手足口病病原体实时荧光RT-PCR反应体系的建立与临床应用

目的 建立一种快速、准确、特异件高的方法 检测手足口病病原体.方法 根据引起手足口病常见致病原肠道病毒71(EV71)、柯萨奇病毒A16(CA16)及肠道病毒(EV),设计相应的引物、探针对35例临床诊断的手足口病患儿及20例正常健康婴儿的粪便进行EV、EV71、CA16三种病原体实时荧光RT-PCR检测,同时对55分标本进行EV71病毒培养分离.结果 35例临床诊断手足口病患儿粪便中EV全部阳性,EV71阳性25例,CA16阳性8例,其中3例为EV71、CA16同时阳性,与临床诊断符合率为85.71%,20例健康体检婴儿粪便中EV病毒5例阳性,EV71、CA16均阴性.结论 荧光RT-PCR对手足口病病原体检测准确性高、特异性强,具有快速、廉价等特点,适合于手足口病的早期诊断.     

心肌损伤标志物在EV71感染重症手足口病诊治中的临床价值研究

目的研究分析EV-71感染重症手足口病患儿,尤其是神经源性肺水肿患儿的心肌损伤特征,探讨心肌损伤标志物对此类患儿病情监测、预后评估的意义。方法收集2012.5-2015.9入住我院感染科病房并接受治疗的手足口病患儿的临床资料,系统整理后进行回顾性分析。共71例患儿纳入分析,均由市级手足口病专家组确诊,均为静脉血EV71-Ig M(+)。分为3组:手足口病肺水肿组共17例,同时期的手足口病脑干脑炎组共21例、同时期的手足口病普通病毒性脑炎组共33例。年龄5月-7岁,平均1.80岁,其中男44例,女27例,男女之比为1.63:1。结果肺水肿组与脑干脑炎组浓度值比较,心肌损伤标志物的浓度值差异存在显著性(P0.01);肺水肿组的CKMB(肌酸激酶的同工酶)比起脑干脑炎组浓度值要明显升高,但差异没有显著性(P0.05)。肺水肿组与病毒性脑炎组浓度值比较、脑干脑炎组与病毒性脑炎组浓度值比较,心肌损伤标志物、CKMB的浓度值差异均存在显著性(P0.05)。17例肺水肿患儿死亡7例,放弃治疗5例,脑干脑炎组放弃治疗2例,二者死亡率差异存在显著性(χ2=15.06,P值0.01);而普通病毒性脑炎经治疗后基本好转出院。肺水肿组相较于脑干脑炎组、普通病毒性脑炎组,心肌损伤标志物浓度值均存在显著差异,预后也最差。结论心肌损伤标志物升高是手足口病患儿病情进展、预后评估的一项重要预警指标。伴有心肌损伤标志物、心肌酶学明显升高的手足口病患儿,更易出现顽固性休克、循环衰竭、甚至死亡。尤其是肌钙蛋白Ⅰ在正常值3倍以上者,应高度重视,及时救治。     

肠道病毒71型VP1及2A基因特征研究

目的 检测临床分离的肠道病毒71型(EV71)轻型、重型毒株VP1基因、2A基因的核苷酸序列,进行遗传进化途径分析.方法 将50份临床手足口病患者粪便标本处理后分离病毒,用EV71特异性引物进行RT-PCR扩增,获得EV71毒株,针对不同临床背景的标本,分别选取轻型、重型的毒株,用特异性引物分别对VP1基因及2A基因进行RT-PCR扩增,对其产物进行测序及遗传进化分析,并探讨它们之间的差别.结果 50份临床手足口病标本中有30份检测是EV71,其中轻型(手足口)13份,重型(手足口并发脑炎或心肌炎)17份.轻型和重型中各自选取5株对VP1基因和2A基因进行测序和遗传学分析,通过同源性比较和构建系统发生树发现,此10株EV71病毒和中国大陆已发表的5株EV71病毒(fuyangEU703814.1、xi_anHM003207.1、shandongEU753418.1、shenzhen-FJ607337.1、henanGU366191.1)全部属于C基因型,且核苷酸同源性较高,VP1基因和2A基因的同源性分别在94.7%～99.4%和93.6%～99.3%范围内.本次分离的10株EV71病毒与A、B基因型代表株比较,核苷酸同源性分别为81.0%～84.6%和78.4%～82.2%,差异较大.与已知的C1、C2、C3亚型代表株比较,核苷酸同源性在87.8%～90.2%,差异≥10%,与已知的C4亚型代表株比较,核苷酸同源性在96.8%～99.6%,因此认为可将这10株病毒划分为C4亚型.在系统发生树上,这10株病毒形成一个较独立的分支.结论 EV71 C4亚型病毒在中国大陆有较广泛的传播,且毒株之间VP1基因的遗传关系紧密;2A基因在轻型和重型病例毒株之间遗传差异不大.     

肠道病毒71型VP1及2A基因特征研究

目的 检测临床分离的肠道病毒71型(EV71)轻型、重型毒株VP1基因、2A基因的核苷酸序列,进行遗传进化途径分析.方法 将50份临床手足口病患者粪便标本处理后分离病毒,用EV71特异性引物进行RT-PCR扩增,获得EV71毒株,针对不同临床背景的标本,分别选取轻型、重型的毒株,用特异性引物分别对VP1基因及2A基因进行RT-PCR扩增,对其产物进行测序及遗传进化分析,并探讨它们之间的差别.结果 50份临床手足口病标本中有30份检测是EV71,其中轻型(手足口)13份,重型(手足口并发脑炎或心肌炎)17份.轻型和重型中各自选取5株对VP1基因和2A基因进行测序和遗传学分析,通过同源性比较和构建系统发生树发现,此10株EV71病毒和中国大陆已发表的5株EV71病毒(fuyangEU703814.1、xi_anHM003207.1、shandongEU753418.1、shenzhen-FJ607337.1、henanGU366191.1)全部属于C基因型,且核苷酸同源性较高,VP1基因和2A基因的同源性分别在94.7%～99.4%和93.6%～99.3%范围内.本次分离的10株EV71病毒与A、B基因型代表株比较,核苷酸同源性分别为81.0%～84.6%和78.4%～82.2%,差异较大.与已知的C1、C2、C3亚型代表株比较,核苷酸同源性在87.8%～90.2%,差异≥10%,与已知的C4亚型代表株比较,核苷酸同源性在96.8%～99.6%,因此认为可将这10株病毒划分为C4亚型.在系统发生树上,这10株病毒形成一个较独立的分支.结论 EV71 C4亚型病毒在中国大陆有较广泛的传播,且毒株之间VP1基因的遗传关系紧密;2A基因在轻型和重型病例毒株之间遗传差异不大.     

肠道病毒71致神经系统损害的研究进展

肠道病毒71(enterovirus type 71,EV71)属小RNA病毒科,1969年首先从美国加利福尼亚州1例死于脑炎的9月龄婴儿粪便中发现[1].其后,美国、澳大利亚、瑞典、日本、保加利亚、匈牙利、中国香港、马来西亚、新加坡等国家和地区均有EV71感染流行的报道.EV71感染的发病高峰在夏秋季,婴幼儿为易感人群,临床表现包括手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)、无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性瘫痪和格林.巴利综合征[2-4].保加利亚(1975年)、马来西亚(1997年)和台湾地区(1998年)的疫情显示,EV71感染所致的HFMD病情凶险,致残率和死亡率高,死因主要为脑干脑炎、肺水肿和肺出血.因此,日益引起关注.本文重点综述近年来有关EV71所致神经损害的研究进展.     

2008-2009年肠道病毒71型贵州省分离株的基因特征分析

肠道病毒71型(EV71)感染主要引起手足口病,近年来,EV71病毒的流行在亚太地区呈上升趋势,其中最令人关注的就是EV71的流行引起患儿的神经症状甚至死亡.贵州省自该病纳入法定传染病管理以来发现2009年感染EV71的患儿及重症病例比2008年多,同时在2009年初实验室诊断因EV71感染引起了患儿死亡,疫情也比2008年开始的早,我们对2008-2009年的手足口病临床标本进行了实验室诊断,并进行了基因测序及特征分析,以期发现是否发生了抗原漂移,分析引起重症的EV71毒株是否与核苷酸序列有相关性,现将结果报告如下.     

烟台市手足口病合并脑炎病毒分离及基因序列分析

目的 了解烟台地区手足口病合并脑炎病原谱及其基因学特征.方法 采集烟台地区手足口病合并脑炎患者粪便及脑脊液标本,通过细胞培养分离病毒,实时荧光PCR鉴定病毒型别,RT-PCR扩增VP1区基因部分序列并测序,进行序列分析.结果 10份粪便标本分离病毒3株,均为EV71.与C4a型代表株核苷酸同源性为98％～99％,氨基酸同源性98.90％～99.45％.系统发生树中,烟台分离株与C4亚型C4a簇代表株位于同一分支.结论 烟台地区手足口病合并脑炎病原主要为EV71,属于C4亚型C4a簇.     

济宁市4428例手足口病患者流行病学特征分析

目的 分析济宁市手足口病(hand foot and mouth disease,HFMD)患者肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)病毒感染状况及患者流行病学特征.方法 采集2010年3月～2011年8月济宁市传染病医院收治的4428例手足口病患者便标本,并收集患者诊疗信息.采用Real-time RT-PCR 法检测便标本.结果 4428例患者男女性别比1.9∶1,年龄主要集中在6个月～5岁(93.54％,4142/4428).EV71总阳性率63.84％ (2827/4428),其中重型EV71阳性率为83.81％(761/908).结论 济宁市手足口病发病高峰在检测期间内为4～8月,致病病原体以EV71为主,2011年EV71阳性构成比高于2010年.     

EV71感染对免疫系统影响的研究进展

手足口病(Hand-foot-mouth disease,HFMD)是一种表现为手、足、口腔等部位的疱疹及中枢神经系统并发症的婴幼儿疾病.病原体以柯萨奇病毒A16型(CAV16)和肠道病毒71型(EV71)为主[1],其中EV71于1969年在美国首次被分离鉴定,但是直到1973年日本和瑞典暴发大规模流行之后,才被认为与手足口病相关,继而确立为手足口病的重要病原体之一.此后,EV71在全球连续暴发,在过去十年,亚太地区所受影响最重[2-3].在我国,2008年3月于安徽省阜阳暴发EV71感染所致重型手足口病,并迅速蔓延到多个省份,当年全国共有488955例HFMD患者,死亡126例[4].研究表明,在EV71感染所致的重型手足口病患儿的中,EV71引发机体免疫功能的紊乱,从而对疾病的进展产生不容忽视的影响.     

深圳市重症手足口病临床与实验特征变化趋势及随访1年报告

目的比较2012与2008年深圳市重症手足口病临床和实验特征,探讨其变化趋势。方法深圳市第三人民医院2008年及2012年共收治778例手足口病住院患儿,重点分析其中260例手足口病重症患者（2008年64例,2012年196例）。通过RT—PCR检测CoxsackieA16（CoxA16,A16）及Enterovirus71（EV71）病毒核酸,出现神经系统症状或体征者检查脑脊液常规及生化,部分患儿行头颅MRI检查,同时比较临床表现、血液生化等变化趋势。所有患者随访12个月评估再发情况。结果与2008年相比,2012年手足口病重症患者发病高峰年龄下降,〈12月龄儿童分别占2008年和2012年重症的15％和40％。两个年度重症患者均以EV71感染为主;与2008年相比,2012年EV71感染所占比率有下降趋势;重症患者手、足皮疹出疹率下降,而口腔疱疹出疹率明显增高,疱疹性咽峡炎引起的重症病例数上升;外周血白细胞计数、中性粒细胞比值及CRP水平均明显增高;但并发脑干脑炎或神经源性肺水肿的病例数略有下降。随访1年结果显示,无论EV71或CoxA16型手足口病临床治愈后均可多次再发,轻症再发率高于重症。结论深圳市手足口病从2008年暴发至2012年,发病呈上升趋势,重症手足口病病例临床表现具有一些新的特征,应引起广大医护人员重视。     

基于飞行时间质谱技术研究手足口病人群IL-22／IL-22RA1基因单核苷酸多态性

目的探讨Th22细胞相关性细胞因子IL-22／IL-22RA1基因单核苷酸多态性（SNP）与手足口病易感性及其转归的关系。方法采用病例-对照研究方法,选取2012年4月至9月深圳市第三人民医院收治并确诊的手足口病住院患者296例为病例组,其中轻症手足口病患者178例,重症患者118例,对照组为同期在该医院健康体检儿童155例。应用飞行时间质谱（timeoffightmassspectrum,TOF—MS）生物芯片技术,检测IL-22／IL-22RAl基因共4个SNP位点基因型（rs2227473、rs2227483、rs3795299、rs34379702）,对SNP进行Hardy．Weiberg平衡检测,并计算各SNP位点在不同人群中等位基因频率,筛选与手足口病易感性、预后相关的SNP位点。结果纳入研究的4个SNP位点的基因型分布均处于遗传平衡状态。人组人群中IL-22的基因rs2227473位点存在GG、GA和AA基因型,重症手足口病组rs222743位点A等位基因频率（13．14％,31／236）显著高于轻症组（6．18％,22／356）,差异有统计学意义（x^2=8．424,P〈0．001,A=2．296,95％CI=1．294—4．074）。对于EV71相关性手足口病而言,重症组A等位基因频率（19．64％,22／112）显著高于轻症组（7．41％,4／54）,差异有统计学意义（x^2=4．129,P=0．042,A=3．056,95％CI=0．997—9．368）。结论IL-22基因rs2227473位点多态性与手足口病转归密切相关,尤其是EV71相关性手足口病。     

手足口病重症化的危险因素、病理改变及临床干预

目的探讨手足口病（HFMD）重症化的危险因素及病理改变,为临床干预提供依据。方法回顾性分析宁波市第二医院2010年1月至2012年12月住院的2606例HFMD患儿的临床资料,分为普通组和重症组,分析筛选出HFMD重症化的危险因素;并对1例死亡患儿实施尸体解剖,分析其病理改变。结果2606例患儿中,重症HFMD619例（23．7％）;多因素分析显示EV71感染、精神差、血糖〉9mmol／L、高热（体温≥39．1℃）持续3d以上、年龄〈3岁以及神经反射异常等6项指标是HFMD重症化的独立相关因素;重症患儿的病变主要在中枢神经系统、肺脏以及肠道。结论对于EV71感染、年龄〈3岁且伴有精神、神经系统症状和血糖升高的高热HFMD患儿需关注其病情变化,并进行针对性的临床干预,且肠道功能的保护不容忽视。     

北京市2012年手足口病病原学监测重症病例危险因素分析

目的 分析北京市2012年手足口病病原学监测数据,了解北京市手足口病重症病例分布特征及危险因素,为调整防制策略提供依据.方法 对北京市18个区县疾控中心上报的手足口病病原学数据进行统计,采用现况研究的方法,利用EXCEL录入数据库,将所有病原学监测阳性病例分为重症病例组和轻症病例组,运用SPSS17.0软件分析患儿进展为重症病例的影响因素及因素间交互作用.结果 单因素分析中,年龄、居住地、是否为托幼儿童及EV71阳性对病例是否进展为重症病例有影响.多因素分析显示,年龄≤3岁（OR =4.58,95％CI 2.90 ～ 7.09）、散居儿童（OR =2.7,95％CI 1.72 ～4.26）、流行季病例（OR=2.46,95％CI 1.40 ～4.34）、居住地为郊区病例（OR=5.84,95％ CI 2.33～14.63）及EV71阳性（OR=2.77,95％CI 1.94 ～3.98）为手足口病例进展为重症病例的危险因素.交互作用分析显示居住地与年龄和看护类型、看护类型与性别、EV71与年龄和看护类型对于是否重症存在协同作用.结论 年龄≤3岁、居住在郊区、EV71阳性为手足口病例进展为重症病例的危险因素.     

2011年广州市手足口病病原谱分析

目的了解引起2011年广州市手足口病流行的病原体,确定其型别分布特征。方法收集手足口病疑似病例标本,用Real-time RT-PCR、巢式RT-PCR方法对其部分VP1基因进行扩增并测序,确定其病原谱构成,构建系统发育树。结果共收集2 067例疑似手足口病病例标本,其中实验室确诊肠道病毒阳性1 113份,包括EV71、CoxA16、CoxA6、CoxA10、CoxA9、HEV96、埃可病毒和柯萨奇B组等15种肠道病毒,其中EV71、CoxA16和CoxA6是主要病原体,分别占32.6%、39.2%和18.5%;死亡病例3例,全部由EV71引起;重症病例9例,6例由EV71引起,3例由CoxA6引起。VP1基因构建进化树分型发现,广州市2011年手足口病病原体属于HEV-A（97.2%）、HEV-B（2.5%）、HEV-C（0.3%）3个型别,未发现HEV-D型毒株。结论广州市2011年手足口病的流行主要由HEV-A型的EV71、CoxA16和CoxA6病毒引起,同时还存在HEV-B型和HEV-C型的CoxA9、EC、CoxB、CoxA24多种病毒。     

深圳市某街道2009-2010年手足口病病原体监测分析

目的对2009-2010年深圳市某街道手足口病进行病原学监测分析。方法收集5440份手足口病患者的病原学监测资料,对资料进行描述性分析和χ2检验。结果总肠道病毒（EV71和CoxA16）阳性率为43.3%,其中EV71阳性率为19.4%,CoxA16阳性率为23.9%,二者差异无统计学意义（χ2=0.396,P=0.529）。男性总肠道病毒阳性率为44.7%,女性阳性率为41.4%,不同性别间肠道病毒阳性率差异无统计学意义（χ2=0.076,P=0.783）。各年龄段肠道病毒阳性率差异有统计学意义（χ2=4.241,P=0.039）。12名重症患者中,EV71阳性率75.0%。结论深圳市某街道2009-2010年手足口病流行的病原体为EV71和CoxA16,不同性别的阳性率无差别,各年龄段肠道病毒阳性率差异有统计学意义。     

惠州市重症手足口病病原谱及EV71型VP1区基因特征分析

目的分析惠州市手足口病重症病例的病原谱构成,了解惠州市肠道病毒71型分离株的VPl区基因特征．为科学防治手足口病提供科学依据。方法采集300例重症手足口病（HFMD）患者标本,采用实时荧光RT-PCR检测肠道病毒核酸,并对肠道病毒7l型（EV71）和柯萨奇病毒A16型（CoxA16）进行分型检测;选择8株EV71分离株进行VPl区基因全长序列测定,测序结果利用DNASTAR软件进行核苷酸、氨基酸序列分析和同源性比较。并用Mega5．0软件构建亲缘性进化树。结果通过实时荧光RT-PCR特异性检测,EV71阳性结果154份,阳性率为51．33％;CoxAl6阳性结果38份,阳性率为12．67％。测序结果表明,8株EV71之间的VPl基因核苷酸同源性为96．9％～99．2％。氨基酸同源性为99．3％～100％。VPI区基因遗传进化分析表明。8株EV71分离株与c4基因亚型的代表株处于同一分支,均属于C4基因亚型的C4a进化分支。结论惠州市手足口病疫情主要病原EV71病毒均属于C4a基因亚型,与2004年以来的中国大陆EV71病毒流行的基因型一致,未产生明显的抗原漂移及变异。     

Risk factors for severe hand,foot, and mouth disease infected with Coxsackievirus A6: A hospital-based case-control study

Coxsackievirus 6 (CV-A6) has been emerging as another predominant serotype for severe hand, foot, and mouth disease (HFMD) in China, after the introduction of enterovirus 71 inactivated vaccine (EV71 vaccine) for 3 years. Data on the risk factors for severe HFMD infected with CV-A6 are limited. We interviewed the caregivers to collected data on HFMD patients who sought medical care in the People's Hospital of Baoan district, Shenzhen, from 2015 to 2017. Totally, 131 severe patients were frequency-matched by age and gender with 174 mild patients infected with CV-A6. Univariable and multivariable logistic regression analyses were conducted to analyze the risk factors for severe CV-A6 HFMD. The average age was 20.62 ± 14.18 months and 20.52 ± 12.76 months for severe and mild patients, respectively. Multivariate analyses indicated complications at birth (odds ratio [OR], 4.18; 95% confidence interval [CI]: 1.64-10.63), peak body temperature over 39°C (OR, 4.04; 95% CI: 2.29-7.10) and first-born child (OR, 2.17; 95% CI: 1.27-3.70) increased the risk of severe HFMD infected with CV-A6. Breastfeeding (OR, 0.52; 95% CI: 0.32-0.87), and washing hands after playing frequently (OR, 0.58; 95% CI: 0.34-0.97) were negatively associated with severe illness. Compared with HFMD with infection of EV-A71, complications at birth and first-born child were newly found to be associated with severe illness in HFMD patients infected with CV-A6.     

Co-detection in the pathogenesis of severe hand-foot-mouth disease

It still needs to be elucidated whether co-detection of EV71 with other intestinal tract viruses plays a role in the pathogenesis of severe hand-foot-mouth disease (HFMD). A total of 680 stool specimens collected from clinically diagnosed mild and severe-HFMD patients were tested for EV71, CA16, norovirus, bocavirus and rotavirus. The results showed that EV71 was significantly associated with severe-HFMD patients. Co-detection of EV71 with norovirus and rotavirus was also significantly associated with severe-HFMD patients: The OR (95?% CI) value was 6.466 (2.735, 15.283) and 7.561 (3.560, 16.057), p?<?0.001, respectively. Co-detection of EV71 with rotavirus or norovirus is probably associated with severe HFMD.     

河北省手足口病病例的病原构成及EV71病毒基因特征分析

目的了解河北省不同地区、不同严重程度手足口病病例的病原构成情况及EV71病毒的基因特征。方法采集河北省不同地区的HFMD患者粪便、疱疹液、咽拭子标本进行核酸检测和病毒分离,同时结合所收集的HFMD患病例的居住地、疾病严重程度信息加以分析。选取18株EV71阳性分离株进行VP1编码区基因扩增和核苷酸序列测定和分析,与其它38株各基因型和基因亚型的EV71代表株构建系统发生树。结果2009年河北省HFMD临床诊断病例的EV阳性率为65．13％,其中以EV71为主,占阳性病例的58．0％（752／1296）。秦皇岛、邯郸、保定、邢台地区手足口病例以EV71感染为主,而衡水、沧州等地区则以CA16为主。轻型病例中EV71阳性率为37．74％,重症病例中EV71阳性率为80．64％,死亡病例检测13例,均为EV71阳性。18株EV71分离株的VP114核苷酸同源性为94．9％～99．8％,与C4亚型代表株的VP1区核苷酸同源性最高,为91．9％～99．6％。进化树结果显示,河北省EV71分离株与c4亚型代表株处于同一分支,并在C4a进化分支的不同簇中。结论2009年引起河北省手足口病流行的病原体主要为EV71和CA16。秦皇岛、邯郸、保定、邢台地区手足口病例以EV7I感染为主,而衡水、廊坊、沧州等地区则以CA16为主。EV71是重症病例的主要致病病原体。河北省EV71分离株为c4亚型C4a进化分支。