益骨胶囊含药血清对大鼠成骨细胞IGF-ImRNA及其蛋白表达的影响

目的:观察益骨胶囊含药血清对SD大鼠成骨细胞(OB)增殖和胰岛素样生长因子I(IGF-I)mRNA及其蛋白表达的影响。方法:(1)将40只12月龄SD雌性大鼠分为益骨胶囊灌胃组(高、中、低剂量)和蒸馏水对照组,制备含药血清和对照血清,并确定最佳灌胃剂量和最佳血清添加浓度;(2)分离、培养新生大鼠成骨细胞,传代后分为两组(含药血清组和对照组),分别在培养48、72和96 h时做相关指标的测定,采用MTT法测定OB增殖,RT-PCR法检测IGF-ImRNA的相对表达量,ELISA法检测培养上清中IGF-I的浓度。结果:在48、72和96 h时,益骨胶囊含药血清组OB增殖明显高于对照组(P<0.01),OB表达IGF-I mRNA和蛋白的量明显高于对照组(P<0.01或P<0.05)。结论:益骨胶囊含药血清具有促进成骨细胞增殖、表达IGF-I mRNA和蛋白的作用,可能是该方防治骨质疏松的机理之一。     

益骨胶囊含药血清在共育体系中对大鼠成骨细胞增殖、ALP 活性及IL-11 mRNA表达的影响

目的：观察益骨胶囊含药血清在成骨-破骨细胞共育体系中对SD大鼠成骨细胞(OB)增殖、碱性磷酸酶（ALP）活性及白细胞介素-11(IL- 11)mRNA表达的影响。方法：(1)取1d龄SD大鼠颅骨分离培养OB，取5 d龄 SD大鼠四肢股骨、胫骨分离培养破骨细胞(OC)，建立细胞上清相通但细胞间不相互混杂的平 面式成骨- 破骨细胞共育体系，实验分为两组(含药血清组和对照组)。 (2) MTT法检测OB增殖，氨基安替吡啉测酚法测定ALP活性，FQ-PCR法测定IL-11 mRNA相对表达量。结果：含药血清组中OB的A值、ALP活性、IL-11/β-actin比值均高于对照组(P<0.05) 。结论：益骨胶囊含药血清在共育体系中可促进OB增殖、增强OB ALP活 性，提高IL-11 mRNA的表达。     

益骨胶囊含药血清对共育体系中成骨细胞表达骨保护素mRNA的影响

目的 观察益骨胶囊含药血清在成骨-破骨细胞共育体系中对SD大鼠成骨细胞表达骨保护素(OPG)mRNA的影响.方法 取1d龄SD大鼠颅骨分离培养成骨细胞(OB);取5d龄SD大鼠四肢长骨分离培养破骨细胞(OC).建立上清相通但细胞间不相互混杂的平面式成骨-破骨细胞共育体系,实验分为含药血清组和对照组.将10月龄SD雌性大鼠分为益骨胶囊灌胃组和生理盐水对照组,制备含药血清和对照血清.检测共育体系中成骨细胞OPG mRNA的表达.结果 含药血清组与对照组比较,OPGmRNA表达明显升高(8.2567±0.1118比3.3350±0.9854),差异有统计学意义(P＜0.01).结论 益骨胶囊含药血清在共育体系中通过刺激OB表达OPG来实现对OC的活性和凋亡的调节.     

中药骨康对成骨细胞IL-1、IL-6和TNF-α表达的影响

目的 通过观察骨康含药血清对成骨细胞IL-1、IL-6和TNF-α表达的影响，探讨其治疗骨质疏松的作用机制。方法 体外分离、培养成骨细胞，实验分为3组：正常血清组、中药骨康血清组和雌二醇含药血清组。采用酶联免疫吸附法，检测成骨细胞IL-1、IL-6和TNF-α表达。结果 中药骨康含药血清组IL-1、IL-6和TNF-α含量显著低于空白对照组（P〈0．05），中药骨康含药血清组与雌二醇含药血清组IL-1、IL-6和TNF-α的含量无明显差异。结论 在去势状态下，中药骨康可能是抑制IL-1、IL-6和TNF-α分泌，而达到治疗骨质疏松症的作用。     

益骨胶囊含药血清对共育体系中破骨细胞活性和凋亡的影响

目的： 观察益骨胶囊含药血清在成骨-破骨细胞共育体系中对SD大鼠破骨细胞（OC）活性和凋亡的影响。 方法： (1)取1d龄SD大鼠颅骨分离培养成骨细胞（OB），取5d龄SD大鼠四肢股骨、胫骨分离培养OC，建立细胞上清相通但细胞间不相互混杂的平面式成骨-破骨细胞共育体系，实验分为含药血清组和对照组；（2）将10月龄SD雌性大鼠分为益骨胶囊灌胃组和生理盐水对照组，制备含药血清和对照血清；（3）重氮盐法检测抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）和光镜观察骨陷窝数；（4）光镜和荧光显微镜下观察共育体系中OC凋亡情况。 结果： 含药血清组在48 h、72 h、96 h对成骨-破骨细胞共育体系中OC分泌TRACP的活性均明显降低于对照组，OC的存活数明显低于对照组，OC的凋亡率明显高于对照组且呈明显的时效关系；所形成骨吸收陷窝的数目明显低于对照组(P<0.01)。 结论： 益骨胶囊含药血清在共育体系中能够抑制OC活性，诱导破骨细胞的凋亡。     

金乌骨通胶囊含药血清对成骨细胞骨保护素/核因子κB受体活化因子配体分泌的影响

背景：金乌骨通胶囊对绝经后骨质疏松症具有明显的治疗作用,但其具体的作用机制尚不清楚。 目的：观察金乌骨通胶囊含药血清对成骨细胞骨保护素、细胞核因子κB受体活化因子配体(receptor activator nuclear factor kappa B ligand,RANKL)表达的影响。 方法：切除雌性SD大鼠双侧卵巢制备去卵巢血清,灌胃给予去卵巢大鼠金乌骨通胶囊制备去卵巢含药血清。取第3代生长状况良好的出生24 h内的SD大鼠成骨细胞,正常血清组、去卵巢血清组、去卵巢含药血清组分别加入正常雌性SD大鼠血清、去卵巢血清和去卵巢含药血清培养72 h。采用酶联免疫吸附法检测成骨细胞骨保护素和RANKL的分泌水平。 结果与结论：与正常血清组比较,去卵巢血清组成骨细胞骨保护素的表达明显降低(P < 0.01),而RANKL的表达明显升高(P < 0.05);与去卵巢血清组比较,去卵巢含药血清组成骨细胞骨保护素的表达明显升高(P  < 0.05),RANKL 的表达明显降低(P  < 0.05)。说明金乌骨通胶囊可通过增加成骨细胞骨保护素的表达,抑制RANKL的表达来实现治防治骨质疏松症的目的。     

金乌骨通胶囊对成骨细胞分泌白细胞介素1，6的影响

背景：课题组以往研究发现,金乌骨通胶囊对绝经后骨质疏松症具有明显的治疗作用,但其具体的机制尚不十分清楚。 目的：观察金乌骨通胶囊含药血清对成骨细胞分泌白细胞介素1,6的影响。 方法：切除雌性SD大鼠双侧卵巢制备去卵巢血清,灌胃给予去卵巢大鼠金乌骨通胶囊制备去卵巢含药血清。取第3代生长状况良好的出生24 h内SD大鼠的成骨细胞,分别加入正常雌性SD大鼠血清、去卵巢血清和去卵巢含药血清培养72 h。 结果与结论：酶联免疫吸附法检测显示,与正常血清组比较,去卵巢血清组成骨细胞白细胞介素1、白细胞介素6的表达明显升高(P < 0.01);与去卵巢血清组比较,去卵巢含药血清组白细胞介素1和白细胞介素6的表达明显降低(P < 0.05),与正常血清组比较,则无明显差异。提示金乌骨通胶囊可能通过抑制成骨细胞骨白细胞介素1和白细胞介素6的表达来实现治防治骨质疏松症的目的。     

熟地鳖甲与系膜细胞协同上调成骨细胞骨钙素基因及蛋白表达**☆◆

背景：熟地鳖甲含药血清可上调成骨细胞骨钙素基因表达,系膜细胞上清液亦可促进成骨细胞该基因的表达。 目的：验证熟地鳖甲含药血清与系膜细胞上清液对成骨细胞骨钙素基因及蛋白表达的影响是否有叠加作用。 方法：原代培养经鉴定的SD大鼠成骨细胞分为4组培养：①空白对照组含空白血清培养液。②含药血清组含熟地鳖甲含药血清培养液。③无药系膜组含空白血清培养液+空白系膜细胞上清。④含药系膜组含熟地鳖甲血清培养液+含药系膜细胞上清液。6 d后收集培养液,并与3 d所收集的培养液混匀进行检测。 结果与结论：与空白对照组比较,含药血清组、无药系膜组、含药系膜组骨钙素mRNA表达率明显上调(P < 0.05),含药系膜组骨钙素mRNA表达率明显高于含药血清组或无药系膜组。含药系膜组成骨细胞骨钙素浓度/MTT A值明显高于空白对照组(P < 0.05)。与含药血清组比较,含药系膜组成骨细胞骨钙素浓度/MTT A值明显升高(P < 0.05)。提示系膜细胞上清液及含药血清可上调成骨细胞骨钙素基因表达,二者共同作用进一步上调骨钙素基因的表达量,此时骨钙素分泌量亦明显增加。      

柴胡皂甙d对狼疮肾炎小鼠尿蛋白含量及肾组织IL-6、IL-10、 TNF-α、IFN-γ mRNA表达的影响

目的：观察柴胡皂甙d (SSd) 对新西兰黑色品系和白色品系杂交的子一代（NZBWF1）狼疮肾炎小鼠尿蛋白含量及肾组织IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ mRNA表达的影响。方法：将雌性NZBWF1小鼠分为3组：① SSd治疗1组（SSd剂量2 mg·kg^-1·d^-1)；② SSd治疗2组（SSd剂量4 mg·kg^-1·d^-1)；③对照组；共治疗6周。小鼠尿蛋白含量用考马斯亮蓝法检测，小鼠肾组织IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ mRNA表达用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测。结果：实验2周、4周以及6周末，与对照组相比，SSd治疗1组和SSd治疗2组尿蛋白含量明显降低(P<0.05)；与SSd治疗1组相比，SSd治疗2组尿蛋白含量显著降低(P<0.05)。实验6周末，SSd治疗1组和SSd治疗2组肾组织IL-6和IL-10 mRNA表达水平明显低于对照组(P<0.05)；SSd治疗2组IL-6和IL-10 mRNA表达水平显著低于SSd治疗1组(P<0.05)。SSd治疗1组、SSd治疗2组和对照组相比，肾组织TNF-α、IFN-γ mRNA表达水平之间的差异无统计学意义(P>0.05)。结论：SSd可以降低NZBWF1狼疮肾炎小鼠尿蛋白含量并抑制肾组织IL-6、IL-10 mRNA的表达，而对肾组织TNF-α、IFN-γ mRNA的表达无影响。     

益骨胶囊含药血清对大鼠破骨细胞凋亡和分泌抗酒石酸酸性磷酸酶的影响

目的:观察益骨胶囊含药血清对体外培养的大鼠破骨细胞(OC)分泌抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)和凋亡的影响。方法:(1)将20只12月龄SD大鼠随机分为益骨胶囊灌胃组和生理盐水灌胃组, 制备含药血清和对照血清;(2)分离培养新生SD大鼠OC, 加血清培养后, 重氮盐法检测TRAP, 倒置显微镜下观察OC存活数及荧光染色法观察OC凋亡情况。结果:与空白血清组比较, 含药血清组在24h、48h和72h时TRAP的活性均明显降低, OC存活数明显降低, 凋亡比率明显高(P<0.01或P<0.05)。结论:益骨胶囊含药血清可以抑制体外培养OC分泌TRAP, 诱导OC凋亡, 提示这可能是该方防治骨质疏松的机理之一。     

IL-37通过调控M-CSF和抑制IL-6-JAK2/STAT3信号通路抑制骨质疏松的机制研究

目的:探讨IL-37 在抑制骨质疏松过程中的作用机制。方法:选取本院2013 年1 月至2015 年12 月收治的97例骨质疏松患者及在本院行骨折手术的81 例无骨质疏松患者(对照组)为研究对象,检测两组血清中IL-37 及IL-6 的水平。构建IL-37 转基因小鼠,将C57BL/6J 小鼠、IL-37 转基因小鼠分别设置假手术(Sham)组,手术组(卵巢切除术,OVX 组)。8 周后,取小鼠血清,检测血清中雌激素水平、碱性磷酸酶水平(ALP)、血钙和血磷水平;同时取小鼠的双侧股骨、脊柱,病理切片分析股骨组织形态结构,骨密度仪检测脊柱骨密度变化。分离培养各组小鼠骨髓基质细胞(Bone marrow stromal cells,BMSCs), 检测BMSCs 的体外增殖能力,M-CSF 及IL-6 的表达及STAT3 的激活。IL-37 转染小鼠成骨细胞MC3T3-E1,转染后72 h,ELISA 检测上清中M-CSF 及IL-6,流式细胞术检测MC3T3-E1 细胞的凋亡,Western blot 检测STAT3 的激活。结果:骨质疏松患者血清中IL-37 水平显著低于对照组(P<0.05),而IL-6 则显著高于对照组;C57BL/6J 小鼠、IL-37 转基因小鼠OVX 组血清中雌激素、血钙和血磷显著低于假手术组,而ALP 水平显著高于假手术组(P<0.05),但IL-37 转基因小鼠OVX 组血钙和血磷则显著高于C57BL/6J 小鼠OVX 组(P<0.05)。股骨病理切片及脊柱骨密度结果显示,C57BL/6J 小鼠、IL-37 转基因小鼠OVX组均出现组织形态结构的破坏和骨密度下降,但IL-37 转基因小鼠明显优于C57BL/6J 小鼠(P<0.05)。IL-37 转基因小鼠OVX 组BMSCs 增殖能力显著高于C57BL/6J 小鼠OVX 组,而STAT3 的激活和M-CSF 的表达则显著低于C57BL/6J 小鼠OVX组(P<0.05)。MC3T3-E1 细胞转染IL-37 后能明显抑制M-CSF 及IL-6 的表达,而STAT3 的激活也明显被抑制,流式细胞检测显示转染IL-37 后能显著抑制MC3T3-E1 细胞的凋亡。结论:骨质疏松患者血清IL-37 水平显著降低,IL-37 可能是通过调控M-CSF 及IL-6-JAK2/ STAT3 信号通路促进BMSCs 增殖和抑制成骨细胞的凋亡从而抑制骨质疏松的进展。     

miR-146a在大鼠缺血再灌注肝损伤中的表达及作用

目的:评价肝组织微小RNA-146a(miR-146a)表达变化与大鼠缺血再灌注(I/R)炎性肝损伤的关系。方法:72只SD大鼠随机分为非手术组(N组)、假手术组(S组)及I/R组,按分组处理后分别检测各组大鼠0、2、12和24 h(每组各时点n=6)血浆丙氨酸转氨酶(ALT)活性及白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量,real-time PCR检测肝组织Toll样受体4(TLR4)、IL-6、TNF-α和miR-146a表达,Western blot分析肝组织中TLR4、IL-6和TNF-α表达。结果:N组大鼠各时点血浆ALT活性及IL-6和TNF-α含量与肝组织中TLR4、IL-6和TNF-α表达量无显著差异。S组大鼠血浆IL-6和TNF-α含量升高(P0.01),但血浆ALT活性与肝组织TLR4、IL-6和TNF-αm RNA及蛋白的表达量却无明显变化。I/R后,大鼠血浆ALT活性及IL-6和TNF-α含量明显升高(P0.01),肝组织TLR4、IL-6和TNF-αm RNA及蛋白的表达量亦显著升高(P0.01),且随着时间延长,各指标仍持续升高;肝组织miR-146a表达量显著下降,其中在缺血12 h时下降最为明显,到24 h表达量再次升高,但始终低于I/R前(P0.01)。N组及S组大鼠各时点肝组织miR-146a表达量显著高于I/R组I/R后相应时点的表达(P0.01)。结论:I/R大鼠肝组织miR-146a表达下降的同时存在TLR4信号通路的激活及炎性肝损伤的发生。     

益气化瘀化痰方对UUO诱导的肾间质纤维化大鼠KLF15、HMGB1、NF-κB及其下游炎症因子表达的影响

目的:观察益气化瘀化痰方(YHHD)对单侧输尿管结扎(UUO)模型大鼠肾间质纤维化的作用及其可能机制。方法:48只雌性SD大鼠,随机分为假手术组、UUO模型组、替米沙坦组及YHHD低、中、高剂量组,每组8只。除假手术组外,其余各组采用UUO法建立肾间质纤维化模型。各药物干预组以相应浓度的药物灌胃,模型组及假手术组以等体积生理盐水灌胃,每日1次,连续用药12周后采集标本并处死大鼠,检测大鼠血清胱抑素C(Cys-C)和尿酸(UA)的水平,PAS染色观察肾组织形态学改变,Masson染色计算肾间质胶原纤维沉积率,realtime PCR检测肾组织Krüppel样因子15(KLF15)、高迁移率族盒蛋白1(HMGB1)、核因子κB(NF-κB)及其抑制蛋白IκB、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、纤维连接蛋白(FN)、I型胶原(Col I)和Ⅳ型胶原(ColⅣ)的m RNA表达水平,Western blot检测KLF15、HMGB1和NF-κB的蛋白表达,免疫组化检测MCP-1的蛋白表达。结果:与假手术组相比,模型组的胶原纤维沉积率及Cys-C水平显著升高(P0.05),KLF15的m RNA及蛋白表达显著下调(P0.05),HMGB1、NF-κB、IκB、MCP-1、IL-1β、TNF-α、FN、Col I和ColⅣ的m RNA及HMGB1、NF-κB和MCP-1的蛋白表达显著上调(P0.05);与模型组相比,YHHD中、高剂量组及替米沙坦组的胶原纤维沉积率显著降低(P0.05),且HMGB1和NF-κB的蛋白表达以及IL-1β和TNF-α的m RNA表达显著下调(P0.05);YHHD高剂量组及替米沙坦组KLF15的蛋白表达显著上调(P0.05),MCP-1的蛋白表达及FN的m RNA表达显著下调(P0.05);YHHD高剂量组KLF15的m RNA表达显著上调(P0.05),MCP-1、Col I和ColⅣ的m RNA表达明显下调(P0.05);YHHD各剂量组及替米沙坦组NF-κB和IκB的m RNA表达及Cys-C水平明显降低(P0.05)。各组间UA水平的差异无统计学显著性。结论:益气化瘀化痰方对肾间质纤维化的抑制作用呈剂量依赖性,高剂量组作用最明显;其机制可能与上调KLF15表达、抑制肾组织HMGB1和NF-κB及其下游炎症相关因子的表达有关。     

TLR4在LPS诱导的结肠炎症恢复中的作用

目的:研究Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR-4)在结肠炎症中的作用,探讨LPS在炎症性肠病中的治疗作用。方法:取正常肠上皮细胞进行体外脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)干预培养。采用慢病毒转染技术,构建TLR4低表达、正常表达及高表达的肠上皮细胞亚组。正常表达组(normal组)及高表达组(high组)培养基中加入LPS诱导细胞炎症,刺激时间分别为0、2、4 h。Western blot法检测TLR4的表达;收集细胞上清液,ELISA检测各亚组细胞炎症因子TNF-α、IL-6和IL-8的水平。收集细胞,qPCR检测细胞因子TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10和IL-1βmRNA的表达水平。划痕试验观察对比2组细胞的迁移能力。结果:LPS干预培养细胞后,TLR4的表达量显著增加(P0.05)。ELISA和qPCR检测高表达组与正常表达组组间细胞因子TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10和IL-1β的蛋白和mRNA水平的差异均有统计学意义(P0.05)。划痕试验提示TLR4高表达组的细胞迁移能力明显高于正常对照组。结论:LPS影响TLR4炎症通路的活化,促进前炎症因子及辅助刺激分子的释放,起到调节炎症反应的作用。     

CXCR4、IL-22表达与肛周脓肿病理因素的关系及预测术后转归的价值

目的探究CXC型趋化因子受体4(CXCR4)、白细胞介素-22(IL-22)表达与肛周脓肿患者临床病理因素的关系及其对术后转归的预测价值。方法选取91例行手术治疗的肛周脓肿患者作为研究对象,根据术后转归情况分为治愈组(65例)与未治愈组(26例)。比较2组及不同临床病理因素患者局部组织中CXCR4、IL-22蛋白阳性表达率及mRNA相对表达量,分析局部组织中CXCR4、IL-22与临床病理因素、术后转归的相关性,评价局部组织中CXCR4、IL-22对术后转归的预测价值。结果未治愈组患者局部组织中CXCR4、IL-22蛋白阳性表达率及mRNA相对表达量高于治愈组(P<0.05)。不同年龄、性别、脓肿位置、脓肿类型、病程的患者局部组织中CXCR4、IL-22蛋白阳性表达率及mRNA相对表达量差异无统计学意义(P>0.05);不同脓肿大小、愈合时间的患者局部组织中CXCR4、IL-22表达情况比较,差异存在统计学意义(P<0.05)。局部组织中CXCR4、IL-22蛋白阳性表达率、mRNA相对表达量与脓肿大小、愈合时间呈正相关(P<0.05)。调整其他因素后,Logistic回归分析结果显示,局部组织中CXCR4、IL-22蛋白及mRNA表达与术后转归显著相关(P<0.05)。以未治愈组作为阳性样本,治愈组作为阴性样本,绘制受试者工作特征(ROC)曲线,局部组织中CXCR4蛋白、CXCR4 mRNA、IL-22蛋白、IL-22 mRNA联合预测术后转归的曲线下面积(AUC)为0.973(95%CI0.916~0.996),敏感度为88.46%,特异度为95.38%,预测价值显著优于各指标单独预测(P<0.05)。结论肛周脓肿患者局部组织中CXCR4、IL-22蛋白及mRNA表达与脓肿大小、愈合时间呈正相关,联合检测可作为预测术后转归的重要手段。