阿司匹林联合辛伐他汀对成骨细胞增殖及分化的影响

目的探索阿司匹林(aspirin,ASP)联合辛伐他汀(simvastatin,SIM)对成骨细胞增殖和分化的影响,为临床上两者联合使用的可行性提供细胞学基础。方法获取SD大鼠成骨细胞,随机分为对照组(CON)、ASP组、SIM组和ASP-SIM组等4组,培养基中分别添加安慰剂、ASP、SIM和ASP联合SIM干预,培养7 d后,通过MTT法检测细胞的增殖情况,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)及茜素红染色观察细胞的功能状态,蛋白电泳观察骨钙素(osteocalcin,OCN)及Runx2蛋白的表达情况。结果 ASP及SIM单独作用于成骨细胞时,都可以明显促进成骨细胞的增殖,增加ALP活性及矿化能力,同时明显促进OCN及Runx2蛋白的表达;联合使用效果明显优于单独使用,比较差异有统计学意义(P0.05)。结论 ASP及SIM都可以明显促进成骨细胞增殖和分化,且联合使用效果更佳。     

破骨细胞对IGF-1诱导成骨细胞骨同化的促进作用

目的 探讨破骨细胞(osteoclast, OC)存在时IGF-1对成骨细胞(osteoblast, OB)活性的影响。方法 体外培养MC3T3小鼠成骨细胞及RANKL诱导分化成熟的破骨细胞。以10ng/ mL的rhIGF-1直接干预单独或与破骨细胞共育的成骨细胞, 并设空白对照组,培养12h,检测成骨细胞的增殖、凋亡及碱性磷酸酶活性;培养8d后Von kossa钙化染色法观察矿化结节的形成。结果 成骨细胞、破骨细胞共培养时,rhIGF-1作用12h能够明显促进成骨细胞增殖(P<0.05),抑制成骨细胞的凋亡(P<0.05),使细胞内ALP活性升高(P<0.05),8d时钙化结节的个数及面积百分比升高(P<0.05);与单独培养的成骨细胞组有显著性差异。结论 破骨细胞可明显促进IGF-1所诱导的成骨细胞骨同化作用。     

骨形成蛋白联合雷奈酸锶对成骨细胞增殖和分化的影响

目的探索骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)联合雷奈酸锶(strontium ranelate,SR)对成骨细胞增殖和分化的影响,为临床上两者联合使用可行性提供细胞学基础。方法获取SD大鼠成骨细胞,随机分为对照组、SR组、BMP组和BMP-SR组等4组,培养基中分别添加安慰剂、SR、BMP-2和SR联合BMP-2干预,培养12 d后,通过MTT法检测细胞的增殖情况,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)及茜素红染色观察细胞的功能状态,蛋白电泳观察骨钙素(osteocalcin,OCN)及Runx2蛋白的表达情况。结果 SR及BMP-2单独作用于成骨细胞时,都可以明显促进成骨细胞的增殖,增加ALP活性及矿化能力,同时明显促进OCN及Runx2蛋白的表达;联合使用效果明显优于单独使用,比较差异有统计学意义(P0.05)。结论 BMP-2及SR都可以明显促进成骨细胞增殖和分化,且联合使用效果更佳。     

阿司匹林联合雷奈酸锶治疗对成骨细胞以及去卵巢大鼠骨密度和骨量的影响

目的探讨阿司匹林(aspirin,ASP)联合雷奈酸锶(strontium ranelate,SR)治疗对成骨细胞及去卵巢大鼠骨密度和骨量的影响,并探索可能的机制。方法首先观察ASP、SR以及SR+ASP治疗对MC3T3-E1细胞ALP染色和茜素红染色的影响;然后通过双侧去卵巢建立绝经后骨质疏松症模型;随后去卵巢大鼠随机分为去卵巢组(OVX)、ASP组、SR组以及SR+ASP组;其中ASP组和SR组以及SR+ASP组大鼠分别接受阿司匹林、雷奈酸锶以及两者联合治疗12周;待治疗结束后使用Micro-CT、HE染色切片以及蛋白质印迹观察治疗效果以及可能的机制。结果成骨细胞实验表明,ASP、SR以及SR+ASP均能促进成骨细胞ALP生成以及矿化;而SR+ASP对成骨细胞ALP生成以及矿化最为显著(P<0.05)。治疗12周后,与ASP组和SR组相比,SR+ASP组的大鼠骨小梁数量和骨密度得到明显改善。SR+ASP组大鼠BMD、TV/BV、Tb.N、Tb.Th和Tb.Sp较SR组及ASP组明显改善(P<0.05)。和ASP组和SR组比较,SR+ASP组的大鼠Notch信号通路被激活,Notch 1、CBF 1 and Jagged 1水平显著上调,比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论SR联合ASP可以改善成骨细胞功能和对去卵巢大鼠骨量保护作用,且这种疗效可能通过Notch信号通路介导。     

骨碎补经骨髓间充质干细胞调节OPG/RANKL/RANK通路抑制破骨细胞的实验研究

目的研究骨碎补作用绝经后骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)调节OPG/RANKL/RANK通路及对破骨细胞分化成熟的影响并探讨其可能的作用机制。方法实验大鼠去双侧卵巢造模,分为实验组(OVXDF,造模+骨碎补水煎液灌胃)、模型组(OVX,造模+0.9%生理盐水灌胃)、假手术组(SHAM,假手术+0.9%生理盐水灌胃),造模成功后提取BMSCs,将BMSCs和骨髓单核细胞共培养于Transwell小室的上室和下室,分为实验组+破骨细胞(OVXDF+OC)、模型组+破骨细胞(OVX+OC)、假手术组+破骨细胞(SHAM+OC)。下室加入破骨细胞诱导剂,倒置相差显微镜观察破骨细胞的分化成熟情况并计数,酶联免疫吸附剂测定(ELISA)检测下室培养液中骨保护素(osteoprotegerin,OPG)、RANKL的含量,实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法(Western blot)检测BMSCs中Wnt10b、β-catenin、RANKL、OPG mRAN及蛋白表达并计算RANKL/OPG。结果在共培养系统中,与去卵巢灌胃大鼠BMSCs共培养的破骨细胞(OVXDF+OC)数量较单纯模型组+破骨细胞(OVX+OC)明显减少(P0.05)。下室培养液OPG含量及共培养BMSCs中Wnt10b、β-catenin、OPG mRAN及蛋白表达模型组+破骨细胞(OVX+OC)最低,RANKL及RANKL/OPG最高,经骨碎补灌胃后(OVXDF+OC)培养液中OPG含量及BMSCs细胞中Wnt10b、β-catenin、OPG mRAN及蛋白表达明显升高,培养液及BMSCs细胞中RANKL及RANKL/OPG明显降低(P0.05)。结论骨碎补可调节BMSCs细胞OPG、RANKL的表达,激活OPG/RANKL/RANK信号通路抑制破骨细胞的分化和成熟,此作用可能与BMSCs的Wnt/β-catenin信号通路的激活有关。     

骨碎补通过骨髓间充质干细胞调节RANKL/OPG抑制破骨细胞的实验研究

目的　研究骨碎补对绝经后骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)RANKL/OPG及破骨细胞分化成熟的影响并探查其可能的作用机制。方法 实验大鼠去双侧卵巢造模,分为实验组（OVXDF,造模+骨碎补水煎液灌胃）、模型组（OVX,造模+0.9%生理盐水灌胃）、假手术组（SHAM,假手术+0.9%生理盐水灌胃）,造模成功后提取BMSCs,将BMSCs和骨髓单核细胞共培养于Transwell小室的上室和下室,分为实验组+破骨细胞（OVXDF+OC）、模型组+破骨细胞（OVX+OC）、假手术组+破骨细胞（SHAM+OC）。下室加入破骨细胞诱导剂,倒置相差显微镜观察破骨细胞的分化成熟情况并计数,酶联免疫吸附剂测定（ELISA）检测下室培养液中骨保护素(osteoprotegerin,OPG)、RANKL的含量,并计算RANKL/OPG,实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法(Western blot)检测BMSCs中Wnt10b、β-catenin、RANKL、OPG mRAN及蛋白表达并计算RANKL/OPG。结果 在共培养系统中,与去卵巢灌胃大鼠BMSCs共培养的破骨细胞（OVXDF+OC）数量较单纯模型组+破骨细胞（OVX+OC）明显减少（P＜0.05）。下室培养液OPG含量及共培养BMSCs中Wnt10b、β-catenin、OPG mRAN及蛋白表达模型组+破骨细胞（OVX+OC）最低,RANKL及RANKL/OPG最高,经骨碎补灌胃后（OVXDF+OC）培养液中OPG含量及BMSCs细胞中Wnt10b、β-catenin、OPG mRAN及蛋白表达明显升高,培养液及BMSCs细胞中RANKL及RANKL/OPG明显降低（P＜0.05）。结论 骨碎补可调节BMSCs细胞OPG、RANKL的表达,激活OPG/RANKL/RANK信号通路抑制破骨细胞的分化和成熟,此作用可能与BMSCs的Wnt/β-catenin信号通路的激活有关。     

Transwell小室内建立小鼠成骨-破骨细胞共培养体系

目的 :Transwell小室内建立体外小鼠成骨-破骨细胞共培养体系,并检测体系对成骨及破骨细胞活性的影响。方法:体外培育小鼠成骨细胞MC3T3-E1和小鼠单核巨噬细胞RAW264.7,RANKL诱导小鼠单核巨噬细胞RAW264.7分化为成熟破骨细胞后,于Transwell小室内建立成骨-破骨细胞共培养体系。通过CCK-8实验、茜素红染色、TRAP染色检测细胞的成骨、破骨活性。采用PCR、Western Blot方法检测成骨细胞MC3T3-E1中OPG、ALP、RANKL、TGF-b1的基因表达以及RANKL的蛋白表达,检测破骨细胞RANK、NF-κB的基因表达和蛋白表达。结果 :小鼠成骨细胞MC3T3-E1和小鼠破骨细胞可在Transwell小室内建立共培养体系;共培养体系影响小鼠成骨细胞与破骨细胞的分化活性,镜下可见成骨细胞分化增多,破骨细胞分化稍减少。共培养体系中成骨细胞基因OPG(0.65±0.08)、ALP(0.16±0.01)较单独培养OPG(1.00±0.08)、ALP(1.01±0.16)表达下降,而TGF-b1(4.42±0.21)、RANKL(4.12±1.04)较单独培养组TGF-b1(1.00±0.10)、RANKL(1.00±0.09)表达上升;破骨细胞相关RANK(0.63±0.06)、NF-κB(0.64±0.08)基因表达较单独培养组的RANK(1.00±0.08)、NF-κB(1.00±0.09)下降,差异均有统计学意义。同时共培养组的OPG(0.43±0.05)、NF-κB(0.59±0.05)的蛋白表达较单独培养组的OPG(0.84±0.06)、NF-κb(1.13±0.03)减少;共培养组RANKL(0.54±0.03)的蛋白表达则较单独培养组的RANKL(0.31±0.03)增加,差异有统计学意义,均与基因表达变化趋势一致。结论:小鼠成骨细胞MC3T3-E1和小鼠破骨细胞可在Transwell小室内建立共培养体系,共培养体系中成骨细胞活性高于破骨细胞活性。     

过表达miR-664a-5p激活Wnt/β-catenin信号通路促进骨质疏松大鼠骨重建

目的 探究过表达miR-664a-5p的脂肪间充质干细胞（miR-664a-5p-ADSCs）通过激活Wnt/β-catenin信号通路对骨质疏松（OP）大鼠骨重建的促进作用。方法 将大鼠分为Sham组、OVX组、ADSCs组和miR-664a-5p-ADSCs组。切除卵巢建立OP大鼠模型,Sham组仅切除脂肪组织。3个月后,ADSCs组和miR-664a-5p-ADSCs组分别尾静脉注射miR-664a-5p-ADSCs及其阴性对照ADSCs;Sham组和OVX组注射等量生理盐水。1个月后进行指标检测。micro-CT、HE染色、TRAP染色检测OP大鼠骨重建情况;免疫组化染色、RT-qPCR、Western blot检测Runx2、ALP、OCN、Wnt、β-catenin mRNA和蛋白的表达。结果 Sham组骨小梁完整,破骨细胞较少;与Sham组相比,OVX组骨小梁稀疏且变薄,破骨细胞较多;Runx2、ALP、OCN、Wnt、β-catenin mRNA和蛋白水平明显降低（P<0.05）;与OVX组相比,ADSCs组、miR-664a-5p-ADSCs组骨小梁增加且增厚,破骨细胞较少;Runx2、ALP、OCN、Wnt、β-catenin mRNA和蛋白水平明显升高,且miR-664a-5p-ADSCs组上述效果强于ADSCs组（P<0.05）。结论 过表达miR-664a-5p的ADSCs通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进OP大鼠骨重建。     

骨康灵联合99Tc-MDP治疗糖皮质激素诱发骨质疏松细胞分子机制研究

目的观察骨康灵和99Tc-MDP联合治疗糖皮质激素诱发的骨质疏松优于单独治疗的细胞分子机制。方法用SD大鼠随机分为DEX(地塞米松)、DEX-MDP(地塞米松+99 Tc-MDP 2mg/kg)、DEX-Z(地塞米松+骨康灵2ml/kg)和DEX-MDP-Z(地塞米松+99 Tc-MDP 2mg/kg+骨康灵2ml/kg)组。给药后颈动脉放血,制备含药血清,用MTT和PNPP法检测其对成骨细胞增殖与分化的影响;用TRAP染色和骨片吸收陷窝法观察其对破骨细胞的数目和功能影响;取大鼠股骨骨髓细胞,用Real-time PCR方法检测骨髓细胞RUNX2和PPARγ的表达。结果显示与对照组及单独治疗组相比联合用药组对成骨细胞有微弱的促分化作用,对破骨细胞有较强的抑制其数量和骨吸收的功能;同时联合用药能上调RUNX2与PPARγ的比值。结论中药骨康灵联合99Tc-MDP能有效抑制破骨细胞的数目和功能,同时促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞前体分化,这可能是其优于单独治疗的细胞分子机制之一。     

MicroRNA-613靶向Frizzled7对裸鼠人前列腺癌细胞移植瘤增殖和侵袭的影响

目的观察microRNA-613(miR-613)对裸鼠人前列腺癌细胞移植瘤生长及侵袭的影响。方法在4组裸鼠腋下皮下分别注射对数生长期的前列腺癌细胞PC3-miR-NC、DU145-miR-NC和稳定表达miR-613的PC3-miR-613、DU145-miR-613细胞,建立裸鼠移植瘤模型。采用免疫组化检测FZD7的表达,采用Western blot检测FZD7、β-catenin、p-β-catenin、E-cadherin、Vimentin蛋白的表达。结果PC3-miR-613、DU145-miR-613组移植瘤体积分别小于PC3-miR-NC、DU145-miR-NC组(P<0.05),且FZD7、β-catenin、p-β-catenin、Vimentin蛋白相对表达量降低,E-cadherin相对表达量增高。结论miR-613靶向FZD7抑制裸鼠人前列腺癌细胞移植瘤生长和侵袭进程。     

Dual effect of strontium ranelate: stimulation of osteoblast differentiation and inhibition of osteoclast formation and resorption in vitro

Strontium ranelate is a newly developed drug that has been shown to significantly reduce the risk of vertebral and non-vertebral fractures, including those of the hip, in postmenopausal women with osteoporosis. In contrast to other available treatments for osteoporosis, strontium ranelate increases bone formation and decreases resorption. In this study, the dual mode of action of strontium ranelate in bone was tested in vitro, on primary murine osteoblasts and osteoclasts derived from calvaria and spleen cells, respectively. We show that strontium ranelate treatment, either continuously or during proliferation or differentiation phases of mouse calvaria cells, stimulates osteoblast formation. Indeed after 22 days of continuous treatment with strontium ranelate, the expression of the osteoblast markers ALP, BSP and OCN was increased, and was combined with an increase in bone nodule numbers. On the other hand, the number of mature osteoclasts strongly decreased after strontium ranelate treatment. Similarly to previous studies, we confirm that osteoclasts resorbing activity was also reduced but we found that strontium ranelate treatment was associated with a disruption of the osteoclast actin-containing sealing zone. Therefore, our in vitro assays performed on primary murine bone cells confirmed the dual action of strontium ranelate in vivo as an anabolic agent on bone remodeling. It stimulates bone formation through its positive action on osteoblast differentiation and function, and decreases osteoclast differentiation as well as function by disrupting actin cytoskeleton organization.     

miR-204通过Wnt信号通路对骨质疏松症小鼠成骨细胞增殖的影响及机制分析

目的探讨miR-204通过Wnt信号通路对骨质疏松症小鼠成骨细胞增殖的影响及机制分析。方法雌性昆明小鼠分为:对照组、假手术组和骨质疏松症组,采用双侧卵巢切除法建立去卵巢骨质疏松小鼠模型并进行鉴定;提取小鼠原代成骨细胞并鉴定;细胞转染并检测miR-204的表达水平;MTT检测各组细胞活力;各组细胞碱性磷酸酶(ALP)活性的检测;Transwell检测各组细胞的侵袭能力;细胞流式术检测各组细胞凋亡情况;细胞流式术检测各组细胞Caspase-3活性;双荧光素酶报告基因检测miR-204和β-catenin、LRP-5间的相互作用;Western blot检测Wnt信号通路相关蛋白表达情况。结果骨质疏松症组小鼠骨密度较对照组和假手术组明显降低(P=0.007,P=0.057),表明骨质疏松症小鼠造模成功。miR-204的表达水平在miR-204模拟物组明显提高(P=0.072),在miR-204抑制剂组下降(P=0.031);miR-204模拟物组成骨细胞活力和ALP活性提高(P=0.007,P=0.043),miR-204抑制剂组成骨细胞活力和ALP活性下降(P=0.007,P=0.035);miR-204模拟物组成骨细胞的侵袭能力明显增强(P=0.006),miR-204抑制剂组成骨细胞的侵袭能力下降(P=0.036);miR-204模拟物组成骨细胞的凋亡能力和Caspase-3活性下降(P=0.041,P=0.045),miR-204抑制剂组成骨细胞的凋亡能力和Caspase-3活性增强(P=0.005,P=0.039);miR-204与β-catenin、LRP-5之间有靶向关系;miR-204模拟物组成骨细胞中β-catenin和LRP-5蛋白表达均上调(P=0.043,P=0.009),miR-204抑制剂组成骨细胞中β-catenin和LRP-5蛋白表达均下调(P=0.041,P=0.032)。结论miR-204可能促进成骨细胞的增殖,激活Wnt信号通路,对骨质疏松症有一定的保护作用。