基于同源模建技术的抗肝癌单链抗体人源化抗体库设计

目的完成抗肝癌噬菌体单链抗体sc Fv DM的人源化设计,为进一步构建人源化抗肝癌噬菌体单链抗体库奠定基础。方法通过IgBlast搜索基因数据库获取鼠源抗体序列模板,从蛋白质晶体结构数据库获得结构模板;在SGI图形工作站上,通过InsightlⅡ软件包进行抗肝癌噬菌体单链抗体scFv DM的三维结构模建,分析抗体氨基酸序列和分子结构,确定影响抗原结合部位的框架区关键残基。结果成功模建抗肝癌噬菌体单链抗体scFv DM的三维结构,确定AAW67378、BAB18257分别为单链抗体scFv DM的重链和轻链框架区最佳人源化模板,确定了人源化残基、回复突变的残基,将可能影响抗原结合位点结构的残基的鼠源和人源副本编入到人源化抗体库序列中。结论计算机辅助下的同源模建技术可为抗体人源化设计提供方案,为抗肝癌噬菌体单链抗体scFv DM同步实现人源化和优化提供可能性。     

抗弓形虫主要表面抗原1单链抗体的筛选及鉴定

目的采用重组抗原从人源化单链抗体库(Human single fold scFv library)中筛选和鉴定抗弓形虫主要表面抗原1(rSAG1)的单链抗体,对其特异性的弓形虫靶向作用进行分析,为弓形虫靶向生物治疗提供靶向分子。方法以重组SAG1融合蛋白作为包被抗原对噬菌体抗体库进行3轮固相筛选,获得抗rSAG1融合蛋白的阳性克隆;用纯化的原核表达载体pET-32C的亲和标签(Trx-His-Stag)、鼠可溶性抗原和大肠杆菌抗原对上述阳性克隆进行差异筛选,获得能特异性结合rSAG1的噬菌体克隆;差异筛选获得的特异性阳性克隆转染大肠杆菌HB2151进行诱导表达和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测,获得能分泌抗rSAG1单链抗体(anti-rSAG1scFv)的阳性噬菌体克隆;DNA测序分析抗rSAG1的单链抗体基因序列。用Ni2 螯合柱亲和纯化rSAG1单链抗体,并用免疫印迹技术(Westernblot)对纯化的抗rSAG1单链抗体进行免疫反应性检测;免疫组化检测rSAG1单链抗体对弓形虫速殖子的靶向作用。结果经过rSAG1抗原的固相筛选后获得24株阳性克隆,差异筛选后获得5株能特异性结合rSAG1的噬菌体克隆,其中有3株分泌性表达抗rSAG1的单链抗体,DNA测序和Genbank比对表明其为3株不同的抗弓形虫主要表面抗原1的单链抗体;West-ernblot表明亲和纯化的单链抗体能较好结合rSAG1;免疫组化显示抗rSAG1单链抗体可与弓形虫速殖子结合。结论利用噬菌体抗体库技术获得的特异性人源rSAG1单链抗体与弓形虫速殖子有较强的结合能力,这对弓形虫的靶向生物治疗具有潜在应用价值。     

从人源免疫抗体库筛选抗乙型肝炎病毒PreS1单链抗体

目的 获得高亲和力的全人源化抗乙型肝炎病毒PreS1的单链抗体。 方法 以健康供血者的外周血淋巴细胞为来源,以PreS1肽体外致敏后,借助噬菌体展示技术构建人源免疫单链抗体库,库容量7×10 8。 结果 以PreS1肽进行3轮固相筛选。获得了亲和力10 7～10 8mol/L的抗PreS1单链抗体。结论 通过体外致敏的方法构建人源免疫抗体库,可以快速获得高亲和力基因工程抗体。     

从人源大容量天然抗体库中筛选到抗禽流感病毒H5N1单链抗体

目的从人源大容量天然抗体库中筛选到抗禽流感病毒H5N1单链抗体。方法运用噬菌体表面呈现技术,用纯化的H5N1禽流感血凝素蛋白HA（A/Anhui/1/2005）对人源大容量天然抗体库进行富集筛选,对获得的阳性克隆进行序列分析,并将其克隆入携带人源Fc段的表达载体,实现scFv-Fc融合抗体的分泌型表达。用ELISA、IFA对所获人源单抗的功能特性进行鉴定。结果经过3轮富集筛选,共获得了82株特异性结合H5N1禽流感病毒HA的人源scFv单链抗体,分别属于5个不同的抗体序列,ELISA、IFA表明从抗体库筛选获得的5株人源单抗与禽流感病毒H5N1及其HA具有较好的特异性,而与甲1型和甲3型人流感病毒无交叉反应。结论从人源大容量天然抗体库中利用高通量的筛选策略在短时间内获得抗禽流感病毒H5N1人源单抗,对于禽流感的紧急预防和治疗具有重要意义。     

抗日本血吸虫噬菌体抗体库的筛选和阳性克隆的鉴定

目的　研制抗日本血吸虫循环抗原SjMAg的单链抗体。　方法　用日本血吸虫成虫代谢抗原SjMAg包板,对已构建的抗日本血吸虫噬菌体抗体库进行3轮富集,然后用ELISA法从富集的次级抗体库中筛选阳性克隆,最后借助ELISA、SDSPAGE和Western印迹等方法,根据阳性克隆表达产物与其它4种吸虫抗原反应的情况,进行特异性鉴定。　结果　从随机挑取的72个克隆中筛选到阳性克隆6个,经交叉筛选和鉴定最终获得特异性抗日本血吸虫阳性克隆2个。　结论　用固相富集和ELISA筛选法可以从抗体库中有效地筛选到抗日本血吸虫循环抗原的阳性克隆,获得的抗体克隆可用于抗日本血吸虫循环抗原单链抗体的制备。     

全人源肝癌噬菌体单链抗体基因的克隆及活性分析

从噬菌体单链抗体库中筛选克隆全人源肝癌抗体基因并进行活性鉴定.PCR鉴定阳性重组菌中人肝癌ScFv的插入率,以肝癌细胞SMMC-7721为抗原对所建抗体库进行4轮"吸附-洗脱-扩增"的亲和筛选.将筛选后的ScFv采用ELISA法鉴定其与人肝癌细胞的结合活性.ScFv基因插入率为70%.在亲和筛选过程中,肝癌噬菌体单链抗体得到富集,收获率逐轮提高,第4轮为第一轮的381倍.利用噬菌体抗体库技术筛选出了肝癌噬菌体单链抗体,且筛选后的抗体片段与人肝癌细胞有特异性的结合活性.     

抗肝癌单链抗体体外亲和力成熟的改造及意义

目的从体外模拟抗体的体内成熟过程,以获得高亲和力抗肝癌单链抗体。方法采用错配聚合酶链反应(PCR)法随机突变抗肝癌单链抗体重链和轻链可变区,构建抗肝癌噬菌体抗体次级突变库,利用噬菌体展示技术从中筛选出高亲和力单链抗体突变株。结果抗肝癌噬菌体抗体次级突变库容为4．5× 10~7,经过3轮富集筛选和酶联免疫吸附法鉴定获得2株突变株M90、M116,不仅保留原始克隆的特异性,而且相对亲和力指数分别为原始克隆的1．7倍和2倍。结论错配PCR结合噬菌体展示技术是提高单链抗体亲和力的一种有效且简便的手段。     

拮抗甲状腺刺激性抗体单链抗体的制备及鉴定

目的 构建一个针对Graves病(GD)患者IgG的鼠单链抗体,体外实验证明其是否具有拮抗甲状腺刺激性抗体(TSAb)的能力.方法 利用噬菌体展示技术,得到一个抗TSAb的噬菌体抗体scFv,测定其相对亲和力.用表达重组人促甲状腺激素受体(hTSHR)的中国仓鼠卵巢细胞测定GD患者血中TSAb水平,并观察此scFv片段对GD患者IgGs诱导cAMP释放的抑制作用.结果 16例GD患者中有13例TSAb活性被scFv克隆T17显著抑制(最大抑制率为88%),相对亲和力为2.8 mol/L.结论 本实验利用噬菌体展示技术,筛选出一个具有较强拮抗TSAb活性的scFv克隆(T17).     

两株抗肝癌细胞单链抗体三维结构的同源模建

目的模建特异性抗肝癌单链抗体Hsc Fv 4-16和sc Fv DM的三维结构,比较两者结构的异同,为高亲和力的抗肝癌单链抗体的人源化设计提供结构信息。方法采用同源模建技术,在SGI图形工作站上,通过Accelrys公司InsightⅡ软件包的Homology模建分子结构,用Discover进行分子力学和动力学优化,最后用Prostat验证模拟结构的合理性。结果 Hsc Fv 4-16和sc Fv DM六个CDR襻位于Fv段的N端,形成一个与抗原结合的口袋,口袋分别深15.6和16.1。其中CDRL3和CDRH3与抗原最接近,有较多接触。sc Fv DM的CDRL3和CDRH3两个襻比sc Fv 4-16的更靠近中央。结论采用同源模建技术成功模建特异性抗肝癌单链抗体Hsc Fv 4-16和sc Fv DM的三维结构,sc Fv DM的三维结构显示与抗原的结合更紧密,亲和力比Hsc Fv 4-16高,与实验检测结果一致。     

可溶性HCV非结构蛋白NS3人源单链可变区抗体在大肠杆菌中的表达

目的 获得可溶性的抗丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS3的人源单链可变区抗体(ScFv),为得到纯度高、活力强的NS3 ScFv和进一步HCV的治疗奠定基础。方法 采用噬菌体表面展示技术,以重组的HCV非结构蛋白NS3为包被抗原,从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮“吸附-洗脱-扩增”筛选过程,获得抗原结合活性较强的HCVNS3人单链抗体ScFv片段克隆,并对其进行DNA序列及免疫活性测定。从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒转化琥珀突变非抑制型大肠杆菌HB2151;IPTG诱导表达HCV NS3可溶性单链抗体;ELISA和dot blot检测其抗原结合特异性。结果 克隆了HCV NS3的单链可变区抗体基因,经DNA酶切和序列分析表明,该抗体基因由747个碱基组成。ELISA和dot blot结果表明,在大肠杆菌HB2151中经IPTG诱导表达的可溶性HCV NS3的单链可变区抗体,具有结合丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3的特异性和免疫活性。结论 克隆、鉴定并在大肠杆菌HB2151中表达了可溶性的ScFv-NS3。     

What a difference a day makes

With the availability of group A beta-hemolytic streptococcal (GABHS) antigen detection tests, the management of adult pharyngitis is being reassessed. A decision analytic model was developed which considered four strategies: immediate treatment, no treatment, performing a rapid antigen test, or obtaining a bacterial culture. Patient outcomes were expressed in “well” days, which were reduced by the “sick” days associated with adverse reactions to treatment or complications of GABHS infection. When immediate test results are available, testing is the optimal strategy for probabilities of GABHS between 1 and 49 per cent. This range includes almost all patients, using probability estimates based on clinical criteria. The absolute benefit of testing was 0.1 days. The major advantage of a rapid test is the avoidance of penicillin reactions. Variations in the symptomatic benefits of treatment had minimal effects on the analysis. The analysis supports the use of an antigen test for adult patients with pharyngitis. Received from the Division of General Medicine and Primary Care. Department of Internal Medicine, Medical College of Virginia, Virginia Commonwealth University, Richmond. Virginia. A preliminary version of this work was presented at the seventh annual meeting of the Society for Medical Decision Making, October 21, 1985.