普通甲醛固定石蜡包埋组织DNA提取方法的探讨

背景与目的:在国内,几乎所有的医院和科研机构均应用普通甲醛固定手术标本,但因为普通甲醛固定石蜡包埋组织中的DNA降解相对严重,从这些蜡块中提取高质量的DNA非常困难。本研究的目的是寻找从普通甲醛固定石蜡包埋组织中提取DNA的理想方法。方法:取我院2000年甲醛固定石蜡包埋的手术切除食管癌标本15例,分别以蛋白酶K消化和不同pH值下加热两种裂解方法裂解细胞,以酚氯仿抽提法提取其DNA;并在蛋白酶K消化法进行DNA提取的过程中,应用交叉设计对二戊烯或二甲苯脱蜡、37℃或56℃消化48h或72h、氯化钠盐析或酚氯仿抽提4种参数进行研究,所得DNA质量以电泳分析和PCR扩增结果判断。结果:蛋白酶K消化酚氯仿抽提法所得DNA产量(平均值为17.88μg)和质量均高于pH值为7～12条件下的加热提取法(P<0.05)。56℃消化所得的DNA质量明显优于37℃,而消化72h的DNA亦明显优于48h者。不同脱蜡方法和抽提方法对DNA的产量和质量影响不大,结论:以蛋白酶K消化氯化钠盐析法,从普通甲醛固定石蜡包埋组织中提取DNA质量较可靠。并且,应用蛋白酶K于56℃消化3天更能获得高质量和高产量的DNA。     

简化的质粒PEJ 6·6 DNA制备方法

我们采用改良的Morrison法,将含膀胱癌转化基因的质粒PEJ6.6转化大肠杆菌,然后从转化细菌中以碱变性—PEG沉淀法提取质粒DNA,这样便可以用简单的方法得到大量已克隆的含膀胱癌转化基因的质粒DNA。     

茶多酚对质粒DNA辐射损伤的保护作用

茶多酚是从茶叶中提取的一种抗氧剂,据报道它有清除自由基、防突变、防癌的效果。为了研究其对辐射损伤是否也有保护作用,我们建立了以质粒PBR322 DNA三种构型(共价闭环SC、开环OC、线状分子L)的变化为模型,用琼脂糖凝胶电泳检测DNA链断裂的方法,并以此测定了茶多酚对Υ-线照射所致DNA链断裂的保护作用。 运用此方法首先观察了不同剂量Υ线照射后样品中SC和OC所占比例的变化关系。发现在0、15、30、     

以DNA拓扑异构酶Ⅱ为靶点的一种抗癌药筛选的新方法

借鉴文献方法,我们以小鼠L_(1210)白血病细胞为村料,提取DNA拓扑异构酶Ⅱ,鉴别了其生物学特性,并观察了十多种已知及未知的抗癌药物对其活性的影响,初步建立了以DNA拓扑异构酶Ⅱ为靶点的新抗癌药筛选方法。实验表明DNA拓扑异构酶Ⅱ对DNA链切割反应是可逆的,并且高浓度的氯化钠对其活性有抑制作用。许多药物能促进拓扑酶Ⅱ引起的DNA链断裂如ADM、DNR、Vp16及ACM—B等,而另一些药物如萜类化合物BC_1、BC_4等则能抑制链断裂反应。     

食管癌DNA倍体分析方法探讨

目的探讨不同方法检测DNA倍体结果的一致性及可靠性。方法分别采用单细胞制备仪、组织匀浆器及石蜡组织提取DNA标本,通过流式细胞仪同时检测56例食管癌DNA倍体。结果采用单细胞制备仪、组织匀浆器及石蜡组织提取DNA标本,56例食管癌非整倍体率分别为48.21%、44.64%和42.86%,其中各有1例为近二倍体。采用石蜡组织法检测DNA倍体SPF值为(18.205±7.719)%,高于组织匀浆器提取法的(17.330±8.160)%和单细胞制备仪提取法的(15.479±7.811)%,但差异无统计学意义(t=0.583、1.858,P=0.561、0.066);组织匀浆器提取法SPF值高于单细胞制备仪提取法,但差异无统计学意义(t=1.227,P=0.223)。结论不同方法检测DNA倍体SPF值差异不具有统计学意义,采用单细胞制备仪方法检出非整倍体率最高,可能为最佳检测DNA倍体的方法。     

化学法提取贮存骨髓涂片DNA检测Fms样酪氨酸激酶3基因突变预测急性髓系白血病患者预后

目的 探讨用化学法(苯酚:氯仿:异戊醇法)从贮存的骨髓涂片中提取微量DNA检测Fms样酪氨酸激酶3内部串联重复(FLT3-ITD)突变情况,分析其对急性髓系白血病(AML)预后的预测价值.方法 采用化学法从58例-20℃贮存1~5年的骨髓涂片(AML 48例和非恶性血液病10例)中提取微量DNA,采用聚合酶链反应(PCR)技术检测患者FLT3-ITD突变情况.结果 48例初治AML患者中6例(12.5%)检测到FLT3-ITD,10例非恶性血液病患者中均未检测到FLT3-ITD.FLT3-ITD阳性AML患者初次诱导完全缓解(CR)率较FLT3-ITD阴性者低[0(0/6)比77.78%(21/27),P=0.001],总生存时间短(x2=7.274,P=0.007).肝、脾大和FLT3突变是影响AML患者初次化疗CR的危险因素(OR=7.2,P=0.12;OR=36.3,P=0.10).FLT3-ITD是初治AML患者不良预后的危险因素(RR=9.088,P=0.029).结论 使用化学法提取贮存的AML患者骨髓涂片微量DNA可在临床中应用,是进行回顾性分子生物学研究的重要实验方法.从骨髓涂片中提取微量DNA检测FLT3-ITD可用于预测AML预后.     

甲状腺细针穿刺不同细胞学标本保存方法对BRAF V600E基因突变检测的影响

目的:探讨不同保存方法对甲状腺细针穿刺细胞学标本BRAF V600E基因突变检测的影响。方法:回顾性分析自2019年01月至2022年02月华北理工大学附属医院收治的接受B超引导下行甲状腺细针穿刺检查的患者164例。分别从商品化细胞保存液固定标本、生理盐水保存标本和刮取染色后涂片标本中提取DNA并检测BRAF V600E基因突变。结果:通过三种保存方法提取的DNA浓度均数及内控Ct值相比,差异均无统计学意义（P＞0.05）。细胞保存液组和生理盐水保存液组、生理盐水保存液组和刮片组所提取DNA的A260/280值相比,差异均无统计学意义（P＞0.05）,而细胞保存液组和刮片组所提取DNA的A260/280值比较,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论:甲状腺FNAC涂片标本刮片后进行基因突变检测获得DNA的纯度高,且对实验室要求低,适宜在基层医院推广。     

蝎形探针扩增阻滞突变系统检测肺癌患者血清与肿瘤组织中表皮生长因子受体基因突变

目的 应用蝎形探针扩增阻滞突变系统(Scorpions ARMS)检测肺癌患者血清游离DNA和肿瘤组织中表皮生长因子受体(EGFR)基因突变,探索二者间的一致性.方法 用硅胶膜离心柱法提取石蜡切片中DNA,比较硅胶膜离心柱法、酚氯仿法及磁珠法提取血清游离DNA的结果.应用Scorpions ARMS检测石蜡包埋肿瘤组织...     

简便快速提取人肺癌组织线粒体DNA

背景与目的线粒体DNA(mitochondrialDNA,mtDNA)突变与肿瘤的关系是目前研究的热点,而mtDNA的提取方法是这些研究的重要步骤。但现有的mtDNA提取方法较繁琐复杂,本研究拟建立一种简便快速提取人肺癌组织线粒体DNA的方法,为进一步探讨mtDNA突变与肺癌的发生发展的关系作准备。方法应用碱裂解法和氯仿异戊醇直接提取40例肺癌手术切除组织标本中mtDNA,然后用PCR扩增产物来鉴定所提取的mtDNA。结果获得的mtDNA样品不存在蛋白质等污染,用特异性mtDNAPCR引物,从40份样品中均能扩增出1528bpmtDNA基因片段。每克癌组织可获(7.97±0.12)μgmtDNA。结论该方法是快速、实用、重复性好的组织细胞mtDNA提取方法,适用于临床及科研中标本量少及大批量提取mtDNA。     

新疆哈萨克族食管鳞癌中人乳头状瘤病毒感染的检测

目的：检测新疆哈萨克族食管鳞癌患者中人乳头状瘤病毒（HPV）DNA的总感染率，通过统计学分析，探讨HPV感染与新疆哈萨克族食管鳞癌的相关性。方法：采用聚合酶链反应（PCR）技术检测了318例新疆哈萨克族食管鳞癌（ESCC）石蜡包埋组织中HPV DNA的感染情况，其中117倒用直接裂解法制备样本DNA，201例用酚－氯仿－异戊醇提取DNA；PCR产物双向测序。测序结果应用BLAST在线分析，统计处理采用X^2检验，分析HPV与新疆哈萨克族食管鳞癌发生的相关性。结果：在新疆哈萨克族食管鳞癌组织中，HPV DNA总检出率为64．5％（205／318）。其中直接裂解法组HPV DNA栓出率为82．9％（97／117），酚－氯仿－异戊醇提取DNA纽HPV DNA捡出率为53．7％（108／201），二者之间差异有统计学意义（P〈0．05）。按照病理分化程度对哈萨克族ESCC样本DNA中HPV总感染率进行分析发现，高分化ESCC中HPV阳性率为63.2％，中分化ESCC中HPV阳性率为69．8％，低分化ESCC中HPV阳性率为50．0％，三者之间差异无统计学意（P〉0．05）结论：HPV DNA感染与新疆哈萨克族食管鳞癌存在相关性．可能是新疆哈萨克族食管癌发生的重要因素之一。     

尿液游离DNA检测及其在肿瘤诊治中应用的研究进展

尿液中的游离DNA来源于尿道脱落细胞的崩解和通过尿道过滤屏障的血液循环cfDNA。作为液体活检的重要对象,尿中游离DNA可能成为一种新型的标记物用于肿瘤无创筛查与诊断、病情监测和疗效评估。本文将对尿液游离DNA的提取与检测方法及其在多种肿瘤的临床应用等方面的研究进展进行总结综述。     

双链DNA直接测序法在环境诱变剂研究中的应用——Ⅰ.非突变质粒抗性基因片段的序列测定

在环境诱变剂致突变分子机制的研究中,我们曾先后建立了一系列确定DNA分子结构改变的研究方法。为了更直接反映诱变剂对DNA分子作用的序列专一性、碱基专一性及突变“热点”等信息,又鉴于国内有关这方面的报道资料极少,我们建立了质粒双链DNA直接测序的方法。     

在贮存骨髓涂片中提取DNA进行白血病患者FMS样酪氨酸激酶3基因突变检测的可行性

 目的　研究在贮存骨髓涂片中提取微量DNA的可行性,探索贮存骨髓涂片中提取微量DNA检测FMS样酪氨酸激酶3-内部串联重复突变（FLT3-ITD） 的应用价值。方法　选取79份-20 ℃保存1～5年的急性白血病（AL）骨髓涂片,分别用Chelex-100法、Chelex-100联合苯酚∶氯仿∶异戊醇法、苯酚∶氯仿∶异戊醇法提取微量DNA,同时以10例非恶性血液病患者骨髓涂片作为对照。并采用聚合酶链反应（PCR）技术扩增FLT3-ITD,扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）检测两组患者的FLT3-ITD。结果　苯酚∶氯仿∶异戊醇法能成功提取贮存骨髓涂片微量DNA,Chelex-100法、Chelex-100联合苯酚∶氯仿∶异戊醇法未能提取到DNA（χ2＝190.722,P＝0.000）。结论　使用苯酚∶氯仿∶异戊醇法可在贮存骨髓涂片中提取微量DNA,可用于进行回顾性分子生物学研究,而Chelex-100法、Chelex-100联合苯酚∶氯仿∶异戊醇法不能提取贮存骨髓涂片微量DNA。     

PTPN12低表达参与调控肺癌H1299细胞凋亡的作用及对放疗敏感性的影响

目的 探讨PTPN12低表达参与调控肺癌H1299细胞凋亡的作用及对放疗敏感性的影响。方法 选取肺癌患者82例,应用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit试剂盒进行样本DNA提取,采用NanoDrop1000 spectrophotometer测定样本DNA浓度与纯度,所提取的DNA采用紫外分光光度仪进行浓度检测与质量评估。采用化学发光法检测外周血血清肿瘤标志物[癌胚抗原(CEA)、糖类抗原125(CA125)、细胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)、鳞状上皮细胞癌抗原(SCC-Ag)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、肿瘤特异性生长因子(TSGF)]。扩增产物采用western blot法进行蛋白产物的定性和定量分析。结果 PTPN12表达对肺癌病情的调控作用分析结果可见,在组织分化和病理分期更严重的患者中PTPN12-mRNA表达更低,且在随访生存期更低的患者中也可见表达更低,均有统计学意义;但PTPN12蛋白表达只在不同病理分期患者中检出差别有统计学意义,且同mRNA表达规律相一致;而在不同组织分化和预后患者间差别尚未见统计学意义,与样本量等因素限制有关。PTPN1...     

喉癌病例中HPV感染状态的初步探讨

目的:对喉癌病例中人乳头状瘤病毒（human papillomavirus,HPV）的感染状况进行初步探讨。方法:收集40例新发喉鳞状细胞癌患者（均为广东地区患者）的临床数据及新鲜组织标本,提取DNA,利用Digene HC2 HPV DNA test 试剂盒检测组织标本中的HPV DNA。结果:40例喉癌肿瘤及其癌旁组织标本均为HPV阴性。结论:喉癌病例中HPV感染率低。未来仍需进行进一步大规模HPV感染率的检测。     

Cyclin D1(CCNDl)A870G 基因多态性与保定地区结肠癌的关系

为了探讨cyclin D1(CCNDl)A870G 基因多态性与保定地区结肠癌患者的年龄、性别、高胆固醇血症、家族史、 病理分型、病理分期的关系,我们从200 例保定地区结肠癌患者和200 例保定地区健康体检者的血中提取DNA,用聚合 酶链反应和限制性酶切片段长度多态体分析对提取的 DNA 进行多肽性分析。结果显示,病例组和对照组 AA\ AG\GG 基因 频率无明显差异。高胆固醇及重度吸烟的结肠癌患者GG 基因型频率明显高于其他基因型,有明显差异（P<0.05）,重度 吸烟及高胆固醇血症在健康体检人群中GG 基因型无明显差异（P>0.05）。由此推断高胆固醇血症及吸烟可作为在cyclin D1(CCNDl)A870G 基因多态性中GG 基因型中结肠癌发生的危险因子,遗传因素的结肠癌患者AA 基因型频率明显高于其 他基因型,有明显差异（P<0.05）。由此推断遗传因素可作为在cyclin D1(CCNDl)A870G 基因多态性中AA 基因型中结肠 癌发生的危险因子,这将为进一步研究结肠癌分子生物学的发生机制提供依据。     

前列腺癌的p16基因甲基化程度定量分析

目的 建立和评价基因组DNA甲基化的定量分析方法,并比较正常前列腺组织和前列腺癌组织中的p16抑癌基因的DNA甲基化差异.方法 提取正常前列腺组织和前列腺癌组织中的基因组DNA,用亚硫酸氢钠将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶,经过PCR扩增后,用BstUⅠ和HpaⅡ限制性内切酶消化,通过电泳分离消化的片段,定量分析基因组中...     

乳腺癌DNA含量与临床病理因素、PCNA关系

[目的]探讨乳腺癌DNA含量与临床病理因素及增殖指标PCNA的关系及其预后价值.[方法]利用图像分析技术测定90例乳腺癌DNA含量,SP法检测PCNA蛋白表达水平,多因素COX模型分析预后.[结果]90例乳腺癌异倍体率87.8%,低分化组乳腺癌DNA含量平均秩次高于高分化组(P＜O.05),DNA含量与PCNA相关系数为r=0.257,P＞O.05.DNA含量与PCNA均未进入COX方程中,淋巴结转移、年龄进入方程中.[结论]DNA含量可以反映乳腺癌的分化程度,对预后有参考价值.PCNA蛋白表达与DNA含量无相关性,两者均不是独立的预后因素.     

从贮存20年的微量细胞中提取DNA并做PCR分析的实验研究

目的:探讨从二十年前贮存的食管拉网微量细胞涂片中提取DNA并进行食管癌基因检测的方法和可行性,比较P53基因的突变在食管癌前期病变和正常食管上皮中的差异。方法:利用螯合型的离子交换树脂Chelex100作为介质,一步法从食管拉网脱落细胞提取DNA,应用PCR-SSCP方法和PCR-RFLP方法进行p53基因第5外显子及第7外显子的突变检测。结果:48例标本P53基因检测均获成功。食管上皮重度不典型增生细胞中发现有5例突变发生,均为p53基因第7外显子,而第5外显子未发现突变;正常食管鳞状上皮拉网脱落细胞中均未发现突变。检测到的5例突变中,其中有3例分别在10年、12年和14年后转变为食管癌。结论:Chelex100法能从微量细胞涂片中提取DNA,使对20年前食管拉网细胞涂片标本进行分子水平的检测成为可能。为食管癌前期病变的研究提供一种新的方法。p53基因的突变使食管上皮癌前期病变细胞具有了癌变趋势。     

癌症与血浆中突变的DNA

近20多年来,具有实用价值的分子技术使肿瘤发生学研究发生了根本的改变。分析发现,突变不但发生于肿瘤DNA,也存在于从某些癌症病人脑脊液、尿液、胰液、胆汁和粪便中所提取的DNA,最近的两组研究又在血浆中发现了突变的DNA。一组21例小细胞肺癌中,16例存在不稳定的微卫星灶,除1例外,血浆中的DNA均发生相应突变。另一组21例头颈部癌中的17例存在微卫星灶,其中5例的血浆提取DNA有突变。 自由循环遗传物质的存在并非异常现象。40多年前,科学家就了解到正常人血桨中存在微量DNA。在慢