WT1基因转染增加白血病细胞凋亡的实验研究

为了探讨WT1基因异构体对急性早幼粒细胞性白血病细胞株NB4凋亡的影响及其分子机制,应用电穿孔的方法将携带WT1基因异构体WTA（-17AA/-KTS）全长cDNA的真核表达载体及其对照质粒pCB6^＋转导白血病细胞株NB4,建立WT1基因异构体表达比例改变的单克隆细胞株;用MTT、形态学观察、DNA凝胶电泳、An-nexin V结合力测定等方法观察WT1基因异构体表达比例的转变对白血病细胞NB4诱导凋亡的影响;用RT-PCR方法检测细胞中p21、p53、bcl-2、bcl-XL、和c-myc等凋亡相关基因表达的改变.研究结果表明,MTT显示NB4/WTA细胞对As2O3的IC50值较对照组明显降低;经As2O3作用48小时,NB4/WTA细胞Annexin V结合力较对照组细胞升高,出现更为典型的凋亡形态学改变;在DNA凝胶电泳可见更为明显的DNA梯形条带,RT-PCR检测提示NB4/WTA细胞p21、c-myc基因的表达较对照组高,bcl-2表达下降,p53、bcl-XL基因表达无明显改变.结论：增加外源性WT1基因异构体WTA的表达从而将WT1基因异构体表达的比例由＋17AA/＋KTS优势型转变为-17AA/-KTS优势型,能使NB4细胞对As2O3引起的凋亡更为敏感,这些改变可能与p21、c-myc等基因的表达上调和bcl-2基因的表达下调有关.     

氨肽酶抑制剂对全反式维甲酸诱导人急性早幼粒白血病细胞株NB4细胞分化作用的影响及其机制的初步探讨

为了研究氨肽酶抑制剂乌苯美司（bestatin）对全反式维甲酸（ATRA）诱导人APL细胞株NB4细胞分化作用的影响及其可能机制,NB4细胞经bestatin和ATRA单用或联合应用处理一定时间后,用光学显微镜观察细胞形态,流式细胞仪检测CD11b表达,四氮唑蓝（NBT）还原实验检测分化细胞功能,RT-PCR法检测c-myc和c-EBPεmRNA表达,Western blot检测c-Myc蛋白表达.结果显示：NB4细胞经100μg/ml bestatin和10 nmol/L ATRA联合处理72小时后,其分化的形态更明显;100μg/ml bestatin与不同浓度ATRA联合处理72小时,能增强NB4细胞的NBT还原能力,与单用相应浓度ATRA组相比,差异显著（P＜0.01）;从48-96小时,100μg/ml bestatin能增强10 nmol/L ATRA诱导NB4细胞的NBT还原能力,且呈时间依赖性,与相应时间点ATRA组相比,差异明显（P＜0.01）;与单用10 nmol/L ATRA组相比,ATRA（10 mmol/L）和bestatin（100μg/ml）联用处理72小时,NB4细胞CD11b阳性表达率明显增加（P＜0.01）;与单用10 nmol/L ATRA组相比,联用100μg/ml bestatin处理4小时后,NB4细胞c-myc mRNA表达的降低更明显（P＜0.05）;50、75、100μg/ml bestatin与10 nmol/L ATRA联合处理8小时后,NB4细胞c-Myc蛋白表达水平明显降低,与单用ATRA组相比差异显著（P＜0.05）;药物联用各组NB4细胞c-Myc蛋白表达水平与NBT还原能力之间呈负相关（r=-0.940,p=0.017）;与100μg/ml bestatin联用不能增强10 nmol/L ATRA上调c-EBPεmRNA的表达;50、75、100μg/ml bestatin单独处理对NB4细胞的分化无影响.结论：氨肽酶抑制剂bestatin能够增强ATRA对NB4细胞的诱导分化作用,这可能与bestatin协同ATRA下调c-myc的表达有关.     

NB4细胞系诱导分化过程中WT1基因表达的变化

为了研究WT1基因的表达与NB4细胞诱导分化的关系,应用基因重组技术建立了竞争性RT-PCR定量检测WT1基因表达的方法,并用间接免疫荧光标记法检测NB4细胞表面抗原CD11b的变化.结果发现,随着NB4细胞向粒系终末分化WT1基因表达迅速下降,全反式维甲酸(ATRA)作用0,12,24小时后每μg总RNA中WT1基因的分子数分别为4×106,1.56×106和0.4×106,与CD11b的变化情况相一致.结论提示,WT1基因高表达与NB4白血病细胞分化阻滞有关,WT1基因定量检测与细胞表面抗原检测结合有助于白血病细胞诱导分化的研究.     

小剂量亚硒酸钠和全反式维甲酸联合使用诱导NB4细胞的凋亡及分化

目的 研究小剂量亚硒酸钠（2－5μmol/L）与全反式维甲酸（ATRA）联合使用对人急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4凋亡及分化的影响。方法 采用膜联蛋白V（Annexin-V)荧光标记试剂盒检测细胞的磷脂酰丝氨酸（PS）外翻率和DNA片段化的琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡，通过流式细胞术检测粒系分化细胞表面特异抗原CD11b表达，NBT还原实验检测细胞分化。结果 阴性对照组细胞术检测粒系分化细胞表达特异抗原CD11b表达，NBT还原实验检测细胞分化。结果 阴性对照组细胞PS外翻率为1．2％，5μmol/L亚硒酸钠处理NB4细胞48h后PS外翻率为0.8%,0.1μmol/L ATRA诱导48h后PS外翻率为2．0％，与对照组相比，差异均无显著性,而两者联合作用NB4细胞24，36，48h后的PS外翻率分别达到18.3%,25.9%,50.0%,DNA电泳呈典型的梯形带。小剂量（2μmol/L）亚硒酸钠没有诱导NB4细胞分化的能力，但其与0．1μmol/L的ATRA联合使用同单独使用0．1μmol/L的ATRA钠没有诱导NB4细胞分化的能力，但其与0．1μmol/L的ATRA联合使用单独使用0．1μmol/L的ARTA相比，CD11b表达阳性细胞率进一步增加，NBT还原能力也进一步增强。结论 小剂量的亚硒酸钠与ATRA联合使用可诱导NB4细胞发生凋亡及分化。     

正常人骨髓不同细胞群中WT1基因表达及其异构体比例研究

本研究探讨WT1基因在正常人骨髓不同分化阶段造血细胞中的表达程度及异构体间比例关系。采用实时荧光定量RT-PCR方法检测18例正常人骨髓标本中CD34^＋CD38^-、CD34^＋CD38^＋、CD15^＋CD11b^＋、CD33＋CD14^＋、CD20^＋CD5^-和CD20^-CD5^＋细胞群中总WT1、WT1（＋17AA）及WT1（＋KTS）的表达。结果表明：与K562细胞相比,CD34^＋CD38^-、CD34^＋CD38^＋、CD15^＋CD11b^＋和CD33^＋CD14^＋细胞群中均存在WT1基因的低表达,且依次逐渐降低;在CD20^＋CD5^-和CD20^-CD5^＋细胞群中未检测到WT1基因表达。在分化程度较低的CD34^＋CD38^-和CD34^＋CD38^＋细胞群中以＋17AA,＋KTS及WT1（＋/＋）异构体为主,而较成熟的CD15^＋CD11b^＋和CD33＋CD14^＋细胞群中以-17AA、-KTS及WT1（-/-）异构体为主。结论：在正常人骨髓细胞中WT1基因的表达随着细胞分化程度提高而降低,造血细胞可能通过其4种异构体比例的调整而发挥抑制或促进分化的作用。     

转染VEGF-C cDNA对NB4细胞增殖、分化与凋亡的影响

目的探讨转染血管内皮生长因子(VEGF)-C cDNA 对急性早幼粒细胞白血病细胞系NB4细胞增殖、全反式维甲酸(ATRA)诱导分化及化疗药物介导的细胞凋亡作用的影响。方法采用脂质体法将重组表达载体(pcDNA3.1-VEGF-C)和 pcDNA3.1转染 NB4细胞建立稳定细胞株;采用MTT 法及集落形成实验分析转染 VEGF-C cDNA 对 NB4细胞增殖的影响;NB4/VEGF-C 细胞经 ATRA诱导后涂片经瑞特-姬姆萨染色作形态学分析,实时荧光定量 PCR 检测调控粘细胞分化基因 C/EBPα相对表达水平,同时以流式细胞术检测细胞表面的 CD11b 表达量;Annexin V/PI 双染流式细胞术检测NB4/VEGF-C 细胞经鬼闩乙叉甙(Vp16)诱导的细胞凋亡;并以实时荧光定量 PCR 检测 bcl-2基因相对表达水平,均以 NB4/pcDNA3.1细胞为对照。结果成功转染获得稳定表达 VEGF-C 的细胞株 NB4/VEGF-C,其增殖能力显著高于 NB4/pcDNA3.1细胞;NB4/VEGF-C细胞对抗 ATRA 介导的早幼粒细胞分化成熟,CD11b 表达量低于对照组,C/EBPα基因含量仅为对照组的1/32;NB4/VEGF-C 细胞经Vp16介导后 bcl-2基因表达约为 NB4/pcDNA3.1细胞的2.28倍,而凋亡的 NB4/VEGF-C 细胞百分率(7.20±2.52)%明显低于凋亡的 NB4/pcDNA3.1细胞的(16.07±3.58)%(P=0.005)。结论 VEGF-C 通过 VEGF 受体3(VEGFR-3)信号途径促进白血病细胞增殖,抑制分化诱导剂介导的 NB4 细胞分化及化疗药物介导的细胞凋亡,推测 VEGF-C/VEGFR-3信号途径在白血病疾病进展中发挥重要作用并可望作为白血病治疗的靶点。     

乌苯美司增强全反式维甲酸诱导急性早幼粒细胞白血病细胞分化的体外研究

目的探讨氨肽酶N抑制剂乌苯美司（ubenimex）对全反式维甲酸（ATRA）诱导人急性早幼粒细胞白血病（APL）细胞分化的影响及可能机制。方法采用流式细胞术检测细胞表面分化抗原CD11b，四氮唑蓝（NBT）还原实验检测细胞分化；Western blot法检测细胞c—Myc、ERK1／2及P—ERK1/2 、p38MAPK及p—p38MAPK蛋白表达。结果ubenimex单独应用对NB4细胞的NBT还原能力及CD11b表达无明显影响，但ubenimex能增强ATRA诱导NB4细胞的NBT还原能力及CD11b的表达。100μg／mlubenimex能增强10nmol／LATRA诱导原代APL细胞的NBT还原能力。100μg／mlubenimex增强10nmol／LATRA下调NB4细胞c—Myc蛋白的表达；抑制10nmol／LATRA引起的NB4细胞的p38MAPK磷酸化。结论ubenimex能够增强ATRA对APL细胞的诱导分化作用，可能与抑制p38MAPK的磷酸化及对原癌基因c—Myc表达的调控有关。     

鲍氏威酸诱导急性早幼粒白血病细胞分化与PML/RARα关系的研究

目的：研究鲍氏威酸（BC4）诱导不同融合基因PML／RARα基因型的急性早幼粒白血病（APL）细胞分化的能力及对APL细胞分化相关基因c-myc的表达影响，探讨鲍氏威酸诱导分化作用的机制。方法：采用RT-PCR检测APL细胞PML／RARα的基因型；运用骨髓干、祖细胞集落培养技术分析各基因型APL细胞分别在生理盐水（NS）对照组，鲍氏威酸（BC4）组，全反式维甲酸（ATRA）组培养体系中增殖与分化能力，测定各组集落与丛的形成率，形态分化率，NBT还原率以及粒细胞吞噬率，培养前后各组APL细胞c-myc表达阳性率。结果：与NS对照比较，BC4和ATRA均使PML-RARα^＋组APL细胞丛形成率明显增高（P〈0.01），而集落形成率无明显变化（P〉0．05），3项细胞分化指标增高（0．01〈P〈0．05），c-myc表达阳性率降低（P〈0．05）；BC4对PML／RARα^＋（L型）诱导分化作用强于PML-RARα^＋（S型）APL，BC4对部分ATRA治疗后复发耐药病例有诱导分化能力。BC4及ATRA对PML／RARα^＋APL细胞的各项诱导分化指标无明显改变。结论：BC4对APL具有诱导分化作用，下调c-myc基因表达，其诱导分化能力与PML／RARα^-基因型有关，并能诱导部分ATRA耐药细胞分化     

环磷腺苷和其衍生物8-CPT-cAMP诱导分化效应的比较实验

目的:比较环磷腺苷和其衍生物8-CPT-cAMP在联合全反式维甲酸(ATRA)诱导耐药型早幼粒白血病细胞株NB4-R1分化中的作用。方法:将环磷腺苷和8-CPT-cAMP分别与ATRA联合处理NB4-R1细胞株,在不同时间点收集细胞,观察细胞形态、硝基四氮唑蓝(NBT)的还原能力,以及细胞表面分化抗原CD11b的表达情况。结果:单独使用环磷腺苷或8-CPT-cAMP均无法诱导NB4-R1细胞分化;但8-CPT-cAMP可以恢复NB4-R1细胞对ATRA的反应性,8-CPT-cAMP与ATRA合用可以使NB4-R1细胞表面分化抗原CD11b的阳性率达到(86.5±7.78)%,与对照组和ATRA单用组相比均有显著性差异;同时,细胞对NBT的还原能力也明显升高,比对照组或ATRA单用组提高了5倍左右。而环磷腺苷与ATRA联合处理只能诱导NB4-R1细胞出现部分分化的特征,CD11b的阳性率可上升至(50.7±3.11)%,但细胞对NBT的还原能力却没有明显提高。结论:环磷腺苷对维甲酸耐药型细胞株NB4-R1细胞的分化具有一定的促进作用,但是效果明显不如其衍生物8-CPT-cAMP。     

丹参酮ⅡA诱导早幼粒细胞白血病细胞分化及其分子机制研究

目的　探讨丹参酮ⅡA(TanshinoneⅡA ,TanⅡA)对急性早幼粒细胞白血病 (APL)细胞诱导分化的作用及其分子机制。方法　将APL细胞株NB4细胞与TanⅡA在体外共同培养 5天 ,观察细胞形态变化 ,并检测药物作用前后细胞NBT还原能力 ,用流式细胞术测定细胞增殖周期、c myc、bcl 2、p5 3、c fos、CD3 3 及CD11b表达。结果　 0 .5 μg/mlTanⅡA可诱导 (91.3± 2 .1) %的NB4细胞向终末细胞分化。其中 ,中、晚幼粒细胞占 0 .2 6 ,杆状及分叶核细胞占 0 .6 8;细胞生长明显抑制 ;NBT还原能力显著增强 ;CD3 3 表达下降 ,CD11b表达升高 ;与全反式维甲酸 (ATRA)相比 ,差异无显著性 (P >0 .0 5 )。流式细胞术分析发现 ,TanIIA处理组细胞被阻滞于G0 /G1期 ,S期细胞数明显减少 ,增殖指数降低 ,c myc、bcl 2基因蛋白表达降低 ,c fos、p5 3基因蛋白表达增加。结论　TanⅡA体外能使NB4细胞分化成熟 ,增殖能力下降。其机制可能是通过调控与NB4细胞增殖、分化相关的基因表达 ,抑制细胞DNA合成 ,从而抑制细胞增殖 ,诱导细胞分化。     

腺苷酸环化酶的活化影响NB4细胞对全反式维甲酸的敏感性

目的　探讨急性早幼粒细胞白血病 (APL)细胞对全反式维甲酸 (ATRA)耐药的分子机制。方法　以ATRA敏感及耐药的APL细胞株NB4和NB4 R1为模型 ,观察细胞形态、表面分化抗原以及对四氮唑蓝还原能力的改变 ,分别研究腺苷酸环化酶 (AC)和磷酸二酯酶 (PDE)的特异激活剂毛喉素、拮抗剂 9 (四氢 2 呋喃基 ) 9H 嘌呤 6 氨 (SQ2 2 5 36 )对ATRA诱导分化作用的影响。结果　AC的拮抗剂SQ2 2 5 36能显著抑制ATRA对NB4细胞的诱导分化作用 ,ATRA SQ2 2 5 36组与ATRA组比较 ,CD11b阳性率由 (95 .9± 2 .5 ) %降至 (6 0 .3± 7.1) % ,NBT还原实验吸光度 (A) 540 值由 0 .5 85±0 .0 92降至 0 .170± 0 .0 2 8,差异有显著性 (P <0 .0 5 )。而AC的激活剂毛喉素则可以克服NB4 R1细胞对ATRA的耐药 ,ATRA 毛喉素组与ATRA组比较 ,CD11b阳性率由 (34.3± 5 .3) %升高至 (94 .6±2 .4 ) % ,NBT还原实验A540 值由 0 .110± 0 .0 2 8升高至 0 .395± 0 .0 4 9,差异有显著性 (P <0 .0 5 )。PDE的特异激活剂钙调蛋白以及拮抗剂 3 异丁基 1 甲基黄嘌呤 (IBMX)对ATRA的作用基本没有影响。结论　AC能否正常激活也许是APL对ATRA产生耐药的重要原因之一。     

冈田酸对全反式维甲酸诱导NB4、MR2细胞分化的影响

目的 探讨丝(苏)氨酸蛋白磷酸化酶2A(PP2A)抑制剂冈田酸(Okadaic acid,OKA)对全反式维甲酸(ATRA)诱导白血病细胞分化的影响,探讨PP2A活性与白血病细胞ATRA耐药的关系.方法 用ATRA、OKA、ATRA+OKA分别作用于急性早幼粒细胞白血病细胞系NB4细胞及其耐药细胞系MR2细胞,采用瑞特染色法和NBT还原实验观察细胞形态变化,流式细胞术分析细胞表面CD11b表达,丝(苏)氨酸蛋白磷酸化酶试剂盒检测细胞内PP2A活性,Western blot法检测细胞内PP2A各亚基表达.结果 ①细胞形态学、NBT还原实验及流式细胞术检测结果均显示,加入OKA抑制蛋白磷酸化酶活性能促进ATRA诱导的NB4细胞分化,并协同ATRA能诱导其耐药细胞MR2细胞发生部分分化.②酶活性分析显示,未处理的NB4细胞PPA活性为(959±83)pmol磷酸盐·min-1,μg蛋白-1;ATRA诱导NB4细胞分化过程中,PP2A活性明显下降[(534±43)pmol磷酸盐·min-1.μg蛋白-1],ATRA+OKA组PP2A活性下降更加明显[(229±23)pmol磷酸盐·min-1·μg蛋白-1];单用ATRA作用于MR2细胞,则PP2A活性无明显影响,而ATRA+OKA诱导MR2细胞分化中,PP2A活性下降.③Western blot.结果 显示,ATRA作用5d的NB4细胞中PP2A-C亚基表达较对照组明显减少,而A和B亚基表达与对照组比较变化不明显;在MR2细胞中,A、B和C亚基表达在处理组与对照组之间无明显差别.结论 ATRA诱导的NB4细胞分化过程中细胞内PP2A-C表达减少,PP2A活性降低.ATRA不能有效抑制MR2细胞内PP2A的活性,可能是MR2细胞对ATRA耐药的机制之一.     

三丁酸甘油酯对早幼粒细胞白血病细胞株的诱导分化及促凋亡作 …

目的 研究三丁酸甘油酯（ＴＢ）与全反式维甲酸（ＡＴＲＡ）不同浓度组合对ＮＢ４及ＭＲ２细胞的诱导分化作用,并观察ＴＢ对ＮＢ４,ＭＲ２细胞是否具有促凋亡作用。方法 通过硝基四唑氮蓝（ＮＢＴ）还原率及细胞表面抗原ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ３３表达观察细胞分化程度;通过细胞形态、ＤＮＡ片段化电泳,流式细胞术（ＦＣＭ）ＤＮＡ含量分析及凋亡细胞原位标记（ＴＵＮＥＬ）试剂盒检测细胞凋亡;用逆转录－聚合酶链反应（     

胆固醇合成抑制剂洛伐他汀对NB4细胞体外作用的研究

目的 研究胆固醇合成抑制剂洛代他汀（Lovastain,LOV)对NB4白血病细胞增殖、凋亡、分化的影响。方法 以NB4白血病细胞为模型,用MTT比色法、锥虫蓝拒染法首先观察LOV对细胞增殖及活力的影响。通过细胞形态学观察、NBT还原试验、DNA凝胶电泳、流式细胞术细胞周期分析、TUNEL、RT-PCR半定量测定bcl-2 mRNA水平,系统观察LOV对NB4体外诱导分化和凋亡的情况。最后利用RT-PCR半定量测定H、K、N-ras基因表达水平,结合流式细胞术进行胞膜P21^Ras蛋白测定,探讨LOV作用机制。结果 （1）LOV抑制NB4细胞增殖,IC50为12.59μmol/L。（2）LOV诱导NB4细胞凋亡,影响细胞周期进程,细胞阻滞于G1/S期。LOV在诱导细胞凋亡过程中随作用时间延长,bcl-2表达水平逐渐下降。（3）LOV不影响NB4细胞分化。（4）LOV作用于NB4细胞,H、K、N-ras基因转录水平无变化,但膜表面P21^Ras蛋白水平随时间进行性下降。结论 LOV抑制NB4细胞增殖并诱导凋亡,使细胞周期进程阻滞于G1/S期。bcl-2参与了LOV诱导NB4细胞凋亡的基因调控。LOV对NB4细胞分化无影响。p21^Ras蛋白异戊二烯化受抑而阻滞p21^Ras蛋白定位细胞膜上可能是LOV影响NB4细胞的主要机制。     

槲皮素对白血病细胞中PML基因及蛋白表达的影响和定位的研究

目的 探讨PML基因及蛋白在白血病细胞中的表达和细胞内分布定位。方法 经全反式维甲酸（ATRA）、槲皮素处理后的NB4、HL-60、K562细胞为研究对象，细胞形态学观察采用Wright染色法及荧光染色法；PML蛋白细胞分内分布定位采用免疫荧光技术；PML mRNA表达的检测采用RT-PCR法。结果 （1）ATRA处理后，NB4和HL-60细胞形态学上出现分化表现，K562细胞无变化；经槲皮素处理后，各组细胞形态学上均出现凋亡特征性改变。（2）ATRA处理后，NB4细胞内融合蛋白降解，PML蛋白恢复定位，HL-60、K562细胞内PML蛋白定位分布无变化；槲皮素处理后NB4细胞内融合蛋白降解，PML蛋白聚积于POD结构，随后降解，在HL-60及K562细胞，PML蛋白发生相似改变。（3）ATRA、槲皮素对各组细胞PMLmRNA表达均无显著影响。结论 在不同诱导剂刺激下，PML在蛋白水平参与细胞终末分化及诱导白血病细胞凋亡机制；PML蛋白在POD中发挥诱导凋亡、控制细胞生长的作用。