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1.
目的 探讨抑癌基因PTEN在鼻咽癌细胞株及组织中的基因突变和蛋白表达缺失情况.方法 收集鼻咽癌细胞株4种(CNE-1、CNE-2、HONE1、sUNE1)、经病理组织学确诊为未分化型非角化性鼻咽癌组织标本96例(其中71例同时取癌旁组织)和慢性鼻咽炎的组织标本5例.4种鼻咽癌细胞株、25例未分化型非角化性鼻咽癌组织和5例慢性鼻咽炎组织标本用于检测基因突变,其余71例未分化型非角化性鼻Ⅱ凼癌组织及癌旁组织进行免疫组化,检测PTEN的蛋白表达.采用RT-PCR和直接测序法分析PTEN编码序列基因突变;免疫组织化学SP法观察蜡块包埋的鼻咽癌组织和癌旁组织中PTEN蛋白的表达情况.免疫印迹法检测PTEN及相关蛋白在细胞株中的表达.结果 仅1例鼻咽癌组织检测到PTEN基因第8外显子中存在点突变,但属于沉默突变.71例鼻咽癌组织中PTEN蛋白的表达率(30.9%)显著低于癌旁组织(52.1%,P=0.017).Ⅲ-Ⅳ期肿瘤组织PTEN阳性表达率(25.5%)显著低于Ⅰ-Ⅱ期肿瘤组织(55%,P=0.026).EB病毒阳性组PTEN蛋白表达率与EB病毒阴性组比较明显降低(P=0.03).EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)可以下调PTEN蛋白的表达.结论 PTEN蛋白的表达缺失在鼻咽癌的发生、发展过程中起着重要作用,其缺失可能与EB病毒有关. 相似文献
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3.
目的应用甲基化特异性PCR(MSP)方法检测非小细胞肺癌(NSCLC)CDH13基因启动子甲基化情况。方法留取44例非小细胞肺癌患者手术标本及12例非肺癌患者正常肺组织,MSP分析CDH13基因启动子甲基化情况。结果 44例非小细胞肺癌中CDH13基因启动子甲基化阳性率为54.5%(24/44),12例正常肺组织中未检测到此基因的甲基化(0/12)。CDH13基因甲基化与患者性别及吸烟与否无关;肿瘤分期越晚甲基化的发生率越高。结论原发性非小细胞肺癌中存在着较高比例的CDH13启动子甲基化,提示CDH13在非小细胞肺癌的发生中起着重要作用。 相似文献
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人ID4基因启动子及上游顺式表达调控元件的克隆及特征分析 总被引:1,自引:0,他引:1
目的克隆人ID4基因启动子及上游顺式调控元件,并对其结构及调控元件的特征进行生物信息学分析。方法从NCBI人类基因组数据库中截取ID4基因转录起始位点上游5′侧翼区约2242bp及下游5′非翻译区212bp的基因组序列。利用TESS和Genomax等在线分析软件进行启动子及上游调控元件的特征分析。设计PCR引物,采用分段扩增法,获得长度分别为1811bp和650bp的两条产物片段,分别插入pGEM-T载体,转化至Top10感受态大肠埃希菌,筛选阳性克隆。先后应用KpnⅠ/NheⅠ、KpnⅠ/EcoRⅠ对获得的两个pGEM-T重组载体及pGL3Basic荧光素酶报告载体进行双酶切,T4DNA连接酶连接,转化至Top10感受态大肠埃希菌,筛选阳性克隆,最后测序鉴定。结果获得长度为2461bp的ID4基因启动子DNA序列,经测序证实与人类基因组序列一致。ID4基因具有Ⅱ型启动子特征,有2个非常显著的上游元件(TATA盒和GC盒),GC含量占总碱基含量的65.9%。在转录起始位点上游-1000bp与下游212bp之间分别存在多个可能具有正向和负向调控作用的顺式元件。结论成功克隆了人ID4基因启动子及其顺式调控元件,并... 相似文献
5.
幽门螺杆菌感染与hMLH1和APC基因突变及hMLH1甲基化异常的关系 总被引:1,自引:0,他引:1
目的 探讨幽门螺杆菌 (H .pylori)感染与hMLH1和APC突变及甲基化异常的关系。方法 采用改良的Giemsa染色和PCR方法检测H .pylori;采用二维DNA电泳、DGGE电泳和DNA测序技术检测hMLH1和APC突变 ;采用甲基化特异性PCR检测hMLH1启动子区的甲基化状态 ;采用以PCR为基础的方法检测微卫星DNA不稳 (MSI)。结果 6 8例胃癌中检出hMLH1基因突变 3例 ,突变率为 4 4 %。APC基因突变 15例 ,突变率为 2 2 1%。hMLH1突变与肿瘤大小、分化程度、组织学类型、浸润深度和临床病理分期无显著相关。APC突变率在肠型胃癌显著高于弥漫型胃癌 (P <0 0 5 )。正常胃黏膜未见hMLH1高甲基化。 6 8例胃癌中检出hMLH1高甲基化 11例 ,占 16 2 % ,均为去甲基化和高甲基化并存。将MSI分为高频率MSI(MSI H ,≥ 2个位点 ) 8例、低频率MSI(MSI L ,仅为 1个位点 ) 9例和MSI阴性 (MSS) 5 1例三组 ,结果 3例hMLH1基因突变均发生于MSI H组 ,而MSI L和MSS组未见 ;APC突变均发生于MSI L和MSS组 ,而MSI H组未发现有APC突变者 ;MSI H组hMLH1高甲基化的检出率显著高于MSI L和MSS组 (P <0 0 1)。hMLH1和APC基因突变及hMLH1甲基化在H pylori阳性组和H pylori阴性组及CagA 组和CagA-组检出率差异均无统计学意义 (P>0 0 5 )。结论 hMLH1突变和 相似文献
6.
人铜锌超氧化物歧化酶基因启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体的构建及表达 总被引:1,自引:1,他引:0
目的 构建人铜锌超氧化物歧化酶基因(Cu/Zn SOD,SOD1)启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体,并对其功能进行鉴定,为研究细胞内SOD1基因表达调控和相关的信号转导机制提供重要工具.方法 提取人基因组DNA,FCR扩增SOD1 5'非编码区启动子序列(-1 499- +17);采用基因重组技术构建由SOD1启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体,将该载体瞬时转染Hella细胞,观察静息或佛波酯(PMA)刺激下红色荧光蛋白表达,以检测SOD1启动子的转录活性及其基凶表达.结果 酶切和DNA测序证明所构建红色荧光蛋白报告基因载体正确;该表达载体静息状态下在Hella细胞表达少量红色荧光蛋白,经PMA刺激后,能够表达较多高亮度的红色荧光蛋白.结论 成功构建了SOD1启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体,其对相关刺激有很好的反应,可用于SOD1基因表达信号调控机制的研究. 相似文献
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构建Egr-1启动子调控Smad7基因的重组腺病毒及启动子活性研究 总被引:2,自引:0,他引:2
目的 构建含Egr 1启动子和Smad7cDNA的重组复制缺陷型腺病毒并研究射线诱导Egr 1基因启动子调控Smad7体外表达的时间和剂量效应 ,为下一步的基因治疗奠定基础。方法以Adeno XTM表达试剂盒为基础 ,应用分子克隆技术 ,将穿梭质粒pShuttle的CMV启动子替换为Egr 1启动子 ,将Smad7cDNA亚克隆至穿梭质粒内 ,与腺病毒DNA重组 ,在HEK2 93细胞中进行包装、扩增 ,纯化测定病毒滴度。通过Westernblot检测X射线照射激活Egr 1启动子调控Smad7体外表达的时间和剂量效应。结果 经酶切、PCR及测序鉴定证实成功构建了含Egr 1启动子和Smad7的重组复制缺陷型腺病毒pAdES。病毒滴度为 3 0× 10 1 1 TCID50 ml。感染重组腺病毒的靶细胞经不同剂量的深部X射线照射后Smad7蛋白表达量存在一定的时间、剂量差异 :实验组Smad7蛋白表达量在照射后 1h即已升高 ,2~ 7h之间维持在一个较高水平 ,尔后表达量开始下降 ;实验组中Smad7蛋白表达量随着吸收剂量的增加而增加 ,在 8~ 15Gy之间维持一个较高的表达水平。而对照组Smad7蛋白表达量无明显的时间和剂量效应。结论 成功构建了含Egr 1启动子和Smad7的重组复制缺陷型腺病毒pAdES ,重组于腺病毒内的Egr 1启动子经射线激活后具有调控下游Smad7表达的活性。 相似文献
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目的 构建肌动蛋白结合Rho激活C末端样(ABRACL)基因启动子不同截短片段重组质粒,并检测其转录活性。方法 以含ABRACL启动子全长质粒为模板,利用PCR方法分别扩增ABRACL启动子不同截短片段;将扩增片段分别插入pGL3.0-basic载体,构建ABRACL启动子不同截短片段重组质粒;经双酶切及序列鉴定正确后,将重组质粒转染ZR75-1和A549细胞,采用双荧光素酶报告基因检测系统测定ABRACL启动子不同截短片段的双荧光素酶活性;检测转录因子MYB原癌基因样2(B-MYB)对ABRACL启动子不同截短片段转录活性的影响。结果成功构建含ABRACL基因启动子不同截短片段重组质粒,双荧光素酶活性测定发现ABRACL基因启动子-400 bp片段活性较高,转录因子B-MYB可以增强ABRACL启动子-600 bp和-1000 bp片段的活性。结论 发现ABRACL基因启动子转录活性较高区域,为进一步研究ABRACL基因上游调控机制奠定基础。 相似文献
9.
目的 确定XBP1启动子的转录核心区域,探讨激活转录因子6(ATF6)在内质网应激(ERS)与非ERS状态下对XBP1启动子转录活性的调控作用.方法 采用基因重组技术构建ATF6基因及两个缺失体ATF6s1p、ATF6s2p的真核表达载体pcDNA3.1 (-)-ATF6、pcDNA3.1 (-)-s1p、pcDNA3.1(-)-s2p,以及XBP1启动子报告基因载体pGL3-XBP1.针对XBP1启动子的各个组成元件设计和构建XBP1一系列截短体的报告基因载体.采用双荧光素酶报告基因法检测并确定XBP1启动子的核心启动子区,Western blotting检测ATF6及缺失体s2p、s1p在ERS与非ERS状态下对XBP1核心启动子区转录的调控作用.结果 XBP1启动子的-407bp-+133bp区域是转录活性调控的核心区域,-2000bp--407bp区域不具有转录活性,该区域可能含有抑制转录活性的组成元件.非ERS状态时,ATF6及两个缺失体s2p、s1p可明显上调XBP1启动子的转录活性及XBP1蛋白表达;而在ERS状态时,ATF6及两个缺失体s2p、s1p下调了XBP1启动子的转录活性和XBPl蛋白表达.结论 ATF6对XBP1的转录调控作用在ERS状态和非ERS状态下存在差异.非ERS状态时,ATF6上调XBP1的转录和表达,而ERS状态时,ATF6下调XBP1的转录和表达. 相似文献
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目的:建立ASPP1甲基化状况的检测方法,研究ASPP1基因启动子在HEPG-2肝癌细胞株和成纤维细胞株中的甲基化状况。方法:利用因特网对ASPP1基因启动子的CpG岛进行分析,并设计MSP引物,然后对正常的成纤维细胞和p53野生型肿瘤细胞株HEPG-2的ASPP1 DNA启动子甲基化状况进行检测。结果:MSP分析显示,在正常的成纤维细胞中,ASPP1基因启动子CpG岛未出现甲基化;在p53野生型肿瘤细胞株HEPG-2中,ASPP1基因启动子CpG岛处于甲基化状态。结论:MSP检测ASPP1启动子CpG岛甲基化状况的方法客观、准确、可靠。 相似文献
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目的探讨P27基因甲基化在鼻咽癌发生发展中的作用。方法运用甲基化特异性PCR技术对5个鼻咽癌细胞株(CNE1、CNE2、TWO3、HNE1、HONE1)和1个正常鼻咽上皮细胞株(NP69),54例鼻咽癌组织和20例正常鼻咽上皮组织的P27基因启动子区甲基化状态进行检测。半定量反转录PCR法检测加入甲基转移酶抑制剂5-氮-2-脱氧胞苷(5-aza-2-deoxycytidine)后CNE1和CNE2中P27基因转录表达的变化,分析鼻咽癌组织中P27基因甲基化与临床因素的关系以及去甲基化对P27基因转录表达的影响。结果正常鼻咽上皮细胞株NP69及20例正常鼻咽上皮组织中均未检测到P27基因甲基化;5个鼻咽癌细胞株中P27基因甲基化频率为80%(4/5),54例鼻咽癌组织中P27基因甲基化频率为63%(34/54),二者与正常鼻咽上皮细胞株及正常鼻咽上皮组织比较差异均有统计学意义(P<0.01),进一步分析发现P27基因甲基化状态与患者年龄、性别、T分期、N分期、TNM分期、病理类型等临床因素均无相关性(P>0.05),经5-氮-2-脱氧胞苷处理后CNE1和CNE2中P27基因的转录表达增加。结论P27基因甲基化与... 相似文献
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目的探讨不同放射敏感性鼻咽癌细胞株CNE-1(鼻咽高分化鳞癌细胞株)、CNE-2(鼻咽低分化鳞癌细胞株)中DNA依赖蛋白激酶(DNA—PK)的调节亚基Ku70、Ku80基因的表达与鼻咽癌细胞放射敏感性的关系。方法通过克隆形成实验测定CNE-1、CNE-2不同剂量的存活分数,并用线性二次模型拟合剂量存活曲线求出放射生物学参数α、β、SF2、MID值,以及四氮唑蓝比色分析法(MTT法)检测^60Co γ射线4Gy照射后的细胞群体生长情况,以评价两株细胞的放射敏感性。逆转录实时荧光定量PCR技术(RT-FQ-PCR)检测照射前、后不同时间及不同剂量CNE-1、CNE-2细胞mRNA水平Ku70、Ku80基因的定量表达。结果CNE-1在各个剂量点的存活分数均比CNE-2高,MID值分别为2.78、1.61,SF2值分别为0.627、0.341;4Gy照射后的存活率分别为88.2%、72.3%;RT-FQ-PCR显示两株细胞中均有Ku70、Ku80基因的表达,其相对表达量之比分别为1.76±0.54(P=0.07)、13.82±3.78(P=0.004),Ku80基因在CNE-2细胞中存在剂量依赖关系。结论实验验证了CNE-2比CNE-1对射线更敏感,Ku80基因的表达与鼻咽癌细胞的放射敏感性有关。 相似文献
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目的 研究基因STAT1沉默对人放射抗拒鼻咽癌细胞放射敏感性的影响.方法 慢病毒介导的STAT1基因转染放射抗拒鼻咽癌细胞CNE-2R,荧光定量RT-PCR技术检测沉默效果.MTT法检测转染前后细胞增殖活性,流式细胞技术检测细胞周期及凋亡,克隆形成实验检测转染前后细胞放射敏感性变化.结果 慢病毒转染后放射抗拒鼻咽癌细胞STAT1表达降低(F=429.87,P<0.05)、细胞生长抑制(F3=.88~4.63,P<0.05)、凋亡率增加(F=38.13,P<0.05)、放射敏感性增加(F=252.80,P<0.05)、细胞周期中G0/G1、S和G2/M期未见明显差异(P>0.05).结论 沉默STAT1基因能增加放射抗拒鼻咽癌细胞 CNE-2R的放射敏感性. 相似文献
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目的 探讨鼻咽刷洗物检测MSH2和RUNX3基因甲基化在鼻咽癌早期诊断及预后判断中的作用.方法 选择经病理确诊的鼻咽癌患者54例、慢性鼻咽炎患者18例和健康志愿者20例作为研究对象,运用甲基化特异性PCR检测鼻咽刷洗物中MSH2和RUNX3基因启动子区甲基化情况,评估将其用于诊断鼻咽癌的特异度和敏感度,分析基因甲基化与鼻咽癌患者临床病理特征的关系.结果 鼻咽癌患者鼻咽刷洗物MSH2和RUNX3基因甲基化频率分别为70.37%(38/54)和51.85%(28/54),在慢性鼻咽炎患者和健康志愿者中均未检测到MSH2和RUNX3基因启动子甲基化(P<0.001).鼻咽癌患者鼻咽刷洗物中运用甲基化特异性PCR检测MSH2基因甲基化诊断鼻咽癌的特异度为100%、敏感度70.37%; RUNX3基因甲基化诊断鼻咽癌的特异度为100%、敏感度51.85%;平行联合检测MSH2和RUNX3基因甲基化诊断鼻咽癌的特异度为100%、敏感度90.74%.鼻咽刷洗物中MSH2和RUNX3基因甲基化与患者临床病理特征无显著相关性(P>0.05).结论 运用甲基化特异性PCR平行联合检测鼻咽刷洗物MSH2和RUNX3基因甲基化对早期诊断鼻咽癌有高度特异性和敏感度,具有潜在的临床应用价值,但目前尚不能作为判断鼻咽癌临床预后预测指标. 相似文献
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目的 评价鼻咽癌细胞株SUNE1的两个不同转移潜能亚株5-8F和6-10B中转移相关基因1(MTA1)表达的差异,以及慢病毒介导的RNA干扰技术对人鼻咽癌高转移潜能细胞株5-8F中MTA1的沉默效应.方法 采用RT-PCR和Western blotting检测5-8F和6-10B细胞中MTA1 mRNA和蛋白表达的差异.利用在线数据库和软件设计MTA1 siRNA片段,构建特异性MTA1的慢病毒干扰载体,转染鼻咽癌细胞5-8F,荧光定量PCR和Western blotting检测其MTA1 mRNA和蛋白表达的变化.结果 5-8F细胞中MTA1 mRNA和蛋白表达均高于6-10B细胞.经测序分析,插入片段正确;荧光定量PCR 和 Western blotting 检测显示,RNA干扰后MTA1的表达水平明显降低.结论 MTA1可能在促进鼻咽癌细胞株的恶性转化和转移潜能的增强中具有作用.MTA1 siRNA可高效、特异地抑制5-8F细胞MTA1表达,为研究MTA1基因在鼻咽癌发生发展中的作用提供了有价值的研究工具. 相似文献
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目的 研究蒿甲醚(artemether)对人鼻咽癌CNE-1细胞放射敏感性的影响及其作用机理。方法 用MTT法检测蒿甲醚对CNE-1细胞生长的抑制效应;克隆形成法检测蒿甲醚对CNE-1细胞放射敏感性的影响;流式细胞仪检测不同处理因素对CNE-1细胞的细胞周期的影响;Western blot分析蒿甲醚对电离辐射诱导的CNE-1细胞中的细胞周期调控蛋白Cyclin B1和Wee1表达水平的影响。结果 蒿甲醚可抑制CNE-1细胞的增殖,且药物浓度和作用时间相关;20 μmol/L蒿甲醚对CNE-1细胞有放射增敏作用,其放射增敏作用随作用时间的延长而延长,作用24 h 后增敏作用最强,放射增敏比(SER)为1.481。流式细胞仪分析表明,单纯60Co γ射线照射后G2/M期细胞比例上升,而G0/G1期细胞比例下降;药物和射线联合作用后,与单纯照射组相比,G0/G1期细胞比例上升(t=4.59,P<0.05),G2/M期细胞比例下降(t=10.60,P<0.05)。蒿甲醚可降低照射后CNE-1细胞内Wee1蛋白表达水平,提高Cyclin B1蛋白表达水平。结论 低浓度蒿甲醚对CNE-1 细胞有放射增敏作用;蒿甲醚通过改变细胞周期调控蛋白Cyclin B1和 Wee1表达水平,诱导G2/M 期阻滞而发挥放射增敏作用。 相似文献
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印迹抑癌基因ARHI在浆液性卵巢癌中的表达及甲基化研究 总被引:1,自引:0,他引:1
目的研究浆液性卵巢癌组织中印迹抑癌基因ARHI mRNA的表达及其3个CpG岛的甲基化状态,以探讨ARHI基因及其甲基化修饰在卵巢上皮癌发生机制中的作用。方法正常卵巢及浆液性卵巢癌标本各20例,采用半定量RT-PCR方法检测ARHI mRNA表达,采用DNA亚硫酸盐修饰、PCR扩增及甲基化敏感性内切酶方法检测ARHI基因3个CpG岛的甲基化状态。结果ARHI/G3PDH在正常卵巢组织中为0.73±0.09,浆液性卵巢癌中为0.43±0.37(P<0.01)。正常卵巢组织的3个CpG岛均同时扩增出ARHI甲基化和非甲基化产物,呈正常半甲基化状态;浆液性卵巢癌的3个CpG岛则存在不同比例的甲基化异常,其中6例(30%)CpGⅠ、8例(40%)CpGⅡ、5例(25%)CpGⅢ处于高度甲基化状态。在浆液性卵巢癌组织中,8例ARHI基因表达缺失者均存在CpG岛的高度甲基化,其余12例中有5例存在CpG岛的高度甲基化,表达缺失者中CpG岛的高度甲基化率显著增高(P<0.01)。结论印迹抑癌基因ARHI启动子及编码区的3个CpG岛在浆液性卵巢癌组织中存在甲基化异常,并抑制了该基因的表达。 相似文献
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Objective To evaluate the effect of artemether on the cell cycle and the radiosensitivity in human nasopharyngeal carcinoma cell line CNE-1.Methods Cell growth inhibition was assessed with MTT.The method of colony-forming was used to detect the radiation sensitivity.Cell cycle distribution was analyzed by using flow cytometry.The protein expressions of clyclin B1 and Weei were detected by using Western blot.Results The growth of CNE-1 cells was inhibited in a dose-dependent manner.The concentration of 20 μmol/L artemether had radiosensitive effect on CNE-1 cells at 24 h after administration,and SER was 1.481.When CNE-1 cell was irradiated,the G2/M cells increased (t =4.59,P < 0.05).After exposure to combination of artemether and irradiation,the G2/M cells were decreased (t= 10.60,P < 0.05).Western blot showed that artemether increased the level of cyclin B1 expression and inhibited the level of Weel expression.Conclusions The noncytotoxic concentration of artemether could enhance radiosensitization of CNE-1 cells.The radiosensitivity enhancement of artemether might depend on the exposure time.The effect is most obvious when radiation is delivered 24 h after expose to artemetherr.The radiosensitizing effect could be related to apoptosis. 相似文献