P27基因甲基化在鼻咽癌发生发展中的作用

目的探讨P27基因甲基化在鼻咽癌发生发展中的作用。方法运用甲基化特异性PCR技术对5个鼻咽癌细胞株(CNE1、CNE2、TWO3、HNE1、HONE1)和1个正常鼻咽上皮细胞株(NP69),54例鼻咽癌组织和20例正常鼻咽上皮组织的P27基因启动子区甲基化状态进行检测。半定量反转录PCR法检测加入甲基转移酶抑制剂5-氮-2-脱氧胞苷(5-aza-2-deoxycytidine)后CNE1和CNE2中P27基因转录表达的变化,分析鼻咽癌组织中P27基因甲基化与临床因素的关系以及去甲基化对P27基因转录表达的影响。结果正常鼻咽上皮细胞株NP69及20例正常鼻咽上皮组织中均未检测到P27基因甲基化;5个鼻咽癌细胞株中P27基因甲基化频率为80%(4/5),54例鼻咽癌组织中P27基因甲基化频率为63%(34/54),二者与正常鼻咽上皮细胞株及正常鼻咽上皮组织比较差异均有统计学意义(P<0.01),进一步分析发现P27基因甲基化状态与患者年龄、性别、T分期、N分期、TNM分期、病理类型等临床因素均无相关性(P>0.05),经5-氮-2-脱氧胞苷处理后CNE1和CNE2中P27基因的转录表达增加。结论P27基因甲基化与...     

鼻咽刷洗物MSH2和RUNX3基因甲基化在鼻咽癌早期诊断及预后判断中的作用

目的 探讨鼻咽刷洗物检测MSH2和RUNX3基因甲基化在鼻咽癌早期诊断及预后判断中的作用.方法 选择经病理确诊的鼻咽癌患者54例、慢性鼻咽炎患者18例和健康志愿者20例作为研究对象,运用甲基化特异性PCR检测鼻咽刷洗物中MSH2和RUNX3基因启动子区甲基化情况,评估将其用于诊断鼻咽癌的特异度和敏感度,分析基因甲基化与鼻咽癌患者临床病理特征的关系.结果 鼻咽癌患者鼻咽刷洗物MSH2和RUNX3基因甲基化频率分别为70.37％(38/54)和51.85％(28/54),在慢性鼻咽炎患者和健康志愿者中均未检测到MSH2和RUNX3基因启动子甲基化(P＜0.001).鼻咽癌患者鼻咽刷洗物中运用甲基化特异性PCR检测MSH2基因甲基化诊断鼻咽癌的特异度为100％、敏感度70.37％; RUNX3基因甲基化诊断鼻咽癌的特异度为100％、敏感度51.85％;平行联合检测MSH2和RUNX3基因甲基化诊断鼻咽癌的特异度为100％、敏感度90.74％.鼻咽刷洗物中MSH2和RUNX3基因甲基化与患者临床病理特征无显著相关性(P＞0.05).结论 运用甲基化特异性PCR平行联合检测鼻咽刷洗物MSH2和RUNX3基因甲基化对早期诊断鼻咽癌有高度特异性和敏感度,具有潜在的临床应用价值,但目前尚不能作为判断鼻咽癌临床预后预测指标.     

乳腺癌组织中周期素依赖性激酶10基因启动子甲基化状态检测的临床意义

目的探讨乳腺癌组织中周期素依赖性激酶10（cyclin dependent kinase 10,CDK10）基因启动子甲基化状态及其与临床病理参数的联系。方法应用甲基化特异性聚合酶链反应检测CDK10基因启动子在50例乳腺癌组织及相应癌旁组织中的甲基化状态并结合临床病理资料进行分析。结果在乳腺癌组织中CDK10基因甲基化阳性率为60%（30/50）,癌旁对照组织未出现CDK10基因甲基化。CDK10基因甲基化同淋巴结转移与临床分期显著相关（P＜0.05）。结论CDK10基因甲基化与乳腺癌临床分期密切相关,可能是参与乳腺癌发展的重要分子事件。     

内质网应激对ATF6调控XBP1启动子转录的影响

目的 确定XBP1启动子的转录核心区域,探讨激活转录因子6(ATF6)在内质网应激(ERS)与非ERS状态下对XBP1启动子转录活性的调控作用.方法 采用基因重组技术构建ATF6基因及两个缺失体ATF6s1p、ATF6s2p的真核表达载体pcDNA3.1 (-)-ATF6、pcDNA3.1 (-)-s1p、pcDNA3.1(-)-s2p,以及XBP1启动子报告基因载体pGL3-XBP1.针对XBP1启动子的各个组成元件设计和构建XBP1一系列截短体的报告基因载体.采用双荧光素酶报告基因法检测并确定XBP1启动子的核心启动子区,Western blotting检测ATF6及缺失体s2p、s1p在ERS与非ERS状态下对XBP1核心启动子区转录的调控作用.结果 XBP1启动子的-407bp-+133bp区域是转录活性调控的核心区域,-2000bp--407bp区域不具有转录活性,该区域可能含有抑制转录活性的组成元件.非ERS状态时,ATF6及两个缺失体s2p、s1p可明显上调XBP1启动子的转录活性及XBP1蛋白表达;而在ERS状态时,ATF6及两个缺失体s2p、s1p下调了XBP1启动子的转录活性和XBPl蛋白表达.结论 ATF6对XBP1的转录调控作用在ERS状态和非ERS状态下存在差异.非ERS状态时,ATF6上调XBP1的转录和表达,而ERS状态时,ATF6下调XBP1的转录和表达.     

骨肉瘤组织MGMT基因甲基化状态的检测及其临床意义分析

目的探讨骨肉瘤组织O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)基因甲基化状态与MGMT蛋白表达及骨肉瘤化疗后肿瘤坏死率的关系。方法收集51例骨肉瘤组织样本,用甲基化特异性PCR(MSP)方法检测MGMT基因启动子区的甲基化状态,免疫组化方法检测MGMT蛋白的表达,并分析MGMT基因甲基化状态与肿瘤坏死率及临床病理资料的关系。结果 51例骨肉瘤组织MGMT基因启动子区甲基化发生率为23.5%(12/51),MGMT蛋白表达阴性率为27.5%(14/51);MGMT基因甲基化状态与骨肉瘤患者的年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤类型等无明显关系(P0.05)。MGMT基因甲基化的患者(共12例)化疗后肿瘤坏死率为Ⅰ级者0例,Ⅱ级者2例(16.7%),Ⅲ级者3例25.0%(25.0%),Ⅳ级者7例(58.3%),MGMT基因未甲基化的患者(共39例)化疗后肿瘤坏死率为Ⅰ级者23例(59.0%),Ⅱ级者13例(33.3%),Ⅲ级者2例(5.1%),Ⅳ级者1例(2.6%)。Wilcoxon秩和检验显示,骨肉瘤组织MGMT基因未甲基化患者的MGMT蛋白表达明显高于甲基化的患者(u=-4.92,P0.001),而化疗后肿瘤坏死率明显低于甲基化的患者(P0.05)。结论骨肉瘤组织MGMT基因甲基化状态对判断骨肉瘤患者化疗后的肿瘤坏死率具有重要意义。     

5-脱氧氮杂胞苷逆转食管鳞癌细胞系p16基因转录表达研究

目的：探讨5种食管鳞癌细胞株中p16基因转录失活以及去甲基化药物对其作用的机制.方法：采用细胞培养、PCR、DHPLC、MSP、Northern印迹、MTT等方法,检测EC1,EC18,EC109,TE1,TE10食管鳞癌细胞株中p16基因的缺失、突变、甲基化状态和p16的转录表达,观察去甲基化药物5-脱氧氮杂胞苷对p16基因转录表达和细胞增殖能力的影响.结果：除了EC1,其余4种食管鳞癌细胞株均检测出p16基因的不同变化：纯合缺失（EC18）,纯合型甲基化（EC18,EC109）,杂合型甲基化（TE1,TE10）,且纯合缺失的发生率较低（20%）,甲基化的发生率较高（80%）,经过5-Aza-CdR处理,可见2株发生了杂合型甲基化的TE1和TE10细胞p16基因的转录表达得到了逆转.结论：不同食管鳞癌细胞株p16基因转录失活的原因是不同的,启动子区甲基化为主要原因,其中杂合型甲基化可以被去甲基化药物5-脱氧氮杂胞苷逆转,使p16的转录表达上调.     

印迹抑癌基因ARHI在浆液性卵巢癌中的表达及甲基化研究

目的研究浆液性卵巢癌组织中印迹抑癌基因ARHI mRNA的表达及其3个CpG岛的甲基化状态,以探讨ARHI基因及其甲基化修饰在卵巢上皮癌发生机制中的作用。方法正常卵巢及浆液性卵巢癌标本各20例,采用半定量RT-PCR方法检测ARHI mRNA表达,采用DNA亚硫酸盐修饰、PCR扩增及甲基化敏感性内切酶方法检测ARHI基因3个CpG岛的甲基化状态。结果ARHI/G3PDH在正常卵巢组织中为0.73±0.09,浆液性卵巢癌中为0.43±0.37(P<0.01)。正常卵巢组织的3个CpG岛均同时扩增出ARHI甲基化和非甲基化产物,呈正常半甲基化状态;浆液性卵巢癌的3个CpG岛则存在不同比例的甲基化异常,其中6例(30%)CpGⅠ、8例(40%)CpGⅡ、5例(25%)CpGⅢ处于高度甲基化状态。在浆液性卵巢癌组织中,8例ARHI基因表达缺失者均存在CpG岛的高度甲基化,其余12例中有5例存在CpG岛的高度甲基化,表达缺失者中CpG岛的高度甲基化率显著增高(P<0.01)。结论印迹抑癌基因ARHI启动子及编码区的3个CpG岛在浆液性卵巢癌组织中存在甲基化异常,并抑制了该基因的表达。     

人铜锌超氧化物歧化酶基因启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体的构建及表达

目的 构建人铜锌超氧化物歧化酶基因(Cu/Zn SOD,SOD1)启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体,并对其功能进行鉴定,为研究细胞内SOD1基因表达调控和相关的信号转导机制提供重要工具.方法 提取人基因组DNA,FCR扩增SOD1 5'非编码区启动子序列(-1 499- +17);采用基因重组技术构建由SOD1启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体,将该载体瞬时转染Hella细胞,观察静息或佛波酯(PMA)刺激下红色荧光蛋白表达,以检测SOD1启动子的转录活性及其基凶表达.结果 酶切和DNA测序证明所构建红色荧光蛋白报告基因载体正确;该表达载体静息状态下在Hella细胞表达少量红色荧光蛋白,经PMA刺激后,能够表达较多高亮度的红色荧光蛋白.结论 成功构建了SOD1启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体,其对相关刺激有很好的反应,可用于SOD1基因表达信号调控机制的研究.     

HOXA10基因启动子区5'CpG岛甲基化在子宫内膜异位症中的作用

目的 检测HOXA10基因启动子区5'CpG岛甲基化状况,探讨其在子宫内膜异位症(EMS)发生中的作用.方法 收集2007年9月-2008年5月南方医科大学珠江医院妇产科30例EMS患者作为EMS组,同期25例正常妇女作为对照组,采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测EMS组异位内膜组织(其中Ⅰ-Ⅱ期10例,Ⅲ-Ⅳ期20例)和对照组子宫内膜组织中HOXA10基因启动子区5'CpG岛甲基化情况,并比较其在不同EMS临床分型间的差异.结果 30例EMS患者异位内膜组织中检测到程度不等的甲基化,其中20例Ⅲ-Ⅳ期EMS患者中有11例发生甲基化,甲基化发生率为55%,10例Ⅰ-Ⅱ期EMS患者中有1例发生甲基化,甲基化发生率为10%,Ⅲ-Ⅳ期EMS患者异位内膜组织HOXA10基因启动子区5'CpG岛的甲基化发生率高于Ⅰ-Ⅱ期(P<0.05).25例正常子宫内膜组织均未检测到甲基化.结论 HOXA10基因启动子区5'CpG岛甲基化在EMS的发生、发展中可能起着重要作用.     

幽门螺杆菌感染与hMLH1和APC基因突变及hMLH1甲基化异常的关系

目的　探讨幽门螺杆菌 (H .pylori)感染与hMLH1和APC突变及甲基化异常的关系。方法　采用改良的Giemsa染色和PCR方法检测H .pylori;采用二维DNA电泳、DGGE电泳和DNA测序技术检测hMLH1和APC突变 ;采用甲基化特异性PCR检测hMLH1启动子区的甲基化状态 ;采用以PCR为基础的方法检测微卫星DNA不稳 (MSI)。结果　 6 8例胃癌中检出hMLH1基因突变 3例 ,突变率为 4 4 %。APC基因突变 15例 ,突变率为 2 2 1%。hMLH1突变与肿瘤大小、分化程度、组织学类型、浸润深度和临床病理分期无显著相关。APC突变率在肠型胃癌显著高于弥漫型胃癌 (P <0 0 5 )。正常胃黏膜未见hMLH1高甲基化。 6 8例胃癌中检出hMLH1高甲基化 11例 ,占 16 2 % ,均为去甲基化和高甲基化并存。将MSI分为高频率MSI(MSI H ,≥ 2个位点 ) 8例、低频率MSI(MSI L ,仅为 1个位点 ) 9例和MSI阴性 (MSS) 5 1例三组 ,结果 3例hMLH1基因突变均发生于MSI H组 ,而MSI L和MSS组未见 ;APC突变均发生于MSI L和MSS组 ,而MSI H组未发现有APC突变者 ;MSI H组hMLH1高甲基化的检出率显著高于MSI L和MSS组 (P <0 0 1)。hMLH1和APC基因突变及hMLH1甲基化在H pylori阳性组和H pylori阴性组及CagA 组和CagA-组检出率差异均无统计学意义 (P>0 0 5 )。结论　hMLH1突变和