转化生长因子β对成骨细胞增殖、BMP-2及Cbfal基因表达的影响

目的：通过转化生长因子β（TGF-β）对体外成骨细胞增殖、骨形态蛋白-2（BMP-2）及核心结合因子1（Cbfal）基因表达的影响,探讨TGF-β对骨代谢影响的可能机制。方法：不同浓度的TGF（0、0.01、100ng/ml）刺激体外培养的大鼠成骨细胞,采用噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖能力,用半定量RT-PCR法检测成骨细胞BMP-2、Cbfal基因的表达。结果：TGF-β可明显促进成骨细胞增殖（P〈0.05）,并促进成骨细胞BMP-2、Cbfal基因的表达（P〈0.01）,具有浓度依赖性。结论：TGF-β可促进成骨细胞的增殖、分化及成熟,可能是通过增强BMP-2、Cbfal基因的表达来实现的。     

二甲双胍对骨代谢的影响

二甲双胍（metformin）是2型糖尿病患者的一线用药,在50余年的临床应用中,已显示出安全、有效、全面控制血糖的效果。近年越来越多的研究发现,二甲双胍促进体外成骨细胞的增殖、分化及细胞外基质矿化,逆转高浓度葡萄糖对成骨细胞功能的损伤,抑制破骨细胞的形成;动物研究进一步证实二甲双胍增加鼠的骨矿含量以及松质骨容量,促进新骨形成,促进正常血糖大鼠及糖尿病大鼠的骨损伤修复;临床研究也发现二甲双胍影响糖尿病患者骨密度,但其对骨代谢的影响以及机制尚未完全阐明。本文综述了二甲双胍对骨代谢的影响,并探讨其可能的作用机制。     

淫羊藿甙对体外培养大鼠成骨细胞Cbfa1基因表达的影响

目的观察淫羊藿甙对体外培养大鼠成骨细胞功能及对转录因子核心结合因子a1（Cbfa1）mRNA表达的影响,探讨淫羊藿甙抗骨质疏松的作用机制。方法用酶消化法获得新生（〈24 h）SD大鼠颅盖骨成骨细胞,进行体外原代培养。将不同浓度的淫羊藿甙（1,10,100 ng/ml）分别加入培养液中,观察成骨细胞的形态、增殖和分化功能。用RT-PCR法测定成骨细胞Cbfa1、碱性磷酸酶（ALP）和Ⅰ型胶原（ColⅠ）mRNA表达水平的变化。结果 1、10和100 ng/ml淫羊藿甙均可促进Cbfa1、ALP和ColⅠmRNA表达（P〈0.05）,且以10 ng/ml组作用最显著。结论淫羊藿甙能促进体外培养成骨细胞增殖与分化,通过提高成骨细胞转录因子Cbfa1的基因表达水平诱导骨形成,是其抗骨质疏松作用机制之一。     

二甲双胍对糖尿病大鼠肝脏葡萄糖-6-磷酸酶表达的影响

目的：探讨二甲双胍抑制肝糖输出，减轻肝脏胰岛素抵抗的分子学机制。方法：建立糖尿病大鼠模型并将之分为正常对照组、糖尿病组、低剂量二甲双胍干预组、高剂量二甲双胍干预组，饲养2周后取出肝脏，以半定量RT-PCR方法测定肝脏葡萄糖-6-磷酸酶（G6Pase）mRNA的表达，蒽酮比色法测定肝脏糖原含量。结果：（1）糖尿病组肝脏G6Pase催化亚基（P36）及转运亚基（P46）mRNA的灰度高于正常对照组（P〈0．05），而肝脏糖原含量低于正常对照组（P〈0．05）。（2）二甲双胍可以明显减少肝脏G6Pase mRNA表达并增加肝糖原含量（P〈0．05），且呈剂量依赖性。结论：二甲双胍能够抑制糖尿病状态下肝脏G6Pase催化亚基及转运亚基mRNA表达，使得6-磷酸葡萄糖向葡萄糖的转化减少，从而减少肝糖输出，达到减轻胰岛素抵抗的作用。     

二甲双胍对糖尿病大鼠肝脏中重要转运蛋白表达的影响

目的：研究二甲双胍对糖尿病大鼠肝脏中重要转运蛋白表达的影响.方法：利用高脂肪饲料与链脲佐菌素（STZ）诱导产生糖尿病模型大鼠.将造模后大鼠分为模型对照组、二甲双胍低剂量组（30 mg·kg^-1·d^-1）、二甲双胍高剂量组（100 mg·kg^-1·d^-1）,口服给药4周,同时设正常对照组.检测并比较不同组别大鼠肝脏组织中P糖蛋白（P-gp）与多药耐药相关蛋白（MRP）2蛋白表达量与相应mRNA表达水平.结果：二甲双胍高、低剂量组的P-gp与MRP2蛋白表达及mRNA水平均明显低于模型对照组（P＜0.05）,且二甲双胍高剂量组明显低于二甲双胍低剂量组（P＜0.05）.结论：二甲双胍可能通过抑制肝脏的P-gP与MRP2蛋白表达及mRNA水平,从而发挥降糖作用,可能是其作用机制之一.     

柚皮苷对乳鼠成骨细胞增殖及c-fos、c-jun表达的影响

目的研究柚皮苷(naringin)对体外培养的小鼠成骨细胞增殖及c-fos和c-jun表达的影响。方法取第1代BALB/c小鼠颅盖骨成骨细胞,将柚皮苷以0.1、1、10μmol·L-1 3种浓度分别加入新生大鼠颅骨成骨细胞培养液中,MTT法观察各组对成骨细胞的增殖作用并绘制细胞生长曲线,用PNPP法测定成骨细胞内碱性磷酸酶(alkaliphos-phatase,ALP)活性,RT-PCR法检测成骨细胞c-fos和c-jun的转录水平。结果细胞生长曲线显示各组成骨细胞数量均随时间延长而增加,中、高浓度的柚皮苷能提高成骨细胞的ALP活性,促进c-fos mRNA表达(P<0.01),对成骨细胞c-jun mRNA表达增强作用不明显(P>0.05)。结论低浓度柚皮苷(0.1μmol·L-1)对骨更新作用不明显,而中、高浓度的柚皮苷(1、10μmol·L-1)能通过上调c-fos mRNA表达,促进成骨细胞的生成功能,增强骨更新。柚皮苷不是通过促进c-jun表达来促进成骨细胞增殖与分化的。     

二甲双胍通过激活自噬促进MC3T3-E1细胞系成骨分化的研究

目的探讨二甲双胍通过激活自噬促进MC3T3-E1细胞系成骨分化的作用。方法用含有不同浓度二甲双胍的成骨诱导剂处理MC3T3-E1细胞,其中二甲双胍的浓度分别为0(对照)、200、400、800μmol/L。利用碱性磷酸酶(ALP)染色检测二甲双胍促进MC3T3-E1细胞成骨的最适浓度,采用免疫印迹法(Western blotting)和免疫荧光法检测自噬相关蛋白,并选择出二甲双胍的最佳干预浓度。对照组、二甲双胍400μmol/L组、二甲双胍400μmol/L+3-甲基腺嘌呤(3-MA,5 mmol/L)组和3-MA 5 mmol/L组分别干预MC3T3-E1细胞4 h后,采用Western blotting法、免疫荧光法、透射电镜检测自噬指标,并利用ALP染色、半定量RT-PCR和Western blotting检测成骨能力。结果二甲双胍能够剂量相关性地促进MC3T3-E1细胞的ALP活性,并且400μmol/L二甲双胍是促进MC3T3-E1细胞成骨的最适浓度。二甲双胍0(对照)、200、400μmol/L组的LC3 Ⅱ/Ⅰ比值逐渐增大,P62/β-actin比值逐渐减小,LC3荧光强度逐渐增强;800μmol/L二甲双胍组的LC3 Ⅱ/Ⅰ值减小,P62/β-actin比例增大,LC3荧光强度下降;且与对照组比较,400μmol/L二甲双胍组的LC3Ⅱ/Ⅰ比值明显增大,P62/β-actin比值明显降低(P0.05),LC3荧光强度最强。与对照组比较,二甲双胍400μmol/L组中LC3 Ⅱ/Ⅰ的比值增大,P62蛋白表达减少(P0.05),LC3荧光强度增强,自噬体数量增多;ALP活性增强,成骨相关基因和蛋白OCN,COL1的表达增强(P0.001、0.05、0.01)。二甲双胍中加入3-MA 5 mmol/L后,LC3 Ⅱ/Ⅰ的比值减小,P62蛋白表达增多,LC3荧光强度减弱,自噬体数量减少;ALP活性减弱,成骨相关基因和蛋白OCN,COL1的表达减弱。结论二甲双胍能通过激活MC3T3-E1细胞系的适度自噬促进其成骨分化。     

二甲双胍对大鼠垂体-性腺轴钙调蛋白mRNA表达的影响

目的研究二甲双胍(metformin,MF)对大鼠垂体—性腺轴钙调蛋白(calmodulin,CaM)mRNA表达的影响。方法采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,系统观察MF对大鼠垂体—性腺轴钙调蛋白mRNA表达的影响。结果MF270mg·kg-1·d-1,ig,连续给药21d,可抑制大鼠睾丸细胞CaM mRNA的表达(P<0.01),而对垂体分泌细胞CaM mRNA的表达则无明显影响。结论二甲双胍可抑制大鼠睾丸细胞CaM mRNA的表达。     

二甲双胍对2型糖尿病大鼠肠神经GLP-1受体表达的影响

目的研究二甲双胍对2型糖尿病（Type2diabetesmellitus,T2DM）大鼠肠神经细胞胰高血糖样肽-1受体（Glucagon—likepeptide-1 receptor,GLP-1R）表达的影响,探讨二甲双胍用药后肠神经GLP-1R的表达变化与血糖的关系。方法雄性Wistar大鼠随机分为3组,每组6只：wistar正常大鼠组（W-C）;T2DM模型对照组（T2DM—C）;T2DM二甲双胍组（T2DM—M）。分别测定各组大鼠用药前及用药后第2、8周空腹血糖、空腹血清GLP-1,用药前及用药后8周空腹血清胰岛素。第8周处死各组大鼠,RT-PCR和免疫印迹法（Westernblot）测定回肠末端肌间神经丛GLP一1RmRNA和蛋白的水平。结果T2DM—M组大鼠用药后空腹血糖及空腹血清胰岛素较前显著降低（P〈0．01）,空腹血清GLP一1较前显著升高（P〈0．01）,与同时间点T2DM—C组相比差异有统计学意义（P〈0．01）。用药后第8周,RT—PCR结果显示GLP-1RmRNA在T2DM—M组肠神经丛表达水平明显高于T2DM—C组GLP-1RmRNA的表达水平（P〈0．01）。Western—blot结果显示T2DM-M组肠神经丛GLP-1R蛋白表达水平明显高于T2DM—C组肠神经丛GLP-1R蛋白表达水平（P％0．05）。结论二甲双胍能显著提高T2DM大鼠肠神经GLP-1R的表达,可能在二甲双胍降低2型糖尿病的血糖中发挥了重要作用。     

二苯乙烯苷对大鼠成骨细胞增殖及分化的影响

目的研究二苯乙烯苷（THSG）对大鼠成骨细胞增殖、分化的影响。方法体外分离、培养SD大鼠成骨细胞,M1rr法检测成骨细胞增殖活性;碱性磷酸酶（ALP）活性试剂盒检测成骨细胞AIJP活性比;Elisa方法检测成骨细胞c-fos和c—ju．蛋白表达水平。结果0．03—10rag／mr的THSG干预成骨细胞24h成骨细胞活性较对照组明显增强（P〈0．05或〈0．01）;在二苯乙烯苷干预细胞后第3天时,二苯乙烯苷组成骨细胞ALP活性较对照组明显增加（P〈0．05或〈0．01）,成骨细胞c-fos和c-jun表达均较对照组明显增强（P〈0．05或〈0．01）。结论二苯乙烯苷能显著促进成骨细胞发育成熟。     

高糖环境中吡格列酮对MC3T3-E1成骨细胞的作用及其机制

目的观察高糖环境下吡格列酮对MC3T3-E1成骨细胞的作用并探讨其可能机制。方法高糖(22.5 mmol·L~(-1))环境培养MC3T3-E1细胞,分为对照组,吡格列酮2.5、5、10μmol·L~(-1)组,干预24、48 h。检测细胞增殖活性、凋亡率、骨钙素和碱性磷酸酶(ALP)分泌水平,以及过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、成骨因子runt相关基因2(Runx2)和骨形态蛋白2(BMP-2)mRNA的表达水平。并分析PPARγ、Runx2的表达与骨钙素、ALP、BMP-2的相关性。结果在相同干预时限,吡格列酮各组MC3T3-E1成骨细胞增殖活性、骨钙素和ALP的分泌水平、Runx2 mRNA和BMP-2 mRNA的表达均低于对照组,凋亡率和PPARγmRNA的表达高于对照组(P<0.05)。随吡格列酮浓度增加,细胞增殖活性、骨钙素和ALP的分泌、Runx2 mRNA和BMP-2 mRNA的表达均降低,而细胞凋亡率和PPARγmRNA的表达增高(P<0.05)。与干预24 h相比,干预48 h时相同浓度吡格列酮组细胞增殖活性,骨钙素和ALP的分泌水平,PPARγ、Runx2、BMP-2 mRNA的表达或无变化或略增加。结论高糖环境下吡格列酮对成骨细胞有损害作用,促进PPARγ表达、抑制Runx2的表达可能为其作用机制之一。     

Metformin regulates osteoblast and adipocyte differentiation of rat mesenchymal stem cells

Metformin is widely used for the treatment of type 2 diabetes mellitus. In this study, we evaluated the effects of metformin on the osteoblast and adipocyte differentiation of rat marrow mesenchymal stem cells (MSCs) in culture. Treatment of MSCs in osteoblastic or adipogenic medium with 100 μM metformin for 21 days led to an increased mRNA expression of the osteoblast markers but a decreased mRNA expression of the adipocyte markers in the MSCs. Metformin markedly stimulated deposition of mineralized nodules and blocked the formation of cytoplasmic lipid droplets. In addition, alkaline phosphate activity and Western blot analysis for core binding factor a1 (Cbfa 1) and peroxisome proliferator‐activated receptor gamma 2 (PPARγ2) proteins also confirmed that metformin inhibited adipocyte differentiation and promoted osteoblast differentiation. The reciprocal relationship between osteoblastic and adipogenic differentiation suggests that metformin may regulate osteoblastic and adipogenic differentiation through inhibition of PPARγ.     

大黄素对体外培养新生大鼠颅骨成骨细胞的影响

目的　观察大黄素(emodin)对体外培养新生大鼠颅骨成骨细胞增殖、分化作用特点及量效关系,并观察大黄素对骨保护蛋白(Osteoprotegerin,OPG)mRNA表达的影响。方法　在新生大鼠颅骨成骨细胞体系中加入不同浓度的大黄素,加药后 1、2、3d用MTT法检测细胞增殖, 3、5、7、9d用PNPP法检测细胞内碱性磷酸酶含量,加药后 7d检测细胞内OPGmRNA表达的量, 24d检测细胞上清中钙和细胞内羟脯氨酸含量。结果　大黄素能促进大鼠颅骨成骨细胞ALP活性,实验中最佳作用浓度为 1×10-6 mol·L-1,最佳作用时间是 7d。大黄素能增加细胞内羟脯氨酸含量,促进OPGmRNA的表达。结论　大黄素可促进成骨细胞分化,增加OPGmRNA的表达。     

Proteinase‐activated receptor‐2 (PAR2) and mouse osteoblasts: Regulation of cell function and lack of specificity of PAR2‐activating peptides

1. Using synthetic proteinase‐activated receptor‐2 (PAR₂)‐activating peptides (PAR₂APs) corresponding to the tethered ligand domain of the extracellular N‐terminus of PAR₂ to mimic the actions of activating proteinases and using primary cultures of calvarial osteoblasts derived from both wild‐type (WT) and PAR₂‐null (KO) mice, we investigated the potential role of PAR₂ in regulating osteoblast function. 2. Primary calvarial osteoblasts from WT and KO mice were evaluated for their growth kinetics and mineralization in the absence of PAR₂ agonists and for their responses in a variety of functional assays to the PAR₂APs Ser‐Leu‐Ile‐Gly‐Arg‐Leu‐amide (SLIGRL‐NH₂) and 2‐furoyl‐Leu‐Ile‐Gly‐Arg‐Leu‐Orn‐amide (2‐fLIGRLO‐NH₂), as well as to trypsin. 3. In contrast with WT cells, PAR₂‐KO osteoblasts did not exhibit increased collagen Type I mRNA expression in response to SLIGRL‐NH₂. When grown in serum‐containing medium, KO cells increased in number more rapidly than WT cells, an effect that could be attributed to decreased apoptosis rather than increased proliferation. Surprisingly, in both WT and KO osteoblasts, the two PAR₂APs induced mobilization of intracellular calcium stores. Similarly, the PAR₂APs inhibited serum deprivation‐induced apoptosis and parathyroid hormone‐, 1,25‐dihydroxyvitamin D₃‐ or interleukin‐11‐induced mineralization in WT and KO cells. 4. We conclude that PAR₂ plays a role in osteoblast survival and collagen Type I mRNA induction and that osteoblasts can respond to the PAR₂APs via both PAR₂‐dependent and ‐independent mechanisms.     

降脂壮骨方剂含药血清对大鼠骨髓基质细胞骨形态发生蛋白-2表达的影响

目的研究高胆固醇血清以及降脂壮骨方剂含药血清干预下大鼠骨髓基质细胞骨形态发生蛋白-2（BMP-2）表达的变化。方法取成年大鼠股骨,用密度梯度离心方法分离大鼠骨髓基质细胞,原代培养细胞至第三代,并用流式细胞仪进行细胞鉴定。选取第三代细胞,随机分为三组。A组正常血清对照组：2％空白血清（体积比）;B组高胆固醇血清损伤组：终浓度为4mmol／L高胆固醇血清;C组中药血清预处理＋高胆固醇血清损伤组：2％中药血清（体积比）预处理2h后＋终浓度为4mmol／L高胆固醇血清。回收细胞提取总RNA,检测BMP-2表达变化,并进行统计学分析。结果与空白血清对照组相比,高胆固醇血清损伤组骨髓基质细胞增殖受抑制;BMP-2的mRNA表达水平降低（P〈0．01）。与高胆固醇血清损伤组相比,中药血清预处理＋高胆固醇血清损伤组骨髓基质细胞生长状态明显改善,BMP-2的mRNA表达水平增高（P〈0．01）。结论降脂壮骨方剂含药血清可以增强高胆固醇血清环境下骨髓基质细胞BMP-2、雌激素受体（ER）,明显改善骨髓基质细胞生长状态,有利于骨质疏松症的治疗。     

壳聚糖修饰后的纳米羟基磷灰石作为BMP-2输送载体转染细胞的研究

目的：研究羟基磷灰石（hydroxyapatite,HA）纳米粒载体经壳聚糖（chitosan,CS）修饰后介导骨形态发生蛋白2（Bone morphogenetic protein2,BMP2）基因转染成骨细胞后的表达及表达产物对成骨细胞的影响。方法：用壳聚糖对羟基磷灰石纳米粒进行表面修饰;复苏成骨细胞株并进行传代培养,采用HA-CS纳米粒载体转染技术,将BMP-2目的基因导入成骨细胞,RT-PCR法鉴定BMP-2的整合和表达;检测细胞中碱性磷酸酶（alkaline phoaphatase,ALP）及骨钙素（osteocalcin,OCN）活性。结果：RT-PCR结果显示BMP-2基因在成骨细胞中稳定表达,而且表达产物增加了成骨细胞中碱性磷酸酶及骨钙素活性。结论：HA-CS纳米粒作为输送载体可以安全地将目的基因BMP-2导入成骨细胞中并稳定表达,同时增加了成骨细胞的生物学活性。