HCN4在缺血诱导乳兔窦房结细胞损伤中的作用

目的:观察乳兔窦房结细胞在缺血条件下HCN4的表达变化及其对窦房结功能及细胞凋亡的影响。方法:将原代培养的乳兔窦房结细胞分为正常对照组和模拟单纯缺血组(缺血1h、3h、6h);采用RT-PCR和Western blot法检测细胞中HCN1-4的表达;采用细胞免疫荧光方法检测窦房结细胞内HCN4蛋白的亚细胞分布;采用RT-qPCR检测Bax和Bcl-2的表达;采用全细胞膜片钳记录单个窦房结细胞的If电流,并运用HCN通道抑制剂伊伐布雷定观察抑制HCN4对乳兔窦房结细胞电活动的影响。结果:原代乳兔窦房结细胞主要表达HCN4,少量表达HCN1和HCN2,HCN3 mRNA未检出,Western blot仅检测出HCN4,未检测出HCN1、HCN2、HCN3的蛋白水平,HCN4蛋白广泛分布于细胞质内;膜片钳可记录到单一窦房结细胞自发起搏电流,伊伐布雷定可通过特异性的降低窦房结舒张期去极化速率来延缓自发活动,伊伐布雷定可持续抑制窦房结细胞的If电流产生,使If明显减小;与正常对照组相比,随着缺血时间的延长(1h、3h、6h),HCN4mRNA表达及蛋白水平逐渐减少,同时Bax mRNA表达及蛋白水平明显上调,Bcl-2mRNA表达及蛋白水平明显下降;急性缺血处理显著抑制了窦房结细胞的电活动,与正常对照组相比,随着时间的延长,窦房结细胞的起搏电流If也逐渐减少。结论:HCN4蛋白参与调控乳兔窦房结细胞的起搏功能。急性缺血可引起窦房结细胞凋亡,导致HCN4的表达下降,使得通道If电流密度减少导致窦房结功能障碍。     

兔窦房结HCN2通道蛋白表达的不均一性和增龄性变化

目的检测窦房结起搏电流(If)基因HCN2通道蛋白在窦房结增龄性中的变化,探讨病态窦房结综合征的病因及发病机制。方法采用SABC-FITC技术,利用激光共聚焦显微镜测定幼年兔组(1~2周龄)、成年兔组(5~6月龄)和老年兔组(40~70月龄)窦房结组织不同区域HCN2通道蛋白荧光强度。结果光镜下,幼年兔组的窦房结组织细胞最密集,成年兔次之,老年兔最少,老年兔有细胞核固缩、裂解现象,幼年组、成年组和老年组细胞数分别为:26.40±3.27,15.60±2.88,11.10±1.91,其中两两比较,差异有统计学意义;幼年、成年和老年3个年龄组的兔窦房结组织的HCN2通道蛋白荧光强度在外周区与中心区差异有统计学意义;在SAN各区域,幼年组的HCN2通道蛋白荧光强度均高于成年组和老年组(幼年组与成年组:中心区60.10±12.82对43.87±9.95,交界区66.48±14.38对51.55±10.80,外周区79.49±18.63对53.52±9.16,P<0.01;幼年组与老年组:中心区60.10±12.82对33.72±3.25,交界区66.48±14.38对40.08±4.17,外周区79.49±18.63对46.58±7.59,P<0.01)。结论兔窦房结组织细胞数随年龄增加而逐渐减少,并且在老年兔组出现核固缩、裂解现象;兔窦房结表达的HCN2通道蛋白具有不均一性;随着年龄增长,兔窦房结组织各区域表达的HCN2通道均逐渐降低。     

大鼠窦房结功能及其HCN4通道蛋白表达的增龄性变化

目的 观察幼年、成年、老年SD大鼠窦房结功能及HCN4通道蛋白表达的增龄变化,探讨窦房结电生理重构的分子基础.方法 大鼠麻醉后测基础心率、用食管电极测量窦房结恢复时间(SNRT)、校正的窦房结恢复时间(CSNRT)、以及窦房传导时间(SACT),最后测量固有心率(IHR).用SABC-FITC免疫组化法染色测量大鼠窦房结HCN4通道蛋白荧光强度.结果 窦房结功能测定显示,大鼠基础心率及IHR随年龄的增加呈明显减慢趋势,大鼠SACT随年龄增长延长,大鼠SNRT和CSNRT在不同年龄段未发现显著差异.窦房结HCN4通道蛋白荧光强度随年龄增长呈减弱趋势.结论 窦房结HCN4通道蛋白表达增龄性减低可能是构成窦房结功能增龄减退的电生理分子基础之一.     

伊伐布雷定对慢性心衰伴室性心率失常兔模型HCN通道的影响

目的 观察伊伐布雷定对慢性心衰伴室性心率失常兔模型超级化激活环核苷酸门控阳离子通道（HCN）的影响。方法 纳入由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供的80只健康成年大白兔为研究对象，随机分为正常对照组（20只，予以0.9%生理盐水）和慢性心衰组（60只，经耳缘静注异丙肾上腺素0.3mg/kg&#183;d）。待慢性心衰组造模满意后将BW-200生理无线遥测心电系统芯片植入兔皮下，将其分为模型组（30只，0.9%生理盐水，洗胃，持续2周）和伊伐布雷定组（30只，伊伐布雷定7mg/kg&#183;d，持续2周）。分别于起搏前（0周）、起搏4周、6周（药物干预2周后），观察四组心率（HR）、左心室舒张末期内径（LVEDd）、左心室收缩末期内径（LVESd）、左室射血分数（LVEF）、心室有效不应期（ERP）、ERP 离散度（dERP）、室性心律失常（VA）诱发率、心室颤动阈值（VFT）变化，并分析HCN2、HCN4通道表达水平。结果 起搏4、6周后， 慢性心衰组HR、LVEDd、LVESd、ERP、dERP、VA诱发率均显著高于起搏前及正常对照组（P＜0.05），LVEF显著低于起搏前及正常对照组（P＜0.05）；其中，起搏4周后，伊伐布雷定组HR、LVEDd、LVESd、LVEF、ERP、dERP、VFT较模型组均无统计学意义（P＞0.05）；起搏6周后，伊伐布雷定组HR、LVEDd、ERP、VA诱发率显著低于模型组（P＜0.05），VFT显著高于模型组（P＜0.05），但LVESd、LVEF、dERP较模型组均无统计学意义（P＞0.05）。慢性心衰组HCN2通道和HCN4通道的mRNA、microRNA-1、microRNA-133及蛋白表达水平均显著高于正常对照组（P＜0.05）；其中，伊伐布雷定组上述指标均显著低于模型组（P＜0.05）。结论 伊伐布雷定能有效降低慢性心衰兔心率，缩短ERP值，诱导慢性心衰兔室性心律失常诱发率下降，改善心室颤动阈值，并降低慢性心衰兔心室肌HCN2通道和HCN4通道表达水平，有助于指导慢性心衰伴室性心率失常临床治疗。     

缬沙坦对心力衰竭家兔心肌细胞核及肌浆网钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ的影响

【】目的 探讨家兔慢性心力衰竭(心衰)时心肌细胞核及肌浆网钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)蛋白表达及活性的改变及血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂缬沙坦长期干预的意义。方法 24只家兔随机分为3组,假手术组、心衰组和缬沙坦组各8只,通过超容量负荷联合压力负荷建立家兔心衰模型,于术后7周观察左心室结构、血流动力学的变化及CaMKⅡ的表达和活性的改变。结果 与假手术组比较,心衰组左心室重量指数(LVMI)、左心室舒张末压(LVEDP)显著升高(P<0.05),左心室缩短率(LVFS)及左室射血分数(LVEF)明显降低(P<0.05);与心衰组比较,缬沙坦组LVMI、LVEDP显著降低(P<0.05),LVFS及LVEF明显升高(P<0.05)；心衰组细胞核及肌浆网CaMKⅡ蛋白表达及活性显著高于假手术组 (P<0.05)；缬沙坦组细胞核及肌浆网CaMKⅡ蛋白表达及活性显著低于心衰组(P<0.05)。结论 缬沙坦长期干预心力衰竭,能够改善心脏舒缩功能,可能与其降低细胞核及肌浆网CaMKⅡ蛋白表达及活性有关。     

细胞接触诱导骨髓间充质干细胞获得窦房结细胞表型的初步研究

目的 通过建立体外骨髓间充质干细胞(BMSCs)与纯化培养的乳鼠窦房结细胞共培养体系,探讨窦房结微环境对BMSCs分化的诱导作用.方法 自新生乳鼠的心脏分离窦房结细胞,并差速贴壁纯化培养,免疫荧光检测超极化激活环核苷酸门控阳离子通道基因4(HCN4)和缝隙连接蛋白45(Cx45)的表达.自成年大鼠的骨髓分离BMSCs,传2代后,用脂质体介导pEGFP-N1转染标记BMSCs,再与纯化培养的窦房结细胞以1:5比例进行直接接触共培养,并用窦房结细胞条件培养液对转染后的BMSCs进行培养作为对照.1周后应用免疫荧光检测BMSCs的HCN4和Cx45表达.结果 接触共培养组中,可见部分表达绿色荧光蛋白的BMSCs同时表达HCN4和Cx45,而条件液培养组中未见HCN4和Cx45的表达.结论 直接接触共培养体系可诱导BMSCs初步分化为窦房结样细胞.     

小凹蛋白-1与内皮型一氧化氮合成酶活性变化在大鼠门静脉高压形成中的作用

目的 探讨肝硬化发生发展过程中小凹蛋白-1的动态变化及与其肝纤维化程度、门静脉压力的关系,探讨小凹蛋白-1对内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)作用的可能调控机制.方法 构建二甲基亚硝胺致肝硬化大鼠模型,分别在造模后的1、2、3、4、6周,病理组织学观察肝纤维化程度及测定门静脉压力(PVP),放射强度测定法检测肝硬化组织中eNOS活性,免疫沉淀与Western blot检测小凹蛋白-1和eNOS蛋白变化及其相互作用.结果 造模过程中肝纤维化程度逐渐加重,至第4周已形成典型的肝硬化,其后逐渐减轻;免疫沉淀与Western blot实验结果表明eNOS和小凹蛋白-1可免疫共沉淀,且小凹蛋白-1与eNOS的结合可随造模时间延长而增加;小凹蛋白-1表达与肝纤维化程度、PVP呈显著正相关(r=0.967,P＜0.01;r=0.922,P＜0.01);NOS与肝纤维化程度、PVP呈显著负相关(r=-0.973,P＜0.01;r=-0.947,P＜0.01).结论 小凹蛋白-1作为eNOS的一个负调控因子,参与肝硬化门静脉高压的形成.     

体内外获取心脏起搏细胞的方法学探讨

目的:体外诱导人诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPS)分化为心脏起搏细胞,体内解剖精确定位获得兔窦房结组织,进而直接获得心脏起搏细胞。方法:体外Cellapy法高效诱导人iPS细胞分化为心肌细胞和心脏起搏细胞,肉眼观察心脏起搏细胞形态及起搏频率,免疫荧光检测人iPS源性心脏起搏细胞中特异性标志物HCN4阳性比例。体内解剖精确定位获得兔心脏起搏细胞后,应用qRT-PCR及免疫印迹法检测兔心脏起搏细胞HCN4mRNA及蛋白表达水平。结果:运用Cellapy方法成功将人iPS细胞诱导分化为具有自发跳动特性的心脏起搏细胞,显微摄像记录显示心脏起搏细胞搏动频率为(70.60±2.71)次/min,且细胞形态以梭型为主;免疫荧光显示人iPS源性心脏起搏细胞中HCN4蛋白阳性细胞占(9.42±1.57)%。同时,qRT-PCR及Western blot结果显示兔窦房结组织中心脏起搏细胞HCN4表达明显高于心房肌和心室肌(P0.01)。结论:体外Cellapy诱导法和动物体内解剖精确定位是获得心脏起搏细胞的两种有效方法。这为研究病态窦房结综合征的发病机制提供了可靠的细胞来源,同时为病态窦房结综合征的治疗提供了移植细胞。     

小凹蛋白1对氧化型低密度脂蛋白诱导RAW 264.7巨噬细胞衰老的影响

目的探讨小凹蛋白1(caveolin-1)对氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)诱导RAW 264.7细胞衰老的影响及可能机制。方法不同浓度oxLDL(0、20、40、80和120μg/ml)诱导RAW 264.7细胞衰老,依次为A、B、C、D和E组,检测细胞中caveolin-1的变化。通过RNA干扰(siRNA)的方式下调细胞caveolin-1表达,分为oxLDL组、质粒对照组、siRNA组和无血清对照组,观察oxLDL(60μg/ml)诱导的RAW 264.7细胞衰老的影响,同时Western blot检测p47phox在膜蛋白中的表达,细胞上清液中丙二醛含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果 C、D和E组较A组细胞衰老阳性率增加(P0.05),同时caveolin-1表达增加,与p47phox表达增加一致,与oxLDL组比较,siRNA组细胞衰老活性率减少(P0.05),细胞膜p47phox表达下降,细胞上清液丙二醛含量明显下降[(7.12±1.26)nmol/ml vs(11.97±1.78)nmol/ml,P0.05],SOD活性明显增加[(79.98±3.94)U/ml vs(50.03±6.57)U/ml,P0.05]。结论 caveolin-1可能通过氧化应激影响oxLDL诱导巨噬细胞的衰老过程,从而影响衰老相关性动脉粥样硬化过程。     

兔窦房结组织急性损伤后缝隙连接蛋白CX45 CX43表达的研究

目的 :研究兔窦房结组织急性损伤后缝隙连接蛋白CX4 5、CX4 3表达的动态变化规律。方法 :用 2 0 %甲醛湿敷兔窦房结区 ,建立窦房结组织急性损伤模型。分别于模型建立后 2h ,1周 ,2周 ,3周和 4周取窦房结组织 ,用免疫组织化学SP法检测CX4 5和CX4 3的表达。结果 :CX4 5主要在窦房结中心区表达 ,表达的CX4 5呈点状、短线状 ,形状不规则 ,分布稀疏 ;CX4 3在窦房结中心无表达 ,而表达于窦房结周边区心房肌细胞 ,呈条状、链状 ,分布于心房肌闰盘处。各实验组窦房结细胞CX4 5表达量均较对照组明显减少 (P <0. 0 5 ) ,且随观察时间的延长CX4 5表达量逐渐减少。结论 :兔窦房结细胞表达CX4 5 ,而无CX4 3的表达。窦房结组织急性损伤后CX4 5的表达量明显减少。