1504-siRNA对EphA3表达肿瘤细胞HCT116的抑制作用研究

目的研究原癌基因EphA3的小干扰RNA(small interfering RNA)1504-siRNA对高表达结肠癌细胞HCT116的增殖抑制作用。方法将1504-siRNA质粒用Vigofect转染试剂瞬时转染HCT116细胞,36～48 h后,收集蛋白,用Western印迹检测EphA3及AKT信号通路中的蛋白分子表达,收集细胞,进行噻唑蓝(MTT)实验、平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。结果 1504-siRNA能抑制HCT116细胞的EphA3蛋白水平,抑制其增殖、平板克隆和软琼脂克隆的形成,抑制pmTOR、p-c-Raf、pAKT、p-4ebp1等信号分子的表达。结论 1504-siRNA抑制HCT116细胞的增殖、存活能力和恶性程度,这可能是通过抑制AKT信号通路来实现,它有望作为肿瘤治疗的候选药物。     

长非编码RNA HOXD-As2通路抑制直肠癌细胞增殖、转移作用机制研究

目的 探讨长非编码RNA(LncRNA)HOXD-As2通路抑制直肠癌细胞增殖、转移的潜在机制。方法 在直肠癌HCT116与HT29细胞中,转染阴性设为对照组,转染LncRNA HOXD-As2过表达质粒设为HOXD-As2组;转染空载体Vector设为Vector组,转染HOXD8过表达质粒设为HOXD8组。采用荧光素酶报告实验检测LncRNA HOXD-As2与靶基因HOXD8的相互作用。检测并比较4组细胞活力、增殖、侵袭、细胞迁移水平、上皮-间质转化相关蛋白表达水平及磷酸化蛋白激酶B/蛋白激酶B(p-AKT/AKT)、磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶/磷脂酰肌醇-3-激酶(p-PI3K/PI3K)、磷酸化雷帕霉素机械靶蛋白/雷帕霉素机械靶蛋白(p-mTOR/mTOR)蛋白相对表达水平。结果 与对照组相比,HOXD-As2组荧光素酶活性下降,而mRNA、蛋白相对表达情况增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,HOXD-As2组直肠癌细胞HCT116、HT29中HOXD8的mRNA与蛋白表达水平均显著上升,差异均有统计学意义(P<0.05)。与Vector组相比...     

驱动蛋白家族成员2A与结直肠癌临床特征/预后的关联及其对癌细胞增殖/侵袭的调控作用

目的 旨在探究结直肠癌患者中驱动蛋白家族成员2A（Kinesin Family 2A,KIF2A）的表达,其与患者临床病理特征和预后的相关性,以及敲降KIF2A对结直肠癌细胞HCT116增殖、侵袭、迁移,以及其下游PI3K/AKT信号通路的影响。方法 回顾性分析2016年1月至2019年12月98例经手术切除治疗的结直肠癌患者,并采用免疫组织化学染色方法（Immunohistochemistry,IHC）测定患者术中留存的癌组织和癌旁组织KIF2A的表达,通过在HCT116细胞中转染抑制KIF2A表达的小分子化合物（KIF2A、ShRNA）来探究。结果 根据IHC染色评分,将KIF2A表达水平划分为高表达（IHC评分＞3）和低表达（IHC评分≤3）。收集患者术前肿瘤特征,获取患者的生存随访信息,并计算总体生存期（Overall Survival, OS）。敲降KIF2A对细胞的作用通结果显示,KIF2A在癌组织中显著高于癌旁组织（P <0.001）。且癌组织KIF2A高表达与较大的肿瘤直径、淋巴结转移、较高的N分期和TNM分期相关 （P <0.05）。此外,KIF2A高表达患者OS显著低于KIF2A低表达患者;进一步分析结果显示,KIF2A高表达是较差OS的独立预测因素（P <0.05）。此外,细胞实验结果表明,敲降KIF2A可通过靶向PI3K/AKT信号通路,从而抑制HCT116的恶性增殖和迁移,促进其凋亡。结论 KIF2A与结直肠癌的肿瘤特征以及不良预后相关,且敲降KIF2A可抑制PI3K/AKT信号通路的激活,从而抑制结直肠癌细胞恶性增殖、迁移能力,促进其凋亡,表明其有成为结直肠癌标志物的潜能。     

MIIP基因对人胶质瘤细胞U87增殖能力与放疗敏感性影响

目的探讨过表达迁移侵袭抑制蛋白(MIIP)基因对人胶质母细胞瘤细胞系U87放疗敏感性的影响。方法采用过表达MIIP基因慢病毒转染U87细胞,通过Western blot实验检测转染效率;MTT实验检测MIIP基因对U87细胞活力的影响;应用平板克隆形成实验,评价放射线照射对MIIP过表达组与对照组克隆形成能力的影响;进一步应用Western blot实验检测RAD51蛋白与BCL2蛋白的表达情况。结果 MIIP基因过表达可以抑制神经胶质瘤细胞U87的增殖能力。上调MIIP基因,抑制U87细胞的克隆形成能力,并提高放疗敏感性。放疗前与放疗后,MIIP基因均抑制RAD51蛋白与BCL2蛋白的表达。结论过表达MIIP基因抑制U87细胞的增殖能力与克隆形成能力;MIIP基因可提高U87细胞放疗敏感性,其机制与RAD51、BCL2信号转导通路相关。     

人结肠癌HCT116细胞系肿瘤干细胞特性研究

目的 探讨结肠癌HCT116细胞系的肿瘤干细胞相关特性,为结肠癌干细胞功能研究奠定基础.方法取HCT116细胞在无血清条件下培养,观察细胞在无血清培养基中的增殖分化情况,采用限量稀释法计数细胞的克隆球形成率,并观察细胞及克隆球的生长、增殖、分化情况.取HCT116细胞(5×10~3、5×10~4个)接种4周龄雌性NOD-SCID小鼠,观察3～8周,分析其致瘤性和病理学特征.采用流式细胞仪和免疫荧光染色法分别检测HCT116细胞CD133、CD44、ABCG2的表达,RT-PCR和Western blotting 检测CD133的mRNA和蛋白表达.采用免疫组化法检测分化过程中HCY116克隆球上CK20的表达.结果 41.47%±1.28%的HCT116细胞能在无血清培养基中形成克隆球,第二代克隆球形成率仍保持在较高水平(32.53%±2.32%).HCT116细胞在无血清条件下培养72h可形成克隆球,且至少可传15代以上.5×10~3个HCT116细胞接种至小鼠皮下5～6周后即可形成移植瘤.大部分HCT116细胞为CD133~+ CD44~+,并表达ABCG32蛋白.HCT116细胞的克隆球分化至第4天即可检测到CK20表达.结论 大部分HCT116细胞具有肿瘤干细胞特性,可作为肿瘤干细胞研究的理想对象.     

S100A4 siRNA对人胰腺癌BxPc-3细胞增殖、迁移及侵袭的影响

目的观察利用小干扰RNA（small interference RNA,siRNA）技术下调人胰腺癌BxPc-3细胞中钙结合蛋白S100A4表达后对细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法设计合成针对S100A4的特异性siRNA,转染至人胰腺癌BxPc-3细胞,以Western印迹检测转染前后S100A4蛋白表达变化;克隆形成率实验检测转染前后BxPc-3细胞增殖能力;Transwell小室模型检测转染前后BxPc-3细胞迁移和侵袭能力变化。结果 Western印迹结果显示BxPc-3细胞转染S100A4siRNA48h后,S100A4蛋白表达明显下调;Transwell小室验证转染S100A4siRNA后细胞的迁移和侵袭能力明显降低。结论本研究结果表明,S100A4表达下调后可抑制胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭,提示S100A4可以作为一个潜在的肿瘤治疗靶标。     

安罗替尼对人肾癌细胞ACHN增殖和迁移的抑制作用

目的 观察安罗替尼(anlotinib)对人肾癌细胞增殖和迁移能力的影响,探讨其抑制肾癌细胞生长、迁移能力的机制,以及在肾癌治疗领域的临床应用前景.方法 体外培养肾癌ACHN细胞,采用不同浓度(0、1.25、2.5、5和10 μmol/L)的安罗替尼处理ACHN细胞24、48和72h,MTT法检测安罗替尼对ACHN细胞增殖的影响,计算半数抑制浓度(IC50);划痕修复实验检测安罗替尼对ACHN细胞迁移能力的作用,计算迁移率;克隆形成实验检测细胞贴壁后细胞的成活能力,计算克隆数目;Western印迹法检测安罗替尼对PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达和活性的影响,用灰度分析方法计算其灰度值.结果 安罗替尼能显著抑制ACHN细胞增殖,具有明显的浓度依赖性;与对照组相比,安罗替尼处理后,能明显抑制ACHN细胞的克隆形成、迁移和信号通路相关蛋白的活化(P＜0.05).结论 安罗替尼能显著抑制人肾癌ACHN细胞的增殖、克隆形成和迁移能力,其机制与PI3K信号通路的抑制相关.     

HBXIP蛋白表达对宫颈癌细胞的增殖能力及放射敏感性的影响

目的探讨用siRNA敲降乙肝病毒X蛋白结合蛋白（HBXIP）的表达对宫颈癌ME-180细胞的增殖能力及放射敏感性的影响。方法根据不同的处理方法,分别按两种分组方式进行分组。（1）把宫颈癌ME-180细胞分为4组:空白对照组、4 Gy γ射线照射组、HBXIP-siRNA转染组以及HBXIP-siRNA+γ射线照射联合组。采用MTT和克隆形成实验法来检测细胞增殖;采用qRTPCR检测凋亡相关蛋白Bcl-2及Bid的表达;Western blot检测蛋白激酶AKT的磷酸化水平。（2）把宫颈癌ME-180细胞分为3组:空白对照组、HBXIP-siRNA单独处理组、HBXIP-siRNA和AKT共转染组。对3组细胞进行不同剂量的γ射线照射,并采用克隆形成实验方法检测细胞生长。采用Student t-test对数据进行统计学分析,P < 0.05表示差异有统计学意义。结果 MTT实验和克隆形成实验结果显示,与γ射线照射组相比,HBXIP-siRNA转染+γ射线照射联合组的宫颈癌ME-180细胞增殖率明显降低（t=11.63、12.17,均P < 0.01）,并伴随抑凋亡蛋白Bcl-2表达的降低（t=10.88,P < 0.01）和促凋亡蛋白Bid表达的增高（t=9.31,P < 0.01）。γ射线照射明显上调了HBXIP蛋白的表达水平和AKT蛋白的磷酸化水平,而转染HBXIP-siRNA则抑制了γ射线照射导致的AKT磷酸化水平的升高。另外,与HBXIP-siRNA单独处理组相比,HBXIP-siRNA和AKT共转染组中HBXIP-siRNA对宫颈癌ME-180细胞增殖的影响显著降低（t=8.96,P < 0.01）。结论降低HBXIP蛋白表达可以抑制辐照诱导的AKT磷酸化水平,进而降低宫颈癌ME-180细胞的增殖能力,同时增强其放射敏感性。     

Ascl2表达抑制对结肠癌细胞上皮-间质转化的影响

目的 探讨肿瘤干性因子Ascl2对结肠癌细胞上皮-间质转化(EMT)的影响.方法 将Ascl2的shRNA干扰质粒转染至结肠癌HT-29和LS174T细胞,采用G418筛选建立稳定转染的细胞系,MTT及平板克隆形成实验观察Ascl2干扰对细胞增殖和克隆形成能力的影响,Real-time PCR和Western blotting检测Ascl2干扰对EMT相关蛋白E-钙黏蛋白和波形蛋白表达的影响.结果 MTT检测发现,转染Ascl2干扰质粒后72h和96h,HT-29和LS174T细胞的增殖速率明显降低(P＜0.05);平板克隆形成实验结果显示,干扰后的HT-29和LS174T细胞克隆形成数明显少于未转染及转染对照质粒的HT-29和LS174T细胞(P＜0.05).Real-time PCR和Western blotting检测发现,干扰后的HT-29和LS174T细胞E-钙黏蛋白mRNA和蛋白表达水平上调(P＜0.05),波形蛋白的mRNA和蛋白表达水平下调(p＜0.05).结论 Ascl2 RNA干扰可导致结肠癌HT-29和LS174T细胞增殖能力下降及EMT逆转.     

褪黑素对人结肠癌细胞辐射敏感性的影响

目的 分析褪黑素联合γ射线照射对体外和体内人结肠癌HCT 116细胞生长的影响,探讨褪黑素在人结肠癌HCT 116细胞辐射敏感性中的作用。 方法 将人结肠癌HCT 116细胞分为4组,即:空白对照组（不给予任何处理）、褪黑素组（给予褪黑素,给药浓度为1 mmol/L,给药时间为2 h）、照射组（接受6 Gy γ射线照射）及褪黑素+照射组（在照射前2 h给予褪黑素,给药浓度为1 mmol/L,然后接受6 Gy γ射线照射）。体外实验:人结肠癌HCT 116细胞分别进行2、4、6、8 Gy照射,采用克隆形成实验检测细胞的增殖能力;人结肠癌HCT 116细胞进行6 Gy照射,采用流式细胞术检测24 h后细胞周期以及24 h和48 h后细胞的凋亡;采用彗星实验检测2 h后细胞DNA的损伤。体内实验:将人结肠癌HCT 116细胞接种于裸鼠体内建立肿瘤模型,检测结肠癌瘤体体积和瘤体质量的变化并计算抑瘤率。两组间比较采用t检验。 结果 ①体外实验:照射前给予褪黑素处理的人结肠癌HCT 116 细胞的克隆形成数目明显少于对照组,差异有统计学意义（t=3.83,P=0.005）;褪黑素+照射组停留在G₂期的人结肠癌HCT 116细胞比例显著增加（53.04%±4.67%）,与照射组（42.83%±7.10%）和褪黑素组（12.95%±0.96%）相比,差异均有统计学意义（t=2.94、20.66,P=0.017、P<0.01）;褪黑素+照射组在处理后24 h和 48 h大量人结肠癌HCT 116细胞发生细胞凋亡,凋亡率分别达到（12.15±0.41）%和（30.57±1.91）%,与照射组（9.00%±0.70%、8.69%±0.71%）和褪黑素组（3.03%±0.42%、12.56%±0.89%）相比,差异均有统计学意义（t=7.46、17.75、29.12、14.80,均P<0.01）;褪黑素+照射组HCT 116细胞的尾部DNA含量、尾长、尾矩和Olive尾矩均明显高于照射组（t=4.72、4.16、4.74、4.50,均P<0.01）和褪黑素组（t=20.27、22.80、13.81、18.85,均P<0.01）,差异均有统计学意义。②体内实验:褪黑素+照射组结肠癌生长速度减慢,到处理后的第15天肿瘤体积明显小于照射组和褪黑素组,差异有统计学意义（t=3.51、2.72, P=0.006、P=0.021）;褪黑素+照射组抑瘤率最高（54.7%±8.0%）,远远高于照射组和褪黑素组（t=7.50、4.12,均P<0.01）。 结论 褪黑素联合辐射对人结肠癌细胞生长有显著的抑制效应,提高了细胞对γ射线辐射的敏感性。     

Ionizing radiation induces EphA2 S897 phosphorylation in a MEK/ERK/RSK-dependent manner

Purpose: The EphA2 tyrosine kinase is frequently overexpressed in human tumors that are also treated with radiation. However, few studies have examined the effect of radiation on the EphA2 receptor itself. The purpose of this project was to investigate the impact of radiation on EphA2 to better understand mechanisms of radioresistance.

Materials and methods: Cell lines were exposed to X-rays and assayed for changes in EphA2 protein levels and phosphorylation over time by Western blotting. HEK293 cells stably expressing wild-type EphA2 or the S897A mutant were analyzed for cell survival from X-rays.

Results: Treatment of different cancer cell lines with 2?Gy of X-rays induced the phosphorylation of EphA2 on S897 but no changes were found in EphA2 total levels or its tyrosine phosphorylation. Radiation-induced S897 phosphorylation was unaffected by an AKT inhibitor but blocked by a MEK or RSK inhibitor. HEK293 cells expressing the EphA2 S897A mutant had a nearly 2-fold lower level of cell survival from X-rays than cells expressing wild-type EphA2.

Conclusions: These findings show that radiation induces S897 EphA2 phosphorylation, an event associated with increased cell survival. Therefore, targeting pathways that mediate EphA2 S897 phosphorylation may be a beneficial strategy to reduce radioresistance.     

凝血酶体外促进肺癌细胞Glc-82周期进程和增殖及其分子机制

目的探讨凝血酶体外促进肺癌细胞Glc-82周期进程和增殖及其作用机制。方法采用CCK8法检测凝血酶(thrombin)对Glc-82细胞增殖活性的影响,确定其量效和时效关系;利用碘化丙锭(propidium iodide,PI)单染和AnnexinⅤ-FITC/PI双染在流式细胞仪上检测细胞周期和凋亡;以荧光实时定量PCR检测10号染色体上与张力蛋白同源缺失的磷酸酶基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromatosome 10,PTEN)mRNA水平的变化,免疫印迹法检测PTEN蛋白表达和AKT磷酸化水平的变化。结果凝血酶(0.5和1.0 U/ml)可以有效促进细胞的增殖(P<0.01)。凝血酶(0.5 U/ml)促进Glc-82细胞由G1期向S期转化,可以抑制PTEN的表达,提高AKT磷酸化水平,但对细胞凋亡没有影响。结论凝血酶(0.5 U/ml)可以促进肺癌细胞Glc-82周期进程和细胞增殖,可能系通过PTEN/PI3K/AKT信号分子途径发挥作用。     

抑制FOXD1基因表达增强结直肠癌细胞HCT116的放射敏感性

目的 研究抑制FOXD1基因的表达对结直肠癌细胞放射敏感性的影响。方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和Western blot检测人结直肠癌组织和细胞中FOXD1 mRNA和蛋白的表达。对结直肠癌HCT116细胞行梯度剂量（0、2、4、6 Gy）X射线照射,qRT-PCR和Western blot检测各组细胞中FOXD1的表达。将siRNA阴性对照和FOXD1 siRNA转染至结直肠癌细胞中,分别记为si-NC组和si-FOXD1组,经4 Gy的X射线照射处理后记为si-NC+4 Gy组和si-FOXD1+4 Gy组,Western blot检测各组细胞中FOXD1的表达,四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测各组细胞的增殖活性,克隆形成实验检测各组细胞存活率,采用TECT DNA-PK试剂盒检测各组细胞中DNA-PK活性,将转染的结直肠癌细胞接种于BALB/c裸鼠建立移植瘤模型,进行射线照射后,检测各组肿瘤的体积和质量变化。结果 与癌旁正常组织相比,结直肠癌组织中FOXD1 mRNA和蛋白的表达均显著增加（t=5.579、4.816,P<0.05）,与结肠黏膜上皮细胞NCM460相比,结直肠癌细胞株中FOXD1 mRNA（t=5.85~17.62,P<0.05）和蛋白（t=9.04~11.42,P<0.05）表达均显著升高。结直肠癌细胞HCT116中FOXD1的表达量随着放射剂量增加而升高,呈现剂量依赖性,差异有统计学意义（t=9.13~44.15,P<0.05）。转染si-FOXD1能够有效地抑制结直肠癌细胞中FOXD1的表达（t=10.51,P<0.05）,FOXD1敲低后能够抑制结直肠癌细胞的增殖活性（t=10.41,P<0.05）,提高结直肠癌细胞的放射敏感性,放射增敏比为1.797,降低放射诱导的DNA-PK的活性（t=6.20,P<0.05）。抑制FOXD1的表达经射线照射后,裸鼠种植瘤体积和重量明显减小（t=11.29、3.69,P<0.05）。结论 抑制FOXD1基因的表达能够提高结直肠癌细胞的放射敏感性,抑制结直肠癌裸鼠移植瘤的生长,可为改善放射治疗对结直肠癌患者的治疗效果提供潜在的靶向基因。     

凝血酶体外促进肺癌细胞Glc-82周期进程和增殖及其分子机制

目的探讨凝血酶体外促进肺癌细胞Glc-82周期进程和增殖及其作用机制。方法采用CCK8法检测凝血酶（thrombin）对Glc-82细胞增殖活性的影响,确定其量效和时效关系;利用碘化丙锭（propidium iodide,PI）单染和AnnexinⅤ-FITC/PI双染在流式细胞仪上检测细胞周期和凋亡;以荧光实时定量PCR检测10号染色体上与张力蛋白同源缺失的磷酸酶基因（phosphatase and tensin homologue deleted on chromatosome 10,PTEN）mRNA水平的变化,免疫印迹法检测PTEN蛋白表达和AKT磷酸化水平的变化。结果凝血酶（0.5和1.0 U/ml）可以有效促进细胞的增殖（P〈0.01）。凝血酶（0.5 U/ml）促进Glc-82细胞由G1期向S期转化,可以抑制PTEN的表达,提高AKT磷酸化水平,但对细胞凋亡没有影响。结论凝血酶（0.5 U/ml）可以促进肺癌细胞Glc-82周期进程和细胞增殖,可能系通过PTEN/PI3K/AKT信号分子途径发挥作用。     

The role of serotonin and p53 status in the radiation-induced bystander effect

Abstract

Purpose: The aim of this study was to investigate the role of serotonin and protein 53 (p53) status of the cells in the radiation-induced bystander effects (RIBE).

Materials and methods: The radiation-induced bystander response was investigated in human MCF-7 breast cancer cells and human HCT116 colorectal cancer cells employing medium-transfer experiments and micronuclei (MN) induction as an end-point. Irradiated cell conditioned medium (ICCM) from cells exposed to α-particle or γ-radiation was filtered and transferred to unirradiated cells 2 h following irradiation. MCF-7 cells were irradiated with 0.5 Gy α-particles, while HCT116 p53^+/+ and HCT116 p53^?/? cells were irradiated with 0.5 Gy γ-radiation.

Results: Bystander MCF-7 cells, recipient of ICCM from 0.5 Gy α-particle irradiated MCF-7 cells grown in high serotonin conditions showed a modest but significant increase in MN, while MCF-7 cells receiving ICCM with low serotonin levels did not show any bystander effect. Added serotonin (100 ng/ml) led to a bystander effectin HCT116 p53^?/? cells recipient of ICCM from 0.5 Gy γ-irradiated HCT116 p53^+/+ cells, but had no effect when the ICCM was from γ-irradiated HCT116 P53^?/? cells.

Conclusion: The results indicate that serotonin levels in the medium play a role in the RIBE and that there may be an interaction between the role of serotonin and the p53 status of the irradiated cells.     

外源性p27KIP1基因抑制SGC7901细胞的增殖

研究p27^KIP1基因对胃癌细胞的细胞周期及细胞增殖的影响。采用脂质体转染法将p27^KIP1全长cDNA转入胃癌细胞系SGC7901中，通过免疫屯迹分析以及RNA斑点杂交方法检测p27^KIP1基因在蛋白质和mRNA水平的表达，细胞活力实验及软琼脂集落形成实验显示转染p27^KIP1基因对细胞增殖的作用；流式细胞仪观察目的的基因对该细胞的细胞周期的影响。结果显示，转染p27^KIP1的SGC7901细胞在mRNA和蛋白质水平均有高水平p27^KIP1的表达；细胞活力检测显示在外加Zn离子48h后细胞生长被抑制42％；转染p27^KIP1的SGC7901细胞的集落形成率较对照组明显减少（P＜0．01）；p27^KIP1的过表达能够显著地增加G1期的细胞数，由33．68％增加到69．29％（P＜0．01）。研究表明，p27^KIP1基因可抑制SGC7901细胞由G1期向S期过渡，从而抑制细胞增殖。