超声靶向微泡破碎介导EGFP基因转染肝癌细胞的影响因素研究

观察超声靶向微泡破碎(ultrasound targeted microbubble destruction,UTMD)在不同转染条件和细胞状态下对肝癌细胞HepG2转染率及细胞活性的影响.体外培养HepG2细胞,随机分为4组:质粒组、微泡+质粒组、超声+质粒组和超声+微泡+质粒组,各组再分为贴壁和悬浮状态2组.悬浮状态的超声+微泡+质粒组根据质粒和微泡浓度不同分为微泡浓度组和质粒浓度组,转染24h后在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白在HepG2细胞中的表达,流式细胞仪测定细胞转染率,MTT法检测细胞活性.结果 在超声声强2w/cm2、占空比20％、照射时间60s的超声参数作用下,质粒5μg/ml、微泡:细胞20∶1时,悬浮状态细胞转染率为7.33％±0.98％,存活率为90.37％±1.80％贴壁状态细胞转染率为1.56％±0.81％,存活率为81.10±1.26％,两者比较有显著差异(P＜0.01).悬浮状态下,提高质粒和微泡浓度至质粒10 μg/ml、微泡:细胞40∶1时转染效率增至15.63％±1.81％,且细胞生存率＞80％.结论 相同转染条件下悬浮状态细胞转染率及存活率明显优于贴壁状态.优化质粒、微泡浓度可进一步提高超声微泡介导的基因转染效率和存活率.     

siRNA对γδT细胞Eomes基因表达的抑制功能研究

本文旨在探讨RNA干扰对人外周血γδT细胞Eomes基因的表达和产生IFN-γ的抑制效应。化学合成3对EomessiRNA,脂质体转染试剂介导siRNA转染到用结核杆菌(Mtb)抗原刺激的人外周血单个核细胞中(主要是γδT细胞),通过转染条件优化后,对转染了siRNA的γδT细胞采用流式细胞术(FCM)进行分选,利用RT-PCR检测转染细胞EomesmRNA表达抑制率,以FCM检测转染前后γδT细胞IFN-γ产生的情况。结果显示,有2对siRNA能有效抑制Eomes的mRNA表达,并对γδT细胞IFN-γ的产生起抑制作用。提示Eomes siRNA可特异地抑制γδT细胞Eomes基因表达,Eomes可能是调控γδT细胞产生IFN-γ的重要转录因子。     

下调T细胞肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样分子2(TIPE2)促进T细胞增殖并增强其免疫活性

目的利用RNA干扰技术沉默小鼠脾脏T淋巴细胞肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样分子2(TIPE2)基因表达,观察TIPE2基因沉默对T淋巴细胞增殖及免疫活性的影响。方法磁珠分选T739小鼠脾脏T细胞,采用Western blot法筛选能有效沉默T淋巴细胞TIPE2基因的小干扰RNA(siRNA)序列。采用TIPE2特异性siRNA、阴性对照siRNA转染T细胞,在转染24 h后,流式细胞术检测T细胞表面CD69水平;转染72 h后,CCK-8法检测转染T淋巴细胞增殖情况,同时,ELISA检测转染T细胞上清液中白细胞介素2(IL-2)和γ干扰素(IFN-γ)分泌水平。结果成功筛选出特异性沉默TIPE2水平的siRNA序列,下调TIPE2基因表达后,T细胞CD69水平增加;T淋巴细胞增殖能力显著增强,IL-2和IFN-γ水平增加。结论下调TIPE2基因水平,促进T淋巴细胞增殖和免疫活性。     

超声微泡联合脂质体介导双自杀基因杀伤MCF-7细胞的实验研究

目的探讨超声辐照微泡联合脂质体介导双自杀基因(CD/TK)对MCF-7细胞的体外杀伤作用。方法将培养的MCF-7细胞分为5组:裸质粒组、脂质体组、超声辐照微泡组、超声辐照脂质体组、超声辐照微泡联合脂质体组。转染pEGFP-KDRp-CD/TK质粒于MCF-7细胞,用荧光显微镜及流式细胞仪检测转染效率。转染后,再分为空白对照组、未转染组、转染组;未转染组和转染组又各分为3个亚组,给予前药丙氧鸟苷(GCV)、5-氟胞嘧啶(5-Fc)、GCV+5-Fc。四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测双自杀基因对MCF-7细胞的体外杀伤作用。结果超声辐照微泡联合脂质体组绿色荧光蛋白(GFP)表达最多、最强。超声辐照微泡联合脂质体组转染率(39.59%±1.19%)最高(P0.05)。MTT检测细胞抑制率结果显示,转染组细胞抑制率明显高于未转染组(P0.01),转染组中联合用药组细胞抑制率明显高于单一用药组(90.77%±2.68%vs 64.75%±2.27%、67.81%±2.43%;P0.05)。转染组各前药组细胞抑制率均显著高于超声辐照微泡联合脂质体对MCF-7细胞的转染率(P0.05)。结论超声辐照微泡联合脂质体能明显提高基因转染效率,是较理想的乳腺癌基因治疗策略。     

超声微泡介导pEGFP-N1转染大鼠牙囊细胞:细胞生物学性质相对稳定

背景:利用超声波和微泡对比剂相互作用,产生空化效应和机械效应,破坏细胞膜的完整性,产生暂时性、可逆性的小孔,增加细胞膜的通透性,增强微泡载体对基因的转移,提高基因转染率。目的:探讨在超声波辐照下微泡对比剂介导p EGFP-N1质粒转染SD大鼠乳鼠牙囊细胞的效率及安全性。方法:体外原代培养新生SD大鼠牙囊细胞并传至第4代,在不同条件下采用p EGFP-N1质粒转染乳鼠牙囊细胞。以不同的超声辐照时间(15,30,45,60 s)和辐照强度(0.5,1 W/cm2)两两组合进行辐照,筛选较高转染效率的参数组合并应用于后续实验。实验分组为质粒组、微泡+质粒组、超声+质粒组、超声+微泡+质粒组和脂质体+质粒组。转染48 h后倒置荧光显微镜观察p EGFP表达,MTT法检测转染后的乳鼠牙囊细胞增殖抑制率。结果与结论:超声强度为0.5 W/cm2且辐照时间为30 s时转染率明显高于其他超声参数组合。该条件下超声微泡介导p EGFP-N1质粒对乳鼠牙囊细胞的转染率高于传统脂质体介导的转染率,且对细胞活力无明显影响。提示超声微泡能安全、高效介导p EGFP-N1质粒转染大鼠牙囊细胞,其细胞生物学性质相对稳定,可为牙周组织工程提供一种较理想的基因转染方法。     

抗CD20scFv-Fc-CD28/ζ基因修饰T细胞靶向杀伤Raji细胞的研究

目的 研究重组抗cD20scFv-Fc-CD28/ζ基因修饰T淋巴细胞在杀伤Raji细胞时T细胞活化情况和诱导Raji细胞凋亡的变化,进一步探讨特异基因修饰T细胞杀伤淋巴瘤细胞的机制.方法 将重组质粒转染至PA317细胞中,用转染成功的PA317培养液感染外周血T淋巴细胞后,用800μg/ml的G418筛选1周后杀伤Raji细胞,分别在不同时间点用流式细胞仪检测Raji细胞Bcl-2的阳性率,用ELISA检测培养上清液中的IL-10、IFN-γ.结果 Raji细胞Bcl-2的阳性率在24 h内就明显下降,72 h内由98.43%下降到38.45%,下降幅度明显高于对照组和空白组.72 h检测IL-10发现实验组为100.3 pg/ml,明显低于对照组(210.88 pg/ml)和空白组(286.71 pg/ml),同时IFN-γ的分泌量(1487.23 pg/ml)也显著高于对照组.结论 抗CD20介导的T细胞靶向杀伤Raji细胞不需要CD28的协同刺激.CD28和CD3ζ协同刺激可增强T细胞抑制Raji细胞TL-10表达使其降低Bcl-2的表达从而加速靶细胞的裂解.CD28/ζ在没有外源协同刺激分子B7/CD28时能允分激活T细胞,促进其分泌IFN-γ,增强了抗CD20修饰T细胞靶向杀伤Raji细胞的能力.     

鼠IL-28重组腺病毒体外抗肺癌活性研究

目的 将已成功构建的mIL-28A重组腺病毒载体转染至肺腺癌细胞LA795,并对其抗肺癌细胞生物学活性进行研究.方法 将Ad-pshuttle-cmv-mIL-28A转染至LA795细胞,用PCR、免疫细胞荧光、Tunel、Annexin V及MTT法等进行检测.结果 LA795细胞转染Af-mIL-28A后,MiL-28A的mRNA基因表达明显增加,且细胞内明显表达IL-28蛋白,LA795细胞凋亡增多,细胞生长明显抑制.结论 成功构建的mIL-28A重组腺病毒载体转染至肺腺癌细胞LA795后表达IL-28,且可能通过促进细胞凋亡而抑制其一定程度的生长.

Abstract：

Objective To transfect the recombinant mIL-28A adenovirus vector into lung adenocarcinoma cell line LA795 and research its anticancer activity. Methods Transfected the constructed mouse IL-28(mIL-28) recombinant adenovirus vector into LA795 cell line, detected with PCR, immunocytal fluorescence, Tunel, Annexin V and MTT. Results Transfected with rAd-mlL-28A into the LA795 cells, mIL-28A gene expression products mRNA increased obviously, IL-28 expression was detected in cells obviously,apoptosis cell number increased, and the growth of LA795 cells transfected with rAd-mIL-28A were inhibited obviously. Conclusion The recombinant miL-28A adenovirus vector we have constructed, which expresses IL-28 when transfected to lung adenocarcinoma cell line LA795, inhibits growth of carcinoma cell to some extent, and may work by promoting the apoptosis of cancer cells.     

超声微泡联合脂质体介导双自杀基因杀伤 MCF-7 细胞的实验研究简

目的探讨超声辐照微泡联合脂质体介导双自杀基因（CD/TK）对MCF-7细胞的体外杀伤作用。方法将培养的MCF-7细胞分为5组：裸质粒组、脂质体组、超声辐照微泡组、超声辐照脂质体组、超声辐照微泡联合脂质体组。转染DEGFP-KDRp-CD／TK质粒于MCF-7细胞.用荧光显微镜及流式细胞仪检测转染效率。转染后,再分为空白对照组、未转染组、转染组;未转染组和转染组又各分为3个亚组,给予前药丙氧鸟苷（GCV）、5-氟胞嘧啶（5-Fc）、GCV＋5-Fc。四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测双自杀基因对MCF-7细胞的体外杀伤作用。结果超声辐照微泡联合脂质体组绿色荧光蛋白（GFP）表达最多、最强。超声辐照微泡联合脂质体组转染率（39.59％±1.19％）最高（P〈0.05）。MTr检测细胞抑制率结果显示,转染组细胞抑制率明显高于未转染组（P〈0.01）,转染组中联合用药组细胞抑制率明显高于单一用药组（90.77％±2.68％vs64.75％±2.27％、67.81％±2.43％：P〈0.05）。转染组各前药组细胞抑制率均显著高于超声辐照微泡联合脂质体对MCF-7细胞的转染率（P〈0.05）。结论超声辐照微泡联合脂质体能明显提高基因转染效率,是较理想的乳腺癌基因治疗策略。     

腺病毒介导的mPPARγ1基因转染抑制IFN-γ诱导ECV304细胞galectin-9基因和蛋白表达

目的：观察腺病毒介导的mPPARγ1转染抑制IFN-γ诱导ECV304细胞galectin-9基因和蛋白表达。方法：构建表达小鼠PPARγ1基因的复制缺陷型腺病毒表达载体；将融合80%的ECV304细胞给予不同刺激量（1×104 U/L、5×104 U/L、1×105 U/L和2×105 U/L）的IFN-γ干预；将IFN-γ（1×105 U/L）预刺激并孵育 24 h 的ECV304细胞分成对照组（C）、PPARγ基因过度表达组(P)、PPARγ活化剂曲格列酮干预组(T)以及PPARγ基因过度表达和曲格列酮共刺激组(PT)进行干预，观察不同剂量IFN-γ对ECV304细胞galectin-9基因和蛋白表达的作用，以及PPARγ基因过度表达和/或活化对上述作用的影响。结果：正常ECV304细胞galectin-9基因表达弱。IFNγ孵育24 h后， ECV304细胞galectin-9基因和蛋白表达增加，且galectin-9表达与IFN-γ具有量效关系。PPARγ1基因转染抑制IFN-γ诱导galectin-9基因/蛋白表达，曲格列酮对上述作用无影响；PPARγ1基因转染和曲格列酮共刺激抑制IFN-γ诱导galectin-9基因/蛋白表达与单一PPARγ1基因转染效应相似。正常ECV304细胞PPARγ表达量低，而PPARγ基因过表达和活化不影响内源性PPARγ基因表达。结论：PPARγ1基因转染抑制IFN-γ诱导ECV304细胞galectin-9基因/蛋白表达可能是PPARγ基因发挥免疫调控作用的一个重要机制。     

siRNA和shRNA在syt基因沉默中的一致性

目的通过小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)和短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)对PC12细胞中Synaptotagmin(syt)基因表达沉默效果的比较,确认siRNA在基因沉默中与shRNA的等效性.方法用T7 RNA聚合酶体外合成的针对syt Ⅰ与Ⅸ的siRNA和在H1.1载体上构建的shRNA表达质粒转染PC12细胞,用标记荧光蛋白和免疫荧光检测shRNA和siRNA的转染率,用Western印迹方法检测沉默效果.结果siRNA和shRNA在PC12细胞中沉默syt Ⅰ和Ⅸ的表达时,有一致的沉默效率.结论siRNA可作为基因沉默中快速筛选的工具,可在RNA干扰的应用中与shRNA 配合使用.     

沉默MKRN1基因表达对人胚胎肾细胞HEK-293T增殖及凋亡的影响

背景：研究报道敲低MKRN1可以抑制肿瘤细胞的生长,但MKRN1是否作为肿瘤相关蛋白在机体发挥作用还需进一步研究。由于siRNA介导的基因沉默是瞬时表达,持续时间短且常规慢病毒技术存在脱靶效应,利用四环素调控(Tet-on)慢病毒系统构建稳定沉默MKRN1基因的细胞系有着可逆的优势,且可规避上述缺点,对于深入研究MKRN1的生物学功能有重要的意义。目的：构建Tet-on慢病毒系统介导的MKRN1基因沉默载体,研究沉默MKRN1基因表达对人胚胎肾细胞HEK-293T增殖、凋亡的影响。方法：采用RNAi技术,针对MKRN1基因设计3条shRNA(命名为sh1,sh2,sh3),将3条shRNA序列连入四环素诱导表达载体pTripz中验证连入序列;通过三质粒系统转染HEK-293T细胞,并用含有1 mg/L强力霉素的完全培养基培养,进行慢病毒包装,收取48 h及72 h病毒液,将其浓缩后感染HEK-293T细胞,感染48 h后用荧光显微镜观察病毒感染效率。通过实时荧光定量PCR、Western blot检测MKRN1的敲减效率;Western blot检测四环素诱导表达系统是否构建成功;通过...     

人4-1BB配体基因真核表达载体的构建、表达及其体外抗肿瘤效应

目的： 构建人4-1BB配体（h4-1BBL）全长基因的真核表达载体, 并在肿瘤细胞HT-29中转染表达; 探讨人4-1BBL基因转染的肿瘤细胞体外诱导的抗肿瘤活性.方法： 用RT-PCR从Raji细胞中克隆h4-1BBL全长基因, 测序后, 构建重组真核表达载体pcDNA3.1（-）-h4-1BBL.通过脂质体法以重组载体转染HT-29细胞, 用RT-PCR检测转染细胞中h4-1BBL mRNA的表达; 用流式细胞术检测转染细胞表面h4-1BBL分子的表达.分离外周血单个核细胞（PBMC）, 用抗CD3 mAb扩增T细胞, 并与h4-1BBL基因转染及未转染的HT-29细胞混合培养.用MTT比色法检测CTL的增殖及杀伤活性; 用流式细胞术检测分泌IFN-γ的T细胞.结果： 从Raji细胞中克隆到h4-1BBL全长cDNA, 测序完全正确.构建的h4-1BBL基因真核表达载体在HT-29中获得稳定表达.与未转染的细胞相比较, h4-1BBL基因转染的肿瘤细胞HT-29能更有效地刺激T细胞活化、增殖, 促进IFN-γ分泌, 并能有效地诱导CTL产生针对野生型HT-29细胞的特异性杀伤.结论： 成功地构建pcDNA3.1（-）h4-1BBL重组真核表达载体.4-1BBL基因转染的肿瘤细胞介导的协同刺激信号, 能增强野生型肿瘤细胞的免疫原性, 诱导T细胞产生有效的抗肿瘤免疫应答.     

人MutS同源蛋白2(hMSH2)过表达的肺癌细胞模型的构建

目的构建人Mut S同源蛋白2(h MSH2)过表达的肺癌细胞模型,探究h MSH2分子介导γδT细胞杀伤肺癌细胞的效应。方法 PCR扩增h MSH2编码序列,同源重组法构建h MSH2-EGFP融合蛋白过表达载体;转染肺癌细胞系NCI-H520细胞以构建h MSH2分子过表达的NCI-H520细胞模型;Western blot检测细胞中h MSH2分子表达,流式细胞计量术检测细胞膜上h MSH2分子表达,体外扩增人外周血单个核细胞中的γδT细胞,乳酸脱氢酶释放法检测γδT细胞对过表达h MSH2的NCI-H520细胞的杀伤效率。结果获得h MSH2编码序列(2 805 bp),构建Fugw-h MSH2重组载体,酶切鉴定结果与预期目的条带大小相符;h MSH2-EGFP融合蛋白在NCI-H520细胞中得到表达,过表达h MSH2的NCI-H520细胞表面的h MSH2分子水平显著升高(P0.001);γδT细胞对过表达h MSH2的NCI-H520细胞的杀伤效率较野生型NCI-H520细胞显著升高(P0.05)。结论成功构建h MSH2分子过表达的肺癌细胞模型;细胞膜上表达水平上调的h MSH2分子增强了γδT细胞对肺癌细胞的细胞毒作用。     

RNA干扰致基因表达沉默细胞模型的建立

目的探讨siRNA和shRNA在基因功能研究中的应用。方法用化学方法合成siRNA,以及用常规的分子克隆方法构建shRNA表达载体。以人类K562细胞为实验对象,采用lipofectamine将MDM2基因的siRNA和shRAN表达载体导入细胞后,用多重RT鄄PCR和Westernblot检测目标基因MDM2的表达水平。结果K562细胞瞬时转染MDM2siRNA48h后,MDM2蛋白质表达下降超过60%;稳定转染shRNA表达载体后,MDM2基因在mRNA和蛋白质表达水平下降超过70%。实验结果表明成功地建立了MDM2表达下调的实验细胞模型。结论siRNA和shRNA都能有效地导致目标基因表达沉默,在基因功能研究中瞬时转染和稳定转染需要配合使用以获得更理想的实验结果。     

超声靶向微泡破坏技术介导报告基因对骨骼肌基因转染及不同给药途径的作用评价

目的 探讨超声靶向微泡破坏(UTMD)对小鼠骨骼肌基因转染的有效性,比较不同给药途径及报告质粒转染效率的差异.方法 实验随机分为单纯质粒注射组(P)、质粒+微泡组(P+MB)、质粒+超声辐照组(P+US)、质粒+微泡+超声辐照组(P+UTMD)4组.将绿色荧光蛋白(GFP)质粒或红色荧光蛋白(RFP)质粒分别与微泡(或生理盐水对照)混合,将混合物分别予以局部注射(单侧鼠胫骨前肌)和尾静脉注射,进行或不进行超声辐照,辐照频率为3 MHz、声强为1.0 W/cm2,辐照2 min,7d后处死小鼠,分别取各组小鼠的肝、心、骨骼肌组织制备冰冻切片.应用激光共聚焦显微镜检测各组小鼠骨骼肌组织荧光蛋白质粒GFP、RFP的转染效率;分析P+UTMD组小鼠肝脏、心脏组织中的荧光素酶活性;苏木精-伊红(HE)染色观察P+UTMD组小鼠肝、心、骨骼肌组织的病理学改变;对比P+UTMD组小鼠局部肌肉注射和尾静脉注射时不同的给药途径下肝、心、骨骼肌组织基因转染的效果.结果 单纯质粒注射组骨骼肌组织每个视野只有少数细胞表达RFP和GFP,表达率为(1.83±1.21)％、(1.18±0.25)％,P+MB组和P+US组的RFP、GFP表达率与单纯质粒注射的效果相当[(2.33±1.39)％、(3.42±1.09)％和(3.48±0.18)％、(2.52±0.33)％];而P+UTMD组RFP、GFP的表达率为(23.96±2.13)％、(25.69±1.98)％,显著高于其他3组(P＜0.05).P+UTMD组小鼠部分肝脏和心脏中均有较微弱的荧光表达,HE染色未发现UTMD对肝、心、骨骼肌组织造成明显的损伤,完整性良好,无感染、出血、水肿及细胞死亡.直接肌肉局部注射质粒联合UTMD能显著增强小鼠骨骼肌局部的基因转染,显著优于尾静脉注射(P＜0.05).结论 UTMD可有效促进基因转移,局部注射联合UTMD能显著增强骨骼肌局部基因转染,是一种安全、高效的基因转染新技术.     

辣椒素对人γδT细胞杀伤人骨肉瘤HOS细胞的影响

探讨辣椒素对人γδT细胞体外增殖及杀伤骨肉瘤细胞的影响及作用机制。分离健康人PBMC,加入到含异戊烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate,IPP)和IL-2的DMEM-F12完全培养基中诱导培养γδT细胞。不同浓度的辣椒素作用于γδT细胞48h后,CCK-8法检测各药物浓度组γδT细胞的增殖能力,采用流式细胞术检测各组γδT细胞穿孔素、颗粒酶B、CD107a及IFN-γ的表达,用LDH释放法检测各组γδT细胞对骨肉瘤HOS细胞的体外杀伤活性。结果显示,培养7d时各组γδT细胞纯度达到了(85.33±6.07)%。浓度为3.2~50μmol/L的辣椒素能显著促进γδT细胞的增殖,在浓度为25μmol/L时其穿孔素、颗粒酶B、CD107a及IFN-γ的表达均显著高于对照组,且对人骨肉瘤HOS细胞的体外杀伤活性显著增强。以上结果提示辣椒素在体外能通过促进γδT细胞穿孔素、颗粒酶B和IFN-γ的表达上调显著增强其抗骨肉瘤细胞活性。     

超声激励bFGF微泡促进组织细胞转染的体外实验研究

目的利用超声激励微泡促进碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)目的基因表达,为组织修复提供细胞水平基础。方法构建并提取b FGF目的基因质粒,其含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)作为标记基因,制备并鉴定含bFGF-EGFP基因微泡。将细胞成功分离、培养后,在不同实验条件下(质粒质量浓度、声强、辐照时间和占空比)进行超声激励微泡参数优化,根据每组条件下最优的细胞存活率和标记基因转染效率所对应的参数作为后续实验超声辐照条件。实验分为4组:A组为对照组,B组为单纯bFGF-EGFP质粒组,C组为超声辐照+普通脂质微泡组,D组为超声辐照+bFGF-EGFP微泡组。细胞转染24 h后,在倒置荧光显微镜下观察EGFP表达情况;转染48 h后,用流式细胞仪检测转染效率,CCK8法检测细胞存活率,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和Western blot分别检测mRNA和蛋白的相对表达量,并比较4组间的差异来评价超声激励bFGF微泡在细胞水平的生物学效应。结果携带bFGF-EGFP质粒微泡粒径大小约为(941.7±101.2) nm,Zeta电位大小约为(20.8±4.5) mV。实验研究中最优超声参数为质粒质量浓度20μg/mL,声强1.50 W/cm2,辐照时间60 s,占空比40%。细胞转染24 h后,A组和C组未见明显EGFP表达,B组有少量EGFP表达,而D组EGFP表达量明显增多。转染48 h后,4组细胞存活率均 80%,各组间差异无统计学意义(P 0.05)。流式细胞仪测量转染效率在D组[(60.0±7.9)%]较其他各组明显增加,差异有统计学意义(P 0.05)。转染48 h后,超声激励目的基因bFGF转染后D组mRNA[(45.0±5.1)%]和蛋白相对表达量[(35.0±5.0)%]均明显增高,而D组Ⅰ型胶原蛋白[(9.1±3.0)%]和Ⅲ型胶原蛋白[(11.2±3.1)%]较其他组均明显降低,差异均有统计学意义(P 0.05)。结论超声优化参数激励bFGF微泡可提高细胞转染效率并保持较高的细胞活性,促进bFGF表达效率并抑制Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白;这种超声物理效应和bFGF生物效应相结合的方式为皮肤组织在细胞水平修复提供了新策略。     

SOCS1沉默增强树突状细胞抗喉癌免疫效应

目的研究SOCS1沉默的树突状细胞特异性抗肿瘤作用机制,并探讨RNAi技术在喉癌基因治疗中的应用前景,为树突状细胞的临床应用提供新思路和理论依据。方法以细胞因子GM-CSF、IL-4和TNF-α体外诱导扩增外周血单核细胞来源的DC,倒置显微镜下观察DC形态特征;构建RNAi载体转染DC,Western blot检测SOCS1的表达情况,筛选抑制SOCS1表达的有效靶序列;流式细胞术检测DC表面分子CD83、CD86和HLA-DR的表达;ELISA法分析上清中IFN-γ的含量;MTT法评估DC刺激T细胞增殖的能力及诱导细胞毒性T细胞的杀伤活性。结果 DC体外诱导培养成功;设计的RNAi载体经测序验证无误。干扰序列5可显著下调SOCS1表达水平;SOCS1沉默联合喉癌Hep-2抗原致敏的DC可显著上调表面分子标志CD83(85.61±0.96)%、CD86(96.86±1.20)%和HLA-DR(98.02±0.94)%的表达;该组DC能有效刺激T细胞增殖,增加IFN-γ的分泌量,最终增强CTL的特异性杀伤作用,效靶比为50:1时其杀伤活性显著高于对照组(P<0.01)。结论 SOCS1沉默并负载喉癌Hep-2抗原的DC可以产生高效而特异性的抗喉癌免疫应答。     

脂质体介导E1A-TK基因转染人肺腺癌细胞A549体外研究

目的用脂质体转染真核表达质粒PcDNA3E1A-TK人人肺腺癌细胞A549,观察丙氧鸟苷（GCV）、X射线及二者联合对转染细胞的体外杀伤作用。方法用阳离子脂质体介导真核表达质粒PcDNA3E1A-TK转染人肺腺癌细胞A549,PCR、RT—PCR方法分别检测转染细胞中E1A—TK基因DNA整合、mRNA表达。MTT法测不同浓度GCV、不同剂量X射线及一定剂量X线照射后再给一定量GCV对转染细胞的生长抑制率。结果PCR、RT-PCR结果表明转染细胞有E1A-TK基因整合、mRNA表达。根据IC50,转染细胞对GCV、X射线的敏感性分别比亲代细胞提高111．3倍和2．9倍,在作用相同时间后,GCV＋X线照射治疗对转染细胞的生长抑制作用比单纯GCV或X线治疗明显增强（P〈0．01）。结论脂质体介导外源基因E1A—TK成功转入人肺腺癌A549细胞并获得表达：转染细胞获得了对GCV和X线的敏感性,GCV和X线对转染细胞有协同杀伤作用。     

白蛋白微泡促进报告基因在细胞表达的实验研究

目的: 探讨白蛋白微泡作为非病毒载体在基因传输中的作用。方法:6孔板培养脐静脉内皮细胞(EC)和血管平滑肌细胞(VSMC),每孔加pcDNA3.1/His/LacZ质粒20 μg,加不同浓度微泡或不加微泡,超声条件为连续波,频率2MHz,机械指数1.8,照射时间1 min,48 h后计算蓝染细胞百分率和β-半乳糖苷酶活性。另以不同浓度微泡及超声照射时间处理细胞,测定细胞增殖情况。结果:与单纯超声质粒组相比,含微泡组蓝染细胞率增加约10-15倍(其中内皮细胞组11.6倍,平滑肌细胞组15.2倍),报告基因表达定量增加近8倍。微泡浓度为10％时细胞转染效率最高。超声照射对细胞增殖无影响,微泡浓度为50％时有明显的细胞毒作用。结论:白蛋白微泡在超声作用下能明显增加基因的传输效率,有可能成为一种安全有效的基因治疗的载体。