT-6和Hsp65-IL-2各50 μg),观察临床症状表现和器官病理学改变。小鼠急性毒性实验:C57BL/6J小鼠皮下注射100 μg 亚单位疫苗(Ag85b-ESAT-6和Hsp65-IL-2各50 μg),观察小鼠临床症状、体重、摄食摄水量、器官的脏器系数和病理学表现。豚鼠全身过敏实验:Hartley豚鼠间隔2 d、皮下3次注射1 000 μg、100 μg、10 μg亚单位疫苗(Ag85b-ESAT-6和Hsp65-IL-2均按质量1∶1混合),16 d后用二倍剂量足背静脉注射激发,观察体重变化和全身过敏症状。结果小鼠慢性毒性实验表明,亚单位疫苗多次注射后不引起临床症状和病理损伤;小鼠急性毒性实验表明,亚单位疫苗对小鼠不产生临床症状,对小鼠体重、摄食摄水量、脏器系数、器官病理学改变影响无统计学意义;豚鼠全身过敏实验表明,疫苗短期多次致敏对豚鼠的体重无明显影响,低剂量疫苗不引起豚鼠产生全身过敏反应。结论亚单位疫苗Ag85b-ESAT-6+Hsp65-IL-2在小鼠和豚鼠体内均表现出良好的安全性,可用于进一步TB预防和治疗性疫苗的研制。     

弓形虫主要表面抗原1核酸疫苗与蛋白疫苗联合免疫保护作用的研究

目的 研究刚地弓形虫RH株主要表面抗原1(P30)DNA疫苗诱导BALB/c小鼠的保护性免疫作用。方法 根据弓形虫P30基因的DNA序列设计一对引物,,将PCR扩增到的P30基因克隆到真核表达载体pcDNA.3.1中。大量制备pcDNA3. 1-P30和pcDNA3.1质粒DNA。将48只 BALB/c小鼠随机分成4组,每组1 2只,空质粒对照组(A组)第O、2、4周经小鼠股四头肌注射100 μg pcDNA3.1质粒DNA;重组P30抗原免疫组(B组)第0、2、4周每鼠经背部皮下多点注射50 μg rP30+福氏完全佐剂;P30 DNA疫苗免疫组(C组)第O、2、4周经小鼠股四头肌注射100 μg pcD- NA3. 1-P30质粒DNA;P30 DNA疫苗和重组P30抗原联合免疫组(D组)第O、2周经小鼠股四头肌洼射100 μg pcDNA3. 1-P30质粒DNA,第4周每鼠经背部皮下多点注射50 μg rP30+福氏完全佐剂。末次免疫4周后每鼠用100个弓形虫速殖子经腹腔感染,观察小鼠存活时间。结果 成功构建刚地弓形虫RH株P30DNA疫苗,动物保护性实验表明,虽然与对照组相比实验组小鼠的存活时间有一定的延长,但差异无显著性。结论 pcDNA3.1-P30 DNA疫苗具有弓形虫病候选DNA疫苗分子的潜力。     

基于O型口蹄疫病毒VP21-33肽段增强VP1141-160肽段免疫原性的新型纳米颗粒疫苗研究

目的 研究O型口蹄疫病毒中VP21-33肽段能否增强VP1141-160肽段的免疫原性及其可能的免疫机制。方法 分别构建两种新的含有VP1和VP2的重组质粒 (PcDNA3.1-VP1、PcDNA3.1-VP2),并将重组质粒制备成纳米颗粒,检测其体外转染效率。然后将上述纳米颗粒作为基因疫苗免疫Balb/c小鼠,PBS及空载质粒作为对照。液相阻断ELISA方法检测不同时间小鼠血清中抗体情况;流式细胞术和免疫组化染色的方法分析免疫小鼠外周血、脾脏和腹股沟淋巴结中CD4⁺、CD8⁺ T淋巴细胞的差异;淋巴细胞增殖实验检测免疫28 d后小鼠外周血中淋巴细胞的增殖能力。结果 对重组质粒进行鉴定,结果显示重组质粒(PcDNA3.1-VP1、PcDNA3.1-VP2)构建成功;体外转染实验结果显示该纳米颗粒体外转染效率约为28%,具有较高的转染效率。ELISA检测显示VP1与VP2共同免疫小鼠血清中的抗体滴度均在初次免疫后的第21和28 d达到最高,并显著高于对照组(F=4.625,P<0.05);流式和免疫组化染色结果分析发现VP1与VP2共同免疫小鼠血液、淋巴结和脾脏中CD4⁺、CD8⁺ T淋巴细胞数均显著高于对照组;淋巴细胞增殖实验结果显示VP1与VP2共同免疫小鼠淋巴细胞增殖能力均显著高于对照组(F=12.73, P<0.05)。结论 O型FMDV VP2的1-33肽段能增强VP1的141-160肽段的免疫原性,其可能通过激活细胞免疫和体液免疫实现。     

Immunogenicity and efficacy of a DNA vaccine in aged mice

The immunogenicity and protective efficacy of a DNA vaccine encoding the circumsporozoite protein of the Plasmodium yoelii malaria parasite was evaluated in young (2 months) versus aged (>26 months) BALB/c mice. The primary and secondary humoral immune response of aged mice was 19- and 7-fold lower, respectively, than that of similarly treated young animals (p < .01). Cytotoxic T lymphocyte activity in aged mice was also lower than in younger animals. The vaccine response of aged animals was characterized by a 6-fold increase in interleukin-4 and a 3-fold increase in interferon-gamma (IFN-gamma) secreting cells, whereas in young animals immunization only stimulated the production of the type 1 cytokine IFN-gamma. Overall, 80% of young vaccinated mice were protected from subsequent challenge with live malaria sporozoites whereas only 40% of aged mice were protected. These results are the first to demonstrate that DNA vaccination induces less effective immunity in aged than young animals.     

以减毒沙门氏菌为载体的抗贾第虫肠溶疫苗制备及免疫效果检测

目的 以携带α1-giardin DNA的减毒沙门菌为对象,探讨肠溶制剂的制备、免疫剂量和免疫效果。方法 携带有贾第虫α1-giardin基因的重组减毒沙门菌经培养扩增冻干后,对各种辅料,包括微分硅胶、分散剂、润滑剂、崩解剂、包衣液等成分与减毒沙门菌的相容性,及包衣条件进行检测。采用最佳配方制备肠溶片剂,用于动物免疫试验。初始免疫后第25 d后,分别检测血清和小肠灌洗液中抗rα1-giardin特异性IgG和SIgA的水平;并用10⁶个贾第虫滋养体灌胃,每天检测各组小鼠粪便中的滋养体和(或)包囊的排出率。结果 肠溶片剂的处方中微分硅胶和分散剂的用量分别为菌粉用量的10%和2倍;润滑剂和崩解剂的用量分别占处方量的0.8%和2%;包衣液的浓度为20%,包衣增重为处方量的6%。每个包衣片活菌含量在4×10⁶以上。动物试验表明,以SL7207/pVAX1-rα1-giardin肠溶片剂免疫鼠小肠灌洗液中特异性抗rα1-giardin SIgA的水平明显高于对照组,并在攻虫试验具有46.7%的减虫率,明显高于rα1-giardin肌注免疫组(23%)(P<0.01)。结论 本研究为多种以减毒沙门菌为载体的DNA疫苗的肠溶制剂的研究提供了实验依据,如规模化生产,该处方尚需进一步完善。     

树突状细胞多价核酸疫苗抗血吸虫感染作用及机制研究

目的 探讨基因转染对树突状细胞(DC)功能的影响及DC多价核酸疫苗抗血吸虫感染作用及机制。方法 利用脂质体介导的基因转染技术将Sj26、Sj23和Sj14基因分别转染DC,流式细胞术(FCM)检测DC摄取抗原能力,混合淋巴细胞反应(MLR)检测DC对同种异体T淋巴细胞的刺激作用。Sj26、Sj23和Sj14基因转染DC分别和联合免疫BALB/c小鼠3次,末次免疫2周后,每只小鼠感染日本血吸虫尾蚴40条,小鼠感染血吸虫6周后,计数成虫和虫卵。ELISA法检测血清特异性IgG、血清干扰素-γ(IFN-γ)和白细胞介素-4(IL-4)及脾淋巴细胞培养上清IFN-γ、IL-4水平,噻唑蓝(MTT)法检测脾淋巴细胞的增殖。结果 与真核表达载体pcDNA3转染DC和未处理DC相比较,基因转染DC摄取抗原的荧光强度明显降低(P<0.01),对同种异体T淋巴细胞的刺激指数明显升高(P<0.01)。各免疫组小鼠诱导的减虫率和减卵率均高于对照组(P<0.01),而基因转染DC联合免疫组小鼠抗血吸虫感染作用高于单一基因转染DC免疫组(P<0.001)。基因转染DC免疫组小鼠末次免疫2周后血清特异性IgG水平较免疫前显著升高(P<0.05),血清IFN-γ水平明显升高(P<0.01),而血清IL-4的水平无明显变化。与对照组比较,基因转染DC免疫组小鼠脾淋巴细胞经ConA和SEA刺激后培养上清IFN-γ水平显著增高,IL-4水平显著降低,刺激指数(SI)显著增高(P<0.001)。结论 基因转染能促进DC的成熟,增强DC的活性,DC多价核酸疫苗可增强抗血吸虫感染作用,其作用机制以Th1型免疫应答为主。     

Intramuscular vs intradermal route for hepatitis B booster vaccine in celiac children

AIM: To compare intradermal (ID) and intramuscular (IM) booster doses, which have been used in healthy and high risk subjects, such as healthcare workers, haemodialysis patients, human immunodeficiency virus patients, and renal transplant recipients unresponsive to initial hepatitis B vaccination, in celiac individuals.METHODS: We conducted our study on 58 celiac patients, vaccinated in the first year of life, whose blood analysis had showed the absence of protective hepatitis B virus (HBV) antibodies. All patients had received the last vaccine injection at least one year before study enrolment and they had been on a gluten free diet for at least 1 year. In all patients we randomly performed an HBV vaccine booster dose by ID or IM route. Thirty celiac patients were revaccinated with recombinant hepatitis B vaccine (Engerix B) 2 μg by the ID route, while 28 celiac patients were revaccinated with Engerix B 10 μg by the IM route. Four weeks after every booster dose, the anti-hepatitis B surface (HBs) antibody titer was measured by an enzyme-linked immune-adsorbent assay. We performed a maximum of three booster doses in patients with no anti-HBs antibodies after the first or the second vaccine dose. The cut off value for a negative anti-HBs antibody titer was 10 IU/L. Patients with values between 10 and 100 IU/L were considered "low responders" while patients with an antibody titer higher than 1000 IU/L were considered "high responders".RESULTS: No significant difference in age, gender, duration of illness, and years of gluten intake was found between the two groups. We found a high percentage of "responders" after the first booster dose (ID = 76.7%, IM = 78.6%) and a greater increase after the third dose (ID = 90%, IM = 96.4%) of vaccine in both groups. Moreover we found a significantly higher number of high responders (with an anti-HBs antibody titer > 1000 IU/L) in the ID (40%) than in the IM (7.1%) group, and this difference was evident after the first booster dose of vaccination (P < 0.01). No side effects were recorded in performing delivery of the vaccine by either the ID or IM route.CONCLUSION: Our study suggests that both ID and IM routes are effective and safe options to administer a booster dose of HBV vaccine in celiac patients. However the ID route seems to achieve a greater number of high responders and to have a better cost/benefit ratio.     

Ubiquitin conjugation of hepatitis B virus core antigen DNA vaccine leads to enhanced cell-mediated immune response in BALB/c mice

Background

Nearly 350 million persons worldwide are chronically infected with hepatitis B virus (HBV). Ubiquitin (Ub) is a highly conserved small regulatory protein, ubiquitous in eukaryotes, that usually serves as a signal for the target protein that is recognised and degraded in proteasomes . The Ub-mediated processing of antigens is rapid and efficient and stimulates cell-mediated immune responses. Accordingly, Ub-mediated processing of antigens has been widely used in chronic-infection and cancer studies to improve immune response.

Objectives

Many clinical trials have shown that DNA vaccine potency needs to be greatly enhanced. Here, we report a new strategy for designing an HBV DNA vaccine using the ubiquitin (Ub) sequence. The aim of this study was to investigate a novel DNA vaccination, based on the expression of HBV core antigen (HBcAg), fused to Ub to enhance DNA vaccine potency.

Materials and Methods

Mouse ubiquitin fused to the HBcAg gene and cloned into the eukaryotic vector pcDNA3.1 (-). BALB/c mice were immunized with recombinant pUb-HBcAg or pHBcAg DNA vaccine. Lymphocyte proliferation assay, intracellular IFN-γ assay, CTL cytotoxicity assay, and antibody assay were performed to analyze the cellular and humoral immune responses to our DNA constructs.

Results

HBcAg was expressed effectively in the COS-7 cells that were transiently transfected with pUb-HBcAg. Strong anti-HBc IgG responses were elicited in mice that were immunized with pUb-HBcAg. The endpoint titers of anti-HBc peaked at 1:656100 on the 42nd day after the third immunization. pUb-HBcAg stimulated greater lymphocyte proliferation and induced higher levels of IL-2 and IFN-γ and a greater percentage of HBcAg-specific CD8+ T cells in mice than pHBcAg. In the CTL assay, the specific lysis rate reached 56.5% at an effector:target ratio of 50:1 in mice that were immunized with pUb-HBcAg.

Conclusions

pUb-HBcAg elicits specific anti-HBc responses and induces HBc-specific CTL responses in immunized BALB/c mice. Our results imply that Ub can be used as a molecular adjuvant that enhances the potency of DNA vaccines.