1504-siRNA对EphA3表达肿瘤细胞HCT116的抑制作用研究

目的研究原癌基因EphA3的小干扰RNA(small interfering RNA)1504-siRNA对高表达结肠癌细胞HCT116的增殖抑制作用。方法将1504-siRNA质粒用Vigofect转染试剂瞬时转染HCT116细胞,36～48 h后,收集蛋白,用Western印迹检测EphA3及AKT信号通路中的蛋白分子表达,收集细胞,进行噻唑蓝(MTT)实验、平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。结果 1504-siRNA能抑制HCT116细胞的EphA3蛋白水平,抑制其增殖、平板克隆和软琼脂克隆的形成,抑制pmTOR、p-c-Raf、pAKT、p-4ebp1等信号分子的表达。结论 1504-siRNA抑制HCT116细胞的增殖、存活能力和恶性程度,这可能是通过抑制AKT信号通路来实现,它有望作为肿瘤治疗的候选药物。     

DNA依赖蛋白激酶催化亚基抑制剂NU7026对结肠癌HCT116癌干细胞的放射增敏作用

目的 以结肠癌细胞HCT116为研究对象,评价DNA依赖蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs)抑制剂NU7026对癌干细胞的放射增敏作用及其机制。方法 以CD133+/CD44+为标志物,流式细胞术检测癌干细胞亚群。将HCT116细胞分为对照组、单纯药物(20 μmol/L NU7026)组、单纯照射(2 Gy γ射线)组和药物+照射(20 μmol/L NU7026联合2 Gy γ射线)组,照射前2 h加入NU7026。细胞集落形成实验检测HCT116细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期和凋亡, γ-H2AX foci的免疫荧光激光共聚焦分析DNA双链断裂损伤修复。结果 体外培养HCT116细胞中CD133+/CD44+癌干细胞亚群比例高达(88.14±0.47)%,HCT116细胞低密度接种无血清培养基中集落形成率为(84.75±1.35)%。与单纯照射组比较,药物+照射组细胞存活率显著降低(t=7.22,P<0.01)。受照后48 h,药物+照射组的癌干细胞亚群比例较单纯照射组显著降低(t=9.55,P<0.01)。受照后24 h,NU7026明显增加G₂/M期阻滞(t=7.67,P<0.01),48 h细胞早期凋亡发生率也明显增加(t=8.24,P<0.05)。药物+照射组在照后2、4、8和24 h DNA双链断裂(γ-H2AX foci)残留比单纯照射组明显增多(t=19.58、11.95、7.01和9.45,P<0.01)。结论 NU7026对癌干细胞为优势亚群的结肠癌HCT116细胞具有明显的放射增敏作用,显著增加对癌干细胞的杀伤效应,增敏机制包括抑制DNA修复,诱发不可逆G₂/M期阻滞和增加细胞凋亡。     

S100A4 siRNA对人胰腺癌BxPc-3细胞增殖、迁移及侵袭的影响

目的观察利用小干扰RNA（small interference RNA,siRNA）技术下调人胰腺癌BxPc-3细胞中钙结合蛋白S100A4表达后对细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法设计合成针对S100A4的特异性siRNA,转染至人胰腺癌BxPc-3细胞,以Western印迹检测转染前后S100A4蛋白表达变化;克隆形成率实验检测转染前后BxPc-3细胞增殖能力;Transwell小室模型检测转染前后BxPc-3细胞迁移和侵袭能力变化。结果 Western印迹结果显示BxPc-3细胞转染S100A4siRNA48h后,S100A4蛋白表达明显下调;Transwell小室验证转染S100A4siRNA后细胞的迁移和侵袭能力明显降低。结论本研究结果表明,S100A4表达下调后可抑制胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭,提示S100A4可以作为一个潜在的肿瘤治疗靶标。     

利用RNA干扰技术研究14-3-3ζ对肺癌细胞转移的抑制作用

目的:探讨14-3-3ζ对肺癌细胞转移的抑制作用.方法:以人肺巨细胞癌低转移细胞株为模型,利用RNAi技术研究14-3-3ζ被干涉后肿瘤细胞恶性表型的变化,探讨14-3-3ζ与肿瘤转移的相关性.结果:本研究发现14-3-3ζ被干涉后细胞的集落形成能力明显提高,黏附能力明显降低,细胞迁移、侵袭能力明显提高.结论:14-3-3ζ可能抑制肺癌细胞的转移.     

LINE-1 ORF-1p对肝脏肿瘤细胞系和肝源永生化细胞系增殖的调控作用

目的 研究反转座子LINE-1编码蛋白LINE-1 ORF-1p对肝脏肿瘤细胞系以及肝源永生化细胞系增殖能力的影响.方法 构建针对LINE-1 ORF-1编码序列的siRNA表达载体(LINE-1 ORF-1p psilence2.1-U6-siRNA),转染肝脏肿瘤细胞系Bel-7402、SMMC-7721、HepG2和肝源水生化细胞系LO2.采用Western blotting检测LINE-1 ORF-1p siRNA表达载体对LINE-1 ORF-1编码蛋白LINE-1 ORF-1p表达的影响,采用MTT法检测LINE-1 ORF-1p表达受抑对细胞增殖的影响.结果 在肝脏肿瘤细胞HepG2、Bel-7402、SMMC-7721和肝源永生化细胞LO2中,转染LINE-1 ORF-1p siRNA表达载体均能降低LINE-1 ORF-1p的表达水平,并从第3天起显著抑制前述细胞的增殖(P＜0.05),其抑制率分别为63％、51％、40％、43％.结论 抑制LINE-1 ORF-1p蛋白表达后可使肝脏肿瘤细胞系和永生化细胞系的增殖受抑.     

siRNA表达载体对MCF-7细胞生长及其hTERT基因表达抑制的研究

目的构建人端粒酶反转录酶(hTERT)基因的RNA干扰(RNAi)表达载体,探讨该载体对人乳腺癌MCF-7细胞生长及hTERT基因表达的影响。方法设计针对hTERT基因的干扰靶序列,构建siRNA重组表达质粒pGenesil-hTERT,将该质粒酶切测序鉴定后,以脂质体转染MCF-7细胞,RT-PCR和Western blot技术分别检测hTERT基因及其蛋白的表达,MTT法观察转染后MCF-7细胞生长情况。结果酶切电泳和测序分析表明插入序列正确,重组质粒构建成功。该质粒转染MCF-7细胞后,hTERT基因mRNA和蛋白质的表达水平均显著降低,MCF-7细胞生长抑制。结论内源性短发夹状siRNA能有效抑制hTERT基因的表达,进而抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖生长,这也为肿瘤的基因治疗提供了实验依据。     

RNA干扰对HT29细胞PIDD蛋白表达及细胞耐药性影响的研究

目的观察氟尿嘧啶（5-FU）刺激后PIDD蛋白在结肠癌HT29细胞中分布的改变,以及小干扰RNA（siRNA）干扰PIDD蛋白前后,HT29细胞耐药性的变化。方法用siRNA干扰HT29细胞内PIDD蛋白的表达,用5-FU刺激HT-29细胞。West-ern blotting法检测干扰前后细胞PIDD的表达,并比较5-FU刺激后干扰与未干扰HT-29细胞内PIDD在细胞中分布的变化。MTT比色法检测siRNA干扰前后细胞对5-FU的敏感性,并计算各组细胞的IC50值。结果未受5-FU刺激前,PIDD蛋白主要分布于细胞质中;受5-FU刺激后,PIDD蛋白迁移至细胞核。siRNA干扰后细胞中PIDD表达总量有所下降,胞质及胞核中的表达均降低,受5-FU刺激后PIDD的表达也未见升高,迁移至胞核的PIDD也未增加。MTT检测证明5-FU对转染组（PIDD-360转染12h后的HT29细胞）的IC50值为0.23&#177;0.06μg/ml,与正常组（未作处理的HT29细胞,IC50为2.71&#177;0.70μg/ml）和对照组（阴性对照试剂转染12h后的HT29细胞,IC50为2.78&#177;1.03μg/ml）比较显著降低（P〈0.05）。结论经siRNA干扰PIDD蛋白后,HT29细胞的耐药性明显下降,推测其机制与胞核中PIDD降低导致的NF-κB活性降低,细胞凋亡增多有关。     

αv整合素沉默对结肠癌多细胞球药物敏感性的影响

目的 应用反转录病毒介导的shRNA沉默αv整合素,探讨后者在结肠癌多细胞球(MCSs)对奥沙利铂耐药中的作用.方法 构建针对αv整合素的反转录病毒质粒,脂质体转染质粒至结肠癌细胞株HT29.采用改良liquid overlay技术培养MCSs;Western blotting检测MCSs中αv整合素蛋白的表达;Cell Counting Kit-8检测梯度浓度(0、5、50、500、5 000μg/L)的奥沙利铂处理后MCSs的存活率.结果测序证实质粒构建成功.Western blotting结果 显示反转录病毒质粒介导的shRNA能有效、特异、稳定地沉默αv整合素基因.沉默αv整合素基因后,MCSs对奥沙利铂的药物敏感性显著增加.奥沙利铂50、500μg/L处理48h后,MCSs的存活率为0.86%±0.05%和0.43%±0.04%,转染反转录病毒的MCSs则下降为0.77%±0.06%和0.30%±0.04%(P<0.05).结论 反转录病毒介导的shRNA能有效沉默αv整合素基因.沉默αv整合素能有效提高结肠癌MCSs对化疗药物奥沙利铂的敏感性.     

RNA干扰阻滞胸腺素β4表达对TGF-β1诱导人肾小管上皮-肌成纤维细胞转分化的抑制作用

目的 探讨RNA干扰阻滞胸腺素β1表达对TGF-β1诱导人肾小管上皮-肌成纤维细胞转分化(EMT)的抑制作用.方法 构建能表达针对胸腺素β1的小干扰RNA(siRNA)的重组腺病毒载体,以及表达不针对任何已知mRNA的siRNA的阴性对照载体,分别感染人肾小管上皮细胞株(HKC),得到胸腺素β1表达受抑制的HKC-siTβ4和胸腺素β4表达未受影响的HKC-siC.根据用TGF-β1处理HKC、HKC-siTβ4和HKC-siC的情况,将培养的细胞分为4组:正常HKC组(C组),TGF-β1处理HKC组(T C组),TGF-β1处理HKC-siTβ1组(T siTβ1组)和TGF-β1处理HKC-sic组(T siC组).48h后,分别采用RT-PCR和Western blotting检测各组胸腺素β1、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和E-钙黏素表达,并分析胸腺素β1和α-SMA表达量的相关性.结果 C组胸腺素β4表达弱阳性,α-SMA表达阴性,E-钙黏素表达强阳性;T C组胸腺素β1和α-SMA表达强阳性,E_钙黏素表达较C组减弱(P＜0.01);T siTβ1组胸腺素β1和α-SMA表达弱阳性,表达量显著低于T C组(P＜0.01),E-钙黏素显著高于T C组(P＜0.01);T siC组胸腺素β1、α-SMA和E-钙黏素表达与T C组相比均无显著差异(P＞0.05).胸腺素β4和α-SMA表达呈显著正相关.结论 RNAi阻滞胸腺素β4表达能有效地抑制TGF-β1诱导EMT,提示胸腺素β4是介导TGF-β1诱导EMT的重要分子.     

miRNA-33a抑制人结肠癌细胞HCT-116增殖的机制研究

目的 探讨miRNA-33a抑制人结肠癌细胞HCT-116增殖的机制.方法 化学法合成miRNA-33a mimics、miRNA-33a inhibitor及阴性对照(NC)序列,然后转染至HCT-116细胞.转染后48h,采用Real-time PCR检测细胞中miRNA-33a含量的变化,Western blotting检测细胞中Twist蛋白含量的变化;转染后24、48、72h,采用CCK-8的检测肿瘤细胞增殖活性的变化.采用信息学软件预测miRNA-33a与Twist的结合位点,并通过荧光素酶报告基因法证实预测的结合位点.结果 miRNA-33a mimics及miRNA-33a inhibitor转染后可明显上调或下调HCT-116细胞内miRNA-33a的相对含量(P＜0.05),而NC转染组细胞miRNA-33a含量与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05);miRNA-33a mimics及miRNA-33a inhibitor转染后可明显下调或上调HCT-116细胞内Twist蛋白的表达,与对照组比较差异有统计学意义(p＜0.05),而NC转染组细胞内Twist含量与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05);miRNA-33a mimics及miRNA-33ainhibitor转染后可明显下调或上调HCT-116细胞对数生长期的增殖活性,转染后48h和72h与对照组比较差异均有统计学意义(p＜0.05),而NC转染组细胞增殖活性与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).荧光素酶实验显示,miRNA-33amimics和miRNA-33a inhibitor转染可以抑制或促进野生型报告基因荧光素酶活性(P＜0.05),而对突变型报告基因荧光素酶活性无明显影响(P＞0.05).结论 miRNA-33a可以通过抑制其靶基因Twist的表达抑制HCT-116细胞的增殖活性.     

HBXIP蛋白表达对宫颈癌细胞的增殖能力及放射敏感性的影响

目的探讨用siRNA敲降乙肝病毒X蛋白结合蛋白（HBXIP）的表达对宫颈癌ME-180细胞的增殖能力及放射敏感性的影响。方法根据不同的处理方法,分别按两种分组方式进行分组。（1）把宫颈癌ME-180细胞分为4组:空白对照组、4 Gy γ射线照射组、HBXIP-siRNA转染组以及HBXIP-siRNA+γ射线照射联合组。采用MTT和克隆形成实验法来检测细胞增殖;采用qRTPCR检测凋亡相关蛋白Bcl-2及Bid的表达;Western blot检测蛋白激酶AKT的磷酸化水平。（2）把宫颈癌ME-180细胞分为3组:空白对照组、HBXIP-siRNA单独处理组、HBXIP-siRNA和AKT共转染组。对3组细胞进行不同剂量的γ射线照射,并采用克隆形成实验方法检测细胞生长。采用Student t-test对数据进行统计学分析,P < 0.05表示差异有统计学意义。结果 MTT实验和克隆形成实验结果显示,与γ射线照射组相比,HBXIP-siRNA转染+γ射线照射联合组的宫颈癌ME-180细胞增殖率明显降低（t=11.63、12.17,均P < 0.01）,并伴随抑凋亡蛋白Bcl-2表达的降低（t=10.88,P < 0.01）和促凋亡蛋白Bid表达的增高（t=9.31,P < 0.01）。γ射线照射明显上调了HBXIP蛋白的表达水平和AKT蛋白的磷酸化水平,而转染HBXIP-siRNA则抑制了γ射线照射导致的AKT磷酸化水平的升高。另外,与HBXIP-siRNA单独处理组相比,HBXIP-siRNA和AKT共转染组中HBXIP-siRNA对宫颈癌ME-180细胞增殖的影响显著降低（t=8.96,P < 0.01）。结论降低HBXIP蛋白表达可以抑制辐照诱导的AKT磷酸化水平,进而降低宫颈癌ME-180细胞的增殖能力,同时增强其放射敏感性。     

慢病毒载体介导E6AP基因敲低乳腺癌细胞株的构建及其功能检测

目的：构建E6AP基因的小干扰RNA（siRNA）真核表达载体,并检测其对乳腺癌细胞ZR75-1生长的影响。方法利用RNA干扰（RNAi）技术设计并合成两条E6AP基因的siRNA,并将其与siRNA表达载体pSIH-H1连接。经过酶切和测序鉴定成功后,人胚肾细胞293T包装E6AP siRNA的慢病毒,然后感染乳腺癌细胞ZR75-1,建立敲低E6AP表达的稳定细胞株。稳定细胞株建立后通过实时定量PCR（ qRT-PCR）和Western 印迹等方法检测RNAi的干扰效果,并利用细胞生长实验检测E6AP siRNA对乳腺癌细胞生长的影响。结果 DNA测序证明,成功构建了E6AP siRNA的表达载体。实时定量PCR和Western 印迹实验证明,构建的siRNA确能有效抑制E6AP基因的表达,并建立了敲低E6AP表达的稳定细胞株。生长实验表明,E6AP siRNA可有效抑制细胞的生长。结论成功构建E6AP基因的siRNA真核表达载体,转染细胞后能有效地抑制E6AP基因的表达,且抑制细胞ZR75-1的生长。     

HIP1基因沉默对人前列腺癌PC-3细胞增殖的影响

目的研究HIP1基因沉默对人前列腺癌PC-3细胞增殖的影响。方法构建靶向HIP1的shRNA表达载体pSilence-shHIP1,应用脂质体转染到PC-3细胞,RT-PCR检测HIP1基因沉默效果,Western blotting确认有效作用靶点。通过细胞划痕实验和细胞生长曲线研究HIP1基因对PC-3细胞增殖的影响。结果转染PC-3细胞后,沉默HIP1基因效率达83%(P<0.01);Western blotting证实该基因片段为抑制HIP1的有效作用靶点。细胞划痕实验和生长曲线显示HIP1基因沉默可抑制PC-3细胞的增殖。结论 pSilence-shHIP1表达载体可特异性地抑制HIP1基因的表达,沉默HIP1基因可抑制PC-3细胞增殖和迁移。     

小干扰RNA抑制核因子-κB增强131I治疗甲状腺癌疗效的研究

目的 探讨小干扰RNA (siRNA)抑制核因子-κB (NF-κB)对131I致DTC细胞凋亡能否产生协同作用.方法 2×104 MBq/L 131I作用人甲状腺乳头状癌细胞株KTC-1 24 h后做DNA结合实验,48 h后做细胞存活分析.Western blot鉴定131I作用6h后细胞NF-κB p65的变化,24 h后凋亡抑制因子[X-染色体相关凋亡抑制蛋白(XIAP)、细胞凋亡抑制因子1(clAP1)、B细胞淋巴瘤因子大亚基(Bcl-xL)]、凋亡关键因子[半胱氨酸蛋白酶(caspase 3)和多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)]的变化.p65和凋亡抑制因子的Western blot检测分4组:未转染(A)组、未转染+131I(B)组、转染对照siRNA+ 131I(C)组和转染p65 siRNA+131I(D)组;其余实验分为6组:未转染(1)组、转染对照siRNA(2)组、转染p65 siRNA(3)组、未转染+131I(4)组、转染对照siRNA+131I(5)组和转染p65 siRNA+131I(6)组.多组间均数比较采用单因素方差分析,均数两两比较采用q检验.结果 1至6组DNA结合率分别为(100.00±11.65)％、(96.00±17.98)％、(9.28±5.01)％、(322.72±50.81)％、(311.36±44.81)％和(36.96±15.66)％,差异有统计学意义(F=137.74,P＜0.01);131I作用后KTC-1细胞NF-κB活性均增强(q4∶1组=10.90,q5∶2组=11.38,均P＜0.01);p65 siRNA可抑制NF-κB功能(q1∶3组=18.25,q4∶6组=13.71,均P＜0.01).6组细胞存活率分别为(100.00±11.65)％、(96.32±9.44)％、(70.88±7.41)％、(64.16±9.50)％、(62.24±9.37)％和(28.64±6.74)％ (F=52.76,P＜0.01);3、4和6组比,q=10.76和7.79,均P＜0.01.Western blot结果显示A、B、C和D组p65相对表达水平分别为(56.60 ±7.37)％、(111.07±13.31)％、(113.16±15.04)％和(12.46±2.74)％,差异有统计学意义(F=60.17,P＜0.01);131I作用后p65浓度增高(qB∶A组=6.20,qc∶A组=5.85,均P＜0.01);p65 siRNA可抑制其浓度增高(qB∶D组=12.57,qc∶D组=11.41,均P＜0.01).4组XIAP、cIAP1和Bcl-xL分别为(17.59±1.96)％、(16.45±1.85)％和(19.92±2.22)％,(98.37±17.92)％、(109.81±19.16)％和(95.59±22.20)％,(98.43±18.71)％、(98.86±15.88)％和(100.99±21.70)％,(7.00±0.95)％、(5.86±0.35)％和(9.52±0.90)％,差异均有统计学意义(F =44.22、56.51和29.11,均P＜0.01);131I作用后三者表达增加(qB∶A组 =7.76、8.40和5.88,均P＜0.01);p65 siRNA可抑制三者表达(qB∶D组=8.82、9.40和6.71,均P＜0.01).6组caspase 3亚基p19和p17、PARP活性蛋白p116和失活产物p89差异均有统计学意义(F=39.03、48.45、32.56和52.20,均P＜0.01);3、4和6组比q =3.18 ～9.98,均P＜0.05.结论 131I通过活化NF-κB导致甲状腺癌细胞内凋亡抑制因子表达升高,p65 siRNA可抑制这种变化;联合使用p65 siRNA对131I致DTC细胞凋亡产生协同效应.