兔视网膜S抗原的提纯与分析

目的 为研究实验性自身免疫性视网膜葡萄膜炎（ＥＡＵ）的免疫机理及实验性治疗奠定基础。方法 利用二步离子交换层析法提纯Ｓ抗原并进行分析。结果 经分析证实，其分子量为５５０００，等电点（ＰＩ）为６．４０。其氨基酸组成中非极性氨基酸占相当比例。利用扫描隧道电子显微镜，首次对Ｓ抗原的构象进行了观察，初步确定Ｓ抗原为一椭圆球状构象。利用提纯的Ｓ抗原成功地诱发出实验性自身免疫性视网膜葡萄炎ＥＡＵ动物模型。结论     

兔视网膜S抗原的隧道扫描电镜观察

目的：在提纯兔视网膜S抗原的基础上，进一步观察其蛋白质构象，为深入研究该抗原的免疫性打下基础。方法：利用二步离子交换法及高效液相层析法提纯兔视网膜S抗原，采用隧道扫描电子显微镜对S抗原的构象进行分析观察。结果：对S抗原的空间构象进行观察的结果发现，兔视网膜S抗原呈椭圆球状构象，其二维尺寸为7．5nm×5．3nm（X轴×Y轴），与其分子量55000十分相符。确定了S抗原为球蛋白结构。讨论：从我们掌握的文献来看，利用隧道扫描电镜观察S抗原的构象并进行分析，在国内外尚属首次。实验结果表明，S抗原为球蛋白构象。隧道扫描电子显微镜对研究生物样品十分有利，可以使我们观察到更接近生理条件下的分子构象，为研究抗原决定簇，进而研究抗原免疫性提供良好的手段。     

牛视网膜S抗原和IRBP的氨基酸分析

我们用离子交换层析和亲和层析的方法提纯了视网膜S抗原和光感受器间维生素A类结合蛋白(interphotoreceptor retinoid—bindingprotein,IRBP),分析了它们的氨基酸组成及其含量,发现绝大多数氨基酸含量与国外报道的结果相似,对个别氨基酸含量出现较大差别的可能原因及有关问题进行了讨论.     

脲溶性色素相关抗原诱导实验性葡萄膜炎研究

目的 探讨脲溶性牛黑素相关抗原能否在不同大鼠身上诱导实验性自身免疫性葡萄膜炎。 方法 将脲溶性牛黑素相关抗原加弗氏完全佐剂和百日咳杆菌分别免疫Lewis、F344及Wistar大鼠，通过临床观察和组织病理学对动物模型作动态观察比较。 结果 脲溶性牛黑素相关抗原可在Lewis、F344及Wistar大鼠身上诱导出实验性自身免疫性葡萄膜炎，其表现为双眼同时发病，以眼前段为主，个别严重者可伴有局灶性脉络膜炎，不伴视网膜炎和松果体炎，与牛黑素相关抗原所诱发的实验性自身免疫性前葡萄膜炎相类似。Lewis和F344大鼠发病时间及炎症严重程度相似，而Wistar大鼠发病时间较迟，炎症较轻。 结论 脲溶性牛黑素相关抗原可在Lewis、F344和Wistar大鼠身上诱导出实验性自身免疫性前葡萄膜炎。Wistar大鼠与Lewis和F344大鼠相比，发病时间较迟，炎症改变较轻，这种差异可能与遗传背景不同有关。(中华眼底病杂志,1998,14:149-152)     

脲溶性牛黑素相关抗原的提取及其致葡萄膜炎活性的初步研究

目的 探讨眼葡萄膜组织中致葡萄膜炎性的自身抗原。方法 采用生化方法提取牛虹膜睫状体中脲溶性牛黑素相关抗原,对其进行凝胶电泳分析、检测氨基酸组成成分及含量;用脲溶性牛黑素相关抗原加佐剂对F344大鼠和Lewis大鼠进行免疫,诱发实验性脲溶性牛黑素相关抗原诱导的自身免疫性葡萄膜炎（experimental urea soluble farction of the bovine melanin-associated-antigen-induces uveitis,FMIU),并观察脲溶性牛黑素相关抗原的生物活性。结果 脲溶性牛黑素相关抗原相对分子质量约为64000,含有17种氨基酸,可诱发F344大鼠和Lewis大鼠的EMIU,炎性反应主要发生在前葡萄膜,严重者可伴发局灶性脉络膜炎,不伴有视网膜炎和松果体炎。结论 脲溶性牛黑素相关抗原可能是葡萄膜组织中致葡萄膜炎性活的主要自身抗原,其诱发的EMIU有别于视网膜可溶性抗原所诱导的实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎,不伴视网膜炎和松果体炎。     

Dispase金属蛋白酶诱导的兔增殖性玻璃体视网膜病变模型

目的建立并评价dispase诱导的增殖性玻璃体视网膜病变(proliferativevitreoretinopathy,PVR)动物模型。方法选择健康成年的青紫蓝兔40只,右眼分别行玻璃体腔注射dispase0.05ml,按注射浓度不同,随机分成4组,A组(0.05U)、B组(0.075U)、C组(0.1U)、D组(0.2U)。左眼分别注射PBS0.05ml作为对照。术后第3小时、第1天、第7天至第70天每周进行眼部检查。检查项目包括裂隙灯、间接眼底镜和眼底照相。在处死动物后,典型的PVR眼进行组织病理学检查及增殖细胞核抗原(proliferatingcellmuclearantigen,PCNA)免疫组织化学染色。结果术后3h所有dispase眼均见视网膜前或玻璃体出血。大约在3周后,dispase眼依次出现视网膜前膜、髓线和血管抬高、固定视网膜皱折以及牵拉性视网膜脱离。组织病理学见视网膜前增殖膜对视网膜的牵拉以及视网膜结构的紊乱。在dispase注药后2周,视网膜节细胞层抗增殖细胞核抗原(PCNA)呈阳性表达,4周时内核层细胞表达阳性,至发生视网膜脱离后视网膜色素上皮开始表达PCNA。对照组未见PVR发生,也未见PCNA的阳性表达。结论Dispase可以在不使用外源性细胞、生长因子和细胞因子的情况下诱导视网膜细胞增殖从而建立PVR模型,操作简单且成功率高。     

癌症相关性视网膜病变的自身免疫机制

癌症相关性视网膜病变 (CAR)是指非眼部原发肿瘤的占位压迫或肿瘤转移所致的一种视网膜变性疾病，为机体癌症的远部效应。自身免疫在CAR发病中起重要作用。其中抗恢复蛋白抗体、抗a-烯醇化酶抗体、抗热休克蛋白抗体与CAR的相互关系引起 了较多关注。糖皮质激素疗法、血浆过滤疗法、针对恶性肿瘤的放射或化学药物治疗、免疫球蛋白、免疫调节剂等均已试用于CAR的治疗。但其确切发病机制以及有效的治疗方法仍需进一步的系统研究。（中华眼底病杂志，2004，20：267-269）     

视网膜母细胞瘤组织直接免疫制备抗人视网膜母细胞瘤单克隆抗体及其抗原特性的实验研究

目的 研究新鲜视网膜母细胞瘤（retinoblastoma,Rb)细胞制备的抗人Rb单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb)的抗原特性。方法 利用手术中获得的新鲜Rb组织细胞制备成细胞悬液,并将其注射入3呈BALB－C小鼠腹腔中,免疫小鼠。取其脾淋巴细胞与SP2／0骨瘤细胞融合,以抗原的性质进行检测,观察McAb相应抗原蛋白在Rb组织中的表达。结果 经反复单细胞克隆化操作及抗体特异性筛选,共获得3株能持续,稳定分泌抗人Rb McAb的杂交瘤细胞系。其中3C6株杂交瘤细胞在体外经≥2年反复冻存,传代培养,仍能稳定分泌特异性强,效价高的抗体,为IgG1亚类。免疫荧光及免疫组化检测结果显示,McAb3C6相应抗原蛋白在Rb组织中呈强阳性表达,而在其他肿瘤及正常组织中无表达。免疫印迹法检测表明,McAb3C6相应抗原蛋白相分子质量约25000。结论 采用新鲜的实体瘤细胞制备的抗人Rb McAb 3C6在Rb组织中呈高度特异性表达,与其他肿瘤及正常眼组织无交叉反应,其所针对的抗原蛋白相对分子质量约为25000,提示可能有新的基因参与Rb肿瘤的发生。     

视网膜母细胞瘤增殖细胞核抗原的免疫组织化学研究

目的：研究视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，RB)细胞的增殖活性与RB组织学分型和浸润能力的关系。 方法：应用链霉亲和物素蛋白-生物素酶标免疫组织化学方法(LSAB法)对48例RB组织中增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)的表达进行分析。 结果：12例分化型RB组织平均PCNA标记指数(labelling index，L1)明显低于36例未分化型(P<0.05)；22例视神经浸润组RB组织平均PCNA LI明显高于26例视神经未浸润(P<0.05)。表明PCNA LI与RB组织学分型及浸润能力相关。 结论：测定PCNALI对于判断RB的组织学特性和生物学行为具有一定意义。 （中华眼底病杂志，1997，13：10-11）     

人视网膜S-AgP35诱发EAU动物模型的建立

目的 采用合成的人视网膜S-Ag多肽片断第35段抗原决定簇(HS-AgP35)在Lewis大鼠建立实验性葡萄膜炎(EAU)模型.方法 雌性Lewis大鼠30只,随机分成3组,每组10只.两实验组中HS-AgP35和BS-Ag分别与CFA混合,致敏Lewis大鼠,正常对照组不做处理.观察大鼠眼部体征和组织病理学改变;ELISA方法 检测大鼠血清中抗HS-AgP35/BS-Ag抗体水平;RT-PCR方法 检测大鼠脾组织内IL- 4和IFN-γ mRNA表达水平.结果 两种抗原均能致Lewis大鼠发生EAU,HS-AgP35组100%发病,BS-Ag组60%发病,两者比较差异无统计学意义(P＞0.05);HS-AgP35组大鼠发病早(P＜0.01),眼部体征和组织病理学改变严重(P＜0.01),持续时间长(P＜0.01).两实验组大鼠血清中抗BS-Ag/HS-AgP35抗体水平均高于正常对照组(P＜0.01),HS-AgP35组高于BS-Ag组(P＜0.05).两实验组大鼠脾组织中IFN-γ mRNA表达水平均高于正常对照组(P＜0.01);HS-AgP35组IL- 4 mRNA表达较高(P＜0.01),BS-Ag组无明显变化(P＞0.05).结论 抗原特异性高的HS-AgP35能诱导Lewis大鼠发生EAU,可建立具有典型眼部表现和组织病理学改变的动物模型.     

CD147、基质金属蛋白酶-2和血管内皮生长因子在氧诱导视网膜病变大鼠中的表达

目的 观察CD147、基质金属蛋白酶（MMP）-2和血管内皮生长因子（VEGF）在氧诱导视网膜病变大鼠中的表达。方法 84只新生Wistar大鼠纳入研究。将其随机分为高氧组和对照组。每组42只大鼠。高氧组建立氧诱导视网膜病变模型;对照组不做任何处理。大鼠7、14日龄时,取眼球行视网膜铺片,观察视网膜血管形态。大鼠14日龄时,取眼球行视网膜石蜡切片,计数突破内界膜的内皮细胞核数。大鼠12、14、16日龄时,取眼球行免疫组织化学染色,检测大鼠视网膜组织中CD147、MMP-2和VEGF的表达。采用双因素相关分析法分析CD147表达与MMP-2、VEGF表达的相关性。结果 大鼠7日龄时,对照组大鼠视网膜血管呈放射状分布,血管径较粗;高氧组大鼠视网膜血管收缩,大面积无血管区,仅见少量小面积的血管网。大鼠14日龄时,对照组大鼠视网膜血管发育较好,网格规整;高氧组大鼠视网膜血管增生、纡曲、扩张,并在灌注区与非灌注区交界处形成新生血管丛、渗出、出血。大鼠14日龄时,对照组、高氧组突破内界膜的内皮细胞核数分别为（1.30±1.26）、（19.70±3.56）个;两组比较,差异有统计学意义（t=21.813,P＜0.01）。免疫组织化学染色结果显示,对照组大鼠视网膜各层可见CD147、MMP-2、VEGF有少量表达;高氧组大鼠视网膜各层可见CD147、MMP-2、VEGF有大量表达。大鼠12、14、16日龄时,两组大鼠视网膜各层中CD147（t=5.612、11.390、6.355）、MMP-2（t=4.122、8.047、4.422）、VEGF（t=4.955、12.176、5.110）表达比较,差异均有统计学意义（P＜0.01）。相关性分析发现,CD147的表达与MMP-2、VEGF的表达均呈正相关(r=0.755、0.820,P＜0.01）。 结论 CD147、VEGF、MMP-2在氧诱导视网膜病变大鼠中有大量表达。     

抗肿瘤坏死因子-α单克隆抗体治疗实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎的研究

目的 观察抗肿瘤坏死因子-α单克隆抗体（TNF-α MCAb）对于实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎（EAU）的治疗作用。方法 合成光感受器间维生素A类结合蛋白（IRBP）R16多肽片段，联合免疫佐剂诱导EAU动物模型。按照注射次数不同将大鼠分为2组，分别于IRBP R16免疫后的第6天和第4、6、8天自大鼠尾静脉注入TNF-α MCAb，裂隙灯显微镜观察其眼部临床表现，同时设未治疗组大鼠作为对照。于IRBP R16免疫后第13天测量迟发型超敏反应（DTH），并于第14天处死大鼠，取眼球行组织病理检查。应用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测抗体注射后14 d 时大鼠血清中Th1类细胞因子γ-干扰素（IFN-γ）、Th2类细胞因子白细胞介素-4（IL-4）水平以及房水中IFN-γ水平。测量引流淋巴结细胞的抗原特异性淋巴细胞增生反应。结果 TNF-αMCAb治疗组大鼠的眼部炎症较未治疗组明显减轻，病理分级下降；房水和血清中IFN-γ水平降低，血清中IL-4增高；DTH反应下降；引流淋巴结细胞对IRBP R16多肽刺激的增生反应下降，差异均有统计学意义（P＜0.01）。与单次注射相比，3次注射的治疗效果更显著（P＜0.05）。结论 TNF-αMCAb能够有效减轻EAU大鼠眼部的炎症反应和特异性细胞免疫反应，改变Th1/Th2细胞因子平衡；多次应用作用更显著。     

视网膜母细胞瘤的S－抗原免疫活性研究

应用牛视网膜可溶性抗原的一株单克隆抗体－ＡｇＣ＿６对１０例中国人视网膜母细胞瘤进行了免疫组织化学研究。Ｓ－抗原的免疫活性以不同的形式存在于此１０例肿瘤标本中。有３例嵌顿于肿瘤的“正常”视网膜光感受器成分中，显示Ｓ－抗原免疫活性，７５％的花环样、Ｅ－Ｗ玫瑰花环及５０％病例的散在肿瘤细胞呈阳性染色。我们认为Ｓ－折原在视网膜母细胞瘤中的表达程度可以作为检测该肿瘤分化程度的依据之一，成为其另一肿瘤标记。     

氧诱导视网膜病变小鼠模型微小RNA表达谱分析

目的 分析氧诱导视网膜病变(OIR)小鼠模型的微小RNA表达谱,筛选可能与视网膜新生血管(RNV)形成有关的微小RNA.方法 7日龄健康C57BL/6J小鼠52只随机分为正常对照组和OIR组,每组26只.OIR组建立OIR小鼠模型;正常对照组不做任何处理.小鼠17日龄时,行视网膜铺片,观察视网膜血管形态;行视网膜石蜡切片,计数突破内界膜的视网膜血管内皮细胞核数;行微小RNA芯片分析,检测具有差异表达的微小RNA,再应用实时聚合酶链反应(RT-PCR)进行验证.结果 正常对照组小鼠视网膜血管平滑、均匀有序分布;OIR组小鼠周边视网膜血管纡曲、紊乱并伴有新生血管芽,中央视网膜无灌注区明显.正常对照组、OIR组小鼠视网膜无灌注区的相对面积分别为(6.57±3.6)％、(25.81±2.12)％;OIR组小鼠视网膜无灌注区的相对面积较正常对照组明显增大,差异有统计学意义(t=28.71,P＜0.001).光学显微镜观察发现,正常对照组小鼠内界膜结构完整、平滑,血管内皮细胞排列整齐,偶见突破内界膜的血管内皮细胞核.正常对照组、OIR组平均每张切片突破内界膜的视网膜血管内皮细胞核数分别为(0.16±0.31)、(28.41±4.01)个.两组平均每张切片突破内界膜的视网膜血管内皮细胞核数比较,差异有统计学意义(t=54.45,P＜0.001).微小RNA芯片分析结果显示,与正常对照组比较,OIR组有21个微小RNA的表达发生了1.5倍以上的变化.其中,上调者9个,下调者12个.差异表达倍数≥3.0的微小RNA为miR-3078、miR-140、miR-29b、miR-29c.RT-PCR检测发现,差异表达倍数≥3.0的4个微小RNA,其表达趋势与芯片分析结果一致.与正常对照组比较,OIR组miR-3078的表达明显上调,差异有统计学意义(t=-2.380,P＜0.05);miR-140、miR-29b、miR-29c的表达明显下调,差异也有统计学意义(t=2.638、2.323、2,415,P＜0.05).结论 OIR小鼠模型的微小RNA表达谱中,miR-3078、miR-140、miR-29b、miR-29c的差异表达倍数≥3.0,其可能与RNV形成有关.     

口服免疫耐受预防实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎中细胞因子网络的研究

目的 观察口服免疫耐受预防大鼠实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎(EAU)过程中血清以及脾细胞培养上清液中的Th1类细胞因子干扰素（IFN）-γ、白细胞介素（IL）-2和Th2类细胞因子IL-4、IL-10表达水平。方法 Lewis大鼠72只随机分为EAU组、口服视网膜S抗原10、100μg组和1、10 mg组、对照组，每组各12只大鼠。其中，EAU组用视网膜S抗原50μg和弗氏完全佐剂免疫诱导EAU模型，口服10、100 μg组和1、10 mg组，分别插管喂饲视网膜S抗原10、100 μg，1、10 mg和1 mg胰蛋白酶抑制剂的混合液1 ml，隔日1次，共7次，然后按上述方法诱导EAU；对照组插管喂饲磷酸盐缓冲液和1 mg胰蛋白酶抑制剂的混合液1 ml，隔日1次，共7次，然后诱导EAU。观察每组大鼠眼部EAU的临床表现。在EAU高峰期取大鼠眼球，进行病理分级。同时取大鼠血清，分离脾细胞，培养后取上清液，用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清以及脾细胞培养上清液中IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10细胞因子的水平。结果 100μg、1 mg组血清中Th1类细胞因子IFN-γ、IL-2浓度降低，Th2类细胞因子IL-4、IL-10的浓度增高，与EAU组和对照组比较，差异均有统计学意义（F=51.9, 68.8, 35.7,7.5,P＜0.01）；10 μg、10 mg组血清中Th1、Th2类细胞因子与EAU组和空白对照组比较，差异无统计学意义。与EAU组和空白对照组相比，100 μg、1 mg组大鼠脾细胞培养上清液中Th1类细胞因子IFN-γ和IL-2的浓度降低，Th2类细胞因子IL-4、IL-10的浓度增高，与EAU组和对照组比较，差异均有统计学意义（F=57.1,15.6,33.1,167.7, P＜0.01）；10 μg、10 mg组大鼠脾细胞培养上清液血清中Th1、Th2类细胞因子与EAU组和空白对照组比较，差异无统计学意义。结论 口服免疫耐受预防EAU过程中，Th1类细胞因子IFN-γ和IL-2的表达降低，而Th2类细胞因子IL-4、IL-10的表达增高。口服过高或过低剂量抗原不能预防EAU，细胞因子的表达水平也无明显改变。提示细胞因子在口服免疫耐受预防EAU的过程中起到重要作用。     

细胞因子信号抑制因子在实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎外周血单个核细胞内的表达变化

目的 观察和探讨细胞因子信号抑制因子（SOCS)在实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎（EAU）外周血单个核细胞（PBMC）内的表达及意义。方法 光感受器间维生素A 类结合蛋白(IRBP)免疫100只Lewis大鼠诱导EAU动物模型，随机分为对照组和治疗组。治疗组从免疫后第1天至第28天，给予环孢霉素A（CSA）灌胃，20 mg/（kg·d）；对照组给予等量生理盐水。免疫前、免疫后7、14、21、28 d采用裂隙灯显微镜观察大鼠眼部变化并抽取其心脏血，酶联免疫吸附试验（ELISA）方法检测血清白细胞介素（IL）-4、IL-12、干扰素（IFN）-γ的含量；实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）和蛋白免疫印迹法检测PBMC内SOCS mRNA和蛋白表达。结果免疫后14 d 时炎症最明显。对照组可见明显的虹膜睫状体炎，治疗组前房轻微炎性渗出，但无虹膜后粘连及前房积脓。对照组血清中 IL-12、IFN-γ免疫后14 d达到最高峰，28 d下降到基础水平，治疗组在免疫后14 d达到高峰，但是升高程度明显低于对照组，其他时间点与免疫前比较无差异；IL-4在对照组中下降不明显，治疗组在整个病程中呈上升趋势。SOCS1、SOCS5 mRNA免疫后14 d表达最高，对照组分别是免疫前的4.05和3.83倍，治疗组分别为1.15和1.16倍；两组中含SH2结构的细胞因子诱导蛋白（CIS）与SOCS3 mRNA轻度升高，对照组较治疗组略明显。对照组中SOCS1、SOCS5蛋白在免疫后7、14、21 d时显著高于免疫前，CIS、SOCS3蛋白在免疫后14、21 d显著高于免疫前；治疗组中仅SOCS1蛋白在免疫后14 d显著高于免疫前，其他时间点较免疫前无明显改变。 结论 SOCS1、SOCS5水平升高与EAU发生过程中的Th1型反应增强有关，CIS、SOCS3水平轻度升高可能是存在着Th2细胞反应的增强以对抗Th1细胞反应，实现动态免疫平衡。     

基因工程视网膜母细胞瘤动物模型的建立

视网膜母细胞瘤（Rb）是人类特有的一种视网膜肿瘤,为了深入研究其发病机制,有必要建立遗传性Rb动物模型。笔者综合分析多个基因工程Rb动物模型的实验结果,简要介绍应用基因工程技术建立Rb动物模型的最新研究进展。认为Rb的发生不仅是Rb1基因的缺失,尚有其他基因的协同作用。