复方鳖甲软肝方药物血清对大鼠肝星形细胞内TβRⅠ和Smad-3蛋白表达的影响实验研究

目的观察复方鳖甲软肝方药物血清对大鼠肝星形细胞(HSCs)内TβRⅠ和Smad3蛋白表达的影响,从信号转导上游受体水平和受体后信号转导水平探讨药物血清抗肝纤维化的作用机制。方法运用免疫细胞化学和图像分析技术,在离体对不同时相,不同浓度复方鳖甲软肝方药物血清干预状态下,HSC内TβRⅠ和Smad3蛋白的表达进行半定量分析。结果复方鳖甲软肝方药物血清可明显下调HSC表达TβRⅠ及抑制HSC表达Smad3蛋白。结论复方鳖甲软肝方药物血清通过下调TβRⅠ的表达,进而干预Smad3介导的TGF-β1在HSC内的信号转导,最终抑制胶原蛋白、纤黏连蛋白的合成,从而达到抑制HSC活化的抗肝纤维化作用,这可能是复方鳖甲软肝方药物血清抗肝纤维化作用机制之一。     

复方鳖甲软肝方药理血清对离体肝星形细胞增殖的影响

目的：复方鳖甲软肝方在临床上对肝纤维化的疗效已得到确认，但其作用机理尚未完全阐明。本实验从离体的角度观察复方鳖甲软肝方药理血清对SD大鼠离体肝星形细胞(HSC)增殖的影响，以探讨其抗肝纤维化的作用机制。方法：将60只健康SD雄性大鼠(体重250g左右)分成正常组、模型组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组12只；无菌条件下腹主动脉取血，     

复方鳖甲软肝方药理血清对离体肝星形细胞NF-κB活化的影响

目的：肝星形细胞(HSC)中NF-κB活化与肝纤维化密切相关，本实验从离体的角度观察复方鳖甲软肝方药理血清对SD大鼠离体肝星形细胞中NF-κB活化的影响，以探讨复方鳖甲软肝方防治肝纤维化的作用机制。方法：将60只健康SD雄性大鼠(体重250g左右)分成正常组、模型组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，     

复方鳖甲软肝方药理血清对离体肝星形细胞的细胞外基质的影响

目的：本实验从离体的角度观察复方鳖甲软肝方药理血清对SD大鼠离体肝星形细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原、TIMP表达的影响，以探讨其抗肝纤维化的作用机制。方法：将60只健康SD雄性大鼠(体重250g左右)分成正常组、模型组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组12只；无菌条件下腹主动脉取血，制备血清，加至培养有SD大鼠肝星形细胞的24孔板中，     

肝纤维化启动期大鼠血清对肝星形细胞TGF-β1表达的影响

目的　研究大鼠血清与肝星形细胞表达 TGF- β1的关系 ,为临床的早期诊断和中医药治疗肝纤维化提供新的思路。　方法　制备正常大鼠血清、免疫性肝纤维化大鼠血清和益气活血复方药物血清 ,培养肝星形细胞(HSC) ,激光共聚焦显微镜定量分析其 TGF- β1的表达。　结果　 (1)造模 3周时大鼠血清使培养的 HSC中 TGF- β1表达显著增强 ,正常鼠血清、造模 5周和 7周 (即纤维化形成后 )血清没有此作用 ;(2 )添加益气活血药物血清可使造模 3周鼠血清刺激 HSC高水平表达的 TGF- β1作用消失。　结论　 (1)造模 3周鼠血清中含有强烈的刺激 HSC激活的物质 ;(2 )活血化淤方剂的作用靶点是血液中的活性物质 ,通过拮抗血液中 HSC活化物质达到抗纤维化的作用     

大鼠含抗肝纤维化中药的血清对肝星状细胞的作用

目的：观察抗肝纤维化中药复方“肝纤方”(本单位自拟科研方)对体外培养的大鼠肝星状细胞(HSC)增殖及其胶原合成的影响, 并探讨中药抗肝纤维化研究中的一些血清药理学实验方法。方法： 以16倍、8倍、4倍成人剂量肝纤方水煎液给大鼠灌胃, 于0.5、1、2、4 h后制备两类血清－门静脉血清和下腔静脉血清, 将之作用于从SD大鼠肝脏分离培养的HSC, 以[³H]TdR和[³H]Pro同位素掺入试验测定其对HSC增殖、胶原合成量的影响。结果：灌胃0.5、1、2 h后制备的门静脉和下腔静脉含药血清均能减少[3H]TdR的掺入量(P<0.05);以16倍和8倍成人剂量灌胃制得含药血清的作用强于4倍者(P＜0.05), 但前二者间无明显差异(P＞0.05);灌胃给药后1h制得的含药血清作用最强(P＜0.05)。门静脉含药血清亦能减少[³H]Pro的掺入量, 情况类似于上述对[3H]TdR的作用(P＜0.05);但下腔静脉含药血清无此作用(P＞0.05)。结论： 肝纤方能抑制HSC增殖、减少其胶原合成, 可能是其抗肝纤维化的一些具体作用。     

逆转录病毒介导的反义c-myb对肝星状细胞增殖及Ⅰ型胶原基因表达的影响

目的:探讨反义c-mybRNA对体外培养的肝星状细胞(HSC)增殖及Ⅰ型胶原mRNA表达的影响。方法:构建含有反向c-myb基因片段的重组逆转录病毒载体pDOR-myb, 将其导入包装细胞PA317中, 收获含病毒的培养上清, 进一步感染体外培养的大鼠HSC, 采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定细胞增殖反应, 采用半定量RT-PCR检测c-myb、α₁-Ⅰ型胶原mRNA表达。结果:成功分离培养大鼠HSC, 感染pDOR-myb病毒的HSC自身c-myb表达、细胞增殖及α-Ⅰ型胶原mRNA表达显著受抑。结论:c-myb在HSC激活增殖过程中起重要作用, 反义c-myb基因能抑制HSC增殖及Ⅰ型胶原基因表达, 这提示抑制c-myb表达可能是防治肝纤维化的有效途径。     

自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤对肝星状细胞增殖活化的影响

目的 观察自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)对大鼠肝星状细胞(HSC-T6)增殖活化的影响,并探讨其作用机制.方法 体外培养大鼠肝星状细胞株HSC-T6,设立空白对照组和3-MA低剂量组(2.5 mmol/L)、中剂量组(5 mmol/L)、高剂量组(10 mmol/L).RT-PCR分析不同浓度3-MA对HSC活化标志蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)以及Ⅰ型胶原蛋白基因表达的影响,Western blot法检测不同浓度3-MA对HSC中自噬水平标志蛋白LC3Ⅱ、α-SMA以及Ⅰ型胶原蛋白表达水平的影响;MTT法检测3-MA对HSC增殖的影响,流式细胞术分析3-MA对HSC细胞周期的影响.结果 低、中、高剂量3-MA作用于HSC后,HSC-T6细胞自噬水平随3-MA浓度升高逐渐下降,α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白mRNA相对表达量均明显低于对照组(P＜0.05),LC3Ⅱ、α-SMA以及Ⅰ型胶原蛋白相对表达量均明显低于对照组(P＜0.05).与对照组相比,低、中、高剂量时3-MA对HSC增殖的影响均显著下降(P＜0.05),G2期比例与对照组比较均明显增加(P＜0.05).结论 3-MA可下调大鼠HSC-T6细胞LC3Ⅱ的表达,抑制α-SMA及Ⅰ型胶原蛋白mRNA及蛋白的表达,使HSC-T6细胞周期停滞于G2期,抑制HSC增殖活化.     

黏着斑激酶反义寡核苷酸对肝星状细胞增殖及活化的影响

黏着斑激酶(Focal adhesion kinase,FAK)在肝星状细胞(Hepatic stellate cells,HSC)的激活过程中起重要作用.本文旨在研究FAK反义寡核苷酸(FAK antisense oligonucleotides,FAK-ASON)能否抑制体外培养的大鼠肝星状细胞的增殖及活化.用链霉蛋白酶-胶原酶原位灌注、Nycodenz密度梯度离心法分离大鼠HSC,并在体外培养使其激活后,将FAK-ASON转染至活化的HSC.应用MTT法观察HSC细胞增殖的变化,并用RT-PCR、Western blot观察HSC活化的标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表达的变化.MTT结果显示FAK-ASON可明显抑制活化HSC的增殖;FAK-ASON处理48 h后,HSC α-SMA mRNA及蛋白的表达亦明显下降.结果进一步提示FAK在HSC激活过程中的作用,而FAK-ASON有可能成为潜在的抗肝纤维化治疗药物.     

P型铜转运ATP酶和增殖细胞核抗原在大、小鼠肝的表达

目的:研究P型铜转运ATP酶(ATP7B)与增殖细胞核抗原(PCNA)在大鼠和小鼠肝组织中的表达.方法:采用免疫组织化学法检测肝中ATP7B与PCNA的表达.结果:ATP7B在大鼠和小鼠的肝细胞质表达,表达较广泛.肝细胞PCNA的表达强弱不一,强阳性细胞较少,大鼠和小鼠肝的ATP7B和PCNA积分光密度间的差异均无统计学意义;在大鼠或小鼠肝,ATP7B与PCNA的免疫反应阳性物积分光密度间无显著相关性.结论:ATP7B和PCNA在大鼠和小鼠肝组织均有表达,表达的关联性不明显.     

熟地鳖甲与系膜细胞协同上调成骨细胞骨钙素基因及蛋白表达**☆◆

背景：熟地鳖甲含药血清可上调成骨细胞骨钙素基因表达,系膜细胞上清液亦可促进成骨细胞该基因的表达。 目的：验证熟地鳖甲含药血清与系膜细胞上清液对成骨细胞骨钙素基因及蛋白表达的影响是否有叠加作用。 方法：原代培养经鉴定的SD大鼠成骨细胞分为4组培养：①空白对照组含空白血清培养液。②含药血清组含熟地鳖甲含药血清培养液。③无药系膜组含空白血清培养液+空白系膜细胞上清。④含药系膜组含熟地鳖甲血清培养液+含药系膜细胞上清液。6 d后收集培养液,并与3 d所收集的培养液混匀进行检测。 结果与结论：与空白对照组比较,含药血清组、无药系膜组、含药系膜组骨钙素mRNA表达率明显上调(P < 0.05),含药系膜组骨钙素mRNA表达率明显高于含药血清组或无药系膜组。含药系膜组成骨细胞骨钙素浓度/MTT A值明显高于空白对照组(P < 0.05)。与含药血清组比较,含药系膜组成骨细胞骨钙素浓度/MTT A值明显升高(P < 0.05)。提示系膜细胞上清液及含药血清可上调成骨细胞骨钙素基因表达,二者共同作用进一步上调骨钙素基因的表达量,此时骨钙素分泌量亦明显增加。      

骨髓间质干细胞抑制肝星状细胞增殖与活化的体外研究

目的：探讨骨髓间质干细胞（MSCs）对活化态肝星状细胞（HSCs）增殖的影响。 方法： 分别从骨髓和肝脏分离纯化培养大鼠MSCs及HSCs，塑料板传代培养激活HSCs；在半透膜（transwell insert）上接种MSCs，在6孔塑料培养板上接种HSCs，建立上下双层细胞共培养体系；大鼠正常肝细胞系（BRLs）及HSCs培养分别作为对照。免疫细胞化学检测平滑肌激动蛋白（α-SMA）与结蛋白的表达，IBAS 2.5软件分析阳性染色表达量。 结果： HSCs与MSCs共培养24 h，HSCs表现轻度增殖抑制，随着培养时间延长，HSCs增殖活性受抑制更明显，在48 h和72 h的抑制率分别达15.7%与30.3%，与BRLs共培养体系比较有显著差异；与MSCs共培养72 h, HSCs表达α-SMA量明显低于两个对照组BRLs及HSCs培养体系（50.2% vs 90.2%、95.6%, P＜0.01）；而结蛋白表达的量在3组共培养体系中均无显著差异。 结论： MSCs具有分泌细胞因子抑制HSCs增殖活性的潜能,在治疗肝纤维化中可能发挥作用。     

肝细胞生长因子在肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体作用下对原代肝星状细胞增殖及凋亡的影响**☆

背景：活化的肝星状细胞是肝纤维化的关键因素,研究表明肝细胞生长因子能促进星状细胞凋亡,其具体机制可能与增强肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导星状细胞凋亡有关。 目的：观察肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体作用下,肝细胞生长因子对原代肝星状细胞增殖、凋亡的影响并初步探讨其可能机制。 方法：将SD大鼠原代肝星状细胞复苏、传代,细胞增殖明显时用于实验。实验分为4组：空白对照组为单纯肝星状细胞培养;肝细胞生长因子组：将100 μg/L肝细胞生长因子作用于肝星状细胞;TRAIL组：将2 mg/L的TRAIL作用于肝星状细胞;肝细胞生长因子+TRAIL组：将肝细胞生长因子预先刺激肝星状细胞24 h,再加入2 mg/L TRAIL。 结果与结论：MTT检测显示肝细胞生长因子及TRAIL分别在50~200 μg/L、0.5~1.5 mg/L各浓度下对肝星状细胞增殖抑制率无影响,TRAIL在2 mg/L作用下对肝星状细胞有抑制作用。流式细胞仪检测肝细胞生长因子+TRAIL组的中晚期凋亡率明显高于空白对照组及肝细胞生长因子组(P < 0.05);肝细胞生长因子+TRAIL组DR5荧光强度明显高于其他3组(P < 0.01)。提示在TRAIL作用下,肝细胞生长因子能促进肝星状细胞的凋亡、抑制其增殖。可能与肝细胞生长因子上调活化肝星状细胞表面DR5表达有关。      

辣椒素抑制大鼠肝纤维化的实验研究

 目的：探讨辣椒素（capsaicin）对大鼠肝星状细胞（hepatic stellate cells, HSCs）活性的影响及其对实验性肝纤维化的治疗作用。方法：DCFH-DA法检测辣椒素对HSCs中活性氧的影响;CCK-8法检测辣椒素对HSCs增殖的影响;Western blotting检测HSCs α-平滑肌肌动蛋白的表达;RT-PCR检测辣椒素对HSCs纤维化相关基因表达的影响;流式细胞术检测辣椒素对HSCs凋亡的影响;通过腹腔注射四氯化碳建立鼠肝纤维化模型,经腹腔输注辣椒素,检测肝组织病理切片,观察肝纤维化指标的变化。结果：与对照组比较,辣椒素抑制了HSCs中活性氧的产生,明显抑制了HSCs的活化与增殖(P<0.05),促进了HSCs的凋亡(P<0.05),降低了金属蛋白酶组织抑制物1及转化生长因子β 1的表达(P<0.05),降低了肝羟脯氨酸含量及血清Ⅲ型胶原和透明质酸水平(P<005)。结论：辣椒素抑制HSCs增殖、活化并诱导其凋亡。辣椒素对实验性肝纤维化具有一定的抑制作用。     

Wortmannin对离体肝星状细胞增殖的影响

目的观察Wortmannin对肝星状细胞增殖的影响,并探讨其作用的可能机制。方法用链酶蛋白酶和胶原酶原位灌流消化正常大鼠肝脏,Nycodenz密度梯度离心分离肝星状细胞,以流式细胞仪检测细胞周期,MTT比色法观察Wortman-nin对肝星状细胞增殖的影响。结果在20～60nmol/L浓度范围内,Wortmannin能剂量依赖性地抑制肝星状细胞增殖;可使G0/G1期细胞增多,S期细胞减少。结论Wortmannin可显著抑制肝星状细胞增殖,使肝星状细胞阻滞于G0/G1期,该作用可能是Wortmannin抗肝纤维化的机制之一。     

雌激素对血管平滑肌细胞中c-fos和增殖细胞核抗原表达的影响

目的：研究并比较雌激素和／或血清对血管平滑肌细胞(VSMC)中c-fos和增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响。方法：分别在有或无他莫昔芬(TAM)(雌激素受体ER拮抗剂)预处理的情况下，采用免疫细胞化学和图像分析方法，研究雌二醇(E2)和/或新生小牛血清(NCS)对传代大鼠VSMC中的c-fos和PCNA蛋白表达的影响。结果：E2以及NCS均能上调细胞中c-fos和PCNA蛋白的表达，TAM能阻断其效应。结论：雌激素能促进传代VSMC增生，ER介导其作用。     

脂肪特异性蛋白27对大鼠肝星状细胞活化的影响

 目的：探讨脂肪特异性蛋白27（Fsp27）对肝星状细胞（HSCs）增殖和活化的影响及其对纤维化相关蛋白的调节作用。方法：从SD大鼠肝脏提取HSCs并培养,采用实时荧光定量PCR、免疫荧光染色和Western blotting检测原代HSCs和活化HSCs中Fsp27 mRNA和蛋白的表达。构建携带Fsp27基因的慢病毒,转染活化的HSCs并继续培养72 h,通过CCK-8比色法检测Fsp27对HSCs增殖的影响;Western blotting检测HSCs中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达,了解HSCs的活化状态;实时荧光定量PCR检测Fsp27对HSCs中纤维化相关蛋白［包括基质金属蛋白酶2（MMP-2）、金属蛋白酶组织抑制物1（TIMP-1）和转化生长因子β1（TGF-β1）］ mRNA表达的影响。结果：成功分离大鼠原代HSCs。Fsp27在原代HSCs和活化HSCs中的表达差异显著（P<0.01）;活化HSCs成功转染携带Fsp27基因的慢病毒后继续培养72 h,与对照组比较,HSCs的活化与增殖被明显抑制（P<0.05）;Fsp27促进MMP-2 mRNA的表达（P<0.05）,降低TIMP-1和TGF-β1 mRNA的表达（P<0.05）。结论：Fsp27可抑制HSCs的增殖和活化,并调节纤维化相关蛋白的表达。Fsp27的作用可能与其维持HSCs静息状态细胞表型有关。     

PDGF-B反义寡脱氧核苷酸对大鼠肝星状细胞增殖及Ⅰ型胶原合成的影响

目的：探讨PDGF-B反义寡脱氧核苷酸(ASODN)对大鼠肝星状细胞（HSCs）增殖及Ⅰ型胶原合成的影响。方法：合成了特异性的PDGF-B硫代磷酸ASODN及其对照错义寡脱氧核苷酸(MSODN)，并将其加入至培养的HSCs。采用MTT法检测PDGF-B ASODN对HSCs的增殖抑制作用，RT-PCR检测PDGF-B和collagen-Ⅰ mRNA的表达，流式细胞仪与ELISA法分别检测PDGF-B的表达和Ⅰ型胶原的合成。 结果：PDGF-B ASODN在终浓度为10 μmol/L，作用HSCs-T6细胞48 h时，能明显地抑制其增殖，降低PDGF-B和collagen-ⅠmRNA的表达；FCM与ELISA分析表明，HSCs表达PDGF-B和合成Ⅰ型胶原都明显低于对照组，而对照组寡脱氧核苷酸在相同浓度下未见抑制效应。结论：PDGF-B ASODN可以抑制HSCs的增殖、Ⅰ型胶原的合成、内源性PDGF-B的表达，可能成为一种有用的抗肝纤维化基因治疗的药物。