苦荞麦总黄酮对胰岛素抵抗状态EA.hy926细胞ADMA/PRMTⅠ/eNOS/NO的影响

目的研究苦荞麦总黄酮对胰岛素抵抗状态EA.hy926细胞内NO、不对称二甲基精氨酸(asymmetric dimethyl arginine,ADMA)的合成及相关基因PRMTⅠ、e NOS表达的影响。方法将培养的EA.hy926细胞分为正常对照组、模型组、苦荞麦总黄酮组及二甲双胍组。采用硝酸还原酶法测定细胞培养基中NO的含量;采用双抗体夹心法测定细胞中ADMA的含量,采用RT-PCR以及免疫印迹(western blot)法分别测定各组细胞e NOS及PRMTⅠmRNA和蛋白的表达。结果同正常组相比,模型组细胞培养基中NO含量明显降低(P<0.01),细胞中ADMA含量显著升高(P<0.01),e NOS mRNA及蛋白表达明显降低(P<0.01),PRMTⅠmRNA和蛋白的表达显著升高(P<0.01);同模型组相比,苦荞麦总黄酮组及二甲双胍组以上指标均有明显改善,两组之间无明显差异。结论苦荞麦总黄酮通过降低胰岛素抵抗状态EA.hy926细胞PRMTⅠmRNA及蛋白的表达,降低细胞中ADMA的含量,提高eNOS mRNA及蛋白表达,使NO合成增多,改善胰岛素抵抗。     

红车轴草总黄酮对H_2O_2诱导的血管内皮细胞损伤的保护作用

目的观察红车轴草总黄酮对H2O2诱导的血管内皮细胞损伤的保护作用,并探讨其可能的作用机制。方法利用体外培养的人脐静脉血管内皮细胞ECV-304,采用H2O2诱导细胞损伤模型,观察红车轴草总黄酮对H2O2所致的血管内皮细胞损伤的保护作用。MTT法检测细胞存活率、试剂盒测定细胞中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性及细胞中丙二醛(MDA)的含量、乳酸脱氢酶(LDH)的漏出量;荧光法检测Caspase-3的活性;Hoechst33342及PI荧光染色法观察红车轴草总黄酮对H2O2诱导血管内皮细胞凋亡的影响;JC-1染色法检测红车轴草总黄酮对H2O2损伤血管内皮细胞线粒体膜电位的影响,检测各组细胞内ROS的表达水平。结果与空白对照组相比,H2O2损伤组细胞存活率降低、细胞内LDH,漏出量增加(P<0.001);抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px活性降低、MDA含量升高(P<0.01);Caspase-3活性升高(P<0.001)、ROS含量升高、线粒体膜电位降低;与模型组相比,红车轴草总黄酮各剂量组(12.5、25、50mg.L-1)及槲皮素组(30 mg.L-1)细胞存活率明显增加(P<0.01,P<0.05),红车轴草总黄酮各剂量组(12.5、25、50 mg.L-1)及槲皮素组(30 mg.L-1)均能明显降低LDH漏出量(P<0.01,P<0.05)、明显增强SOD、CAT及GSH-Px活力(P<0.01,P<0.05)、降低MDA、ROS含量及Caspase-3活性(P<0.05,P<0.01)、升高线粒体膜电位(P<0.01)。结论红车轴草总黄酮对H2O2诱导的内皮细胞损伤有明显的保护作用,其初步作用机制可能与抗自由基,减轻脂质过氧化、降低Caspase-3活性及稳定线粒体膜电位有关。     

二甲双胍对胰腺癌BxPC-3细胞恶性表型的影响

目的:探索二甲双胍对胰腺癌BxPC-3细胞恶性表型的影响。方法:以Smad4基因天然缺失型人胰腺癌BxPC-3细胞为对象,采用CCK-8法和流式细胞术分别检测不同剂量二甲双胍(5、10、20 mmol/L)作用24 h后的细胞增殖和凋亡情况,并计算细胞存活率和凋亡率;采用Transwell迁移试验检测不同剂量二甲双胍(10、20 mmol/L)作用24 h后的细胞迁移情况,记录迁移细胞数;采用实时定量聚合酶链反应法和Western blotting法分别检测细胞中钙黏着蛋白E(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、补体反应基因32(RGC-32)的mRNA及蛋白表达情况。结果:与对照组和5 mmol/L二甲双胍组比较,10、20 mmol/L二甲双胍组细胞的存活率均显著降低,凋亡率均显著升高,且20 mmol/L二甲双胍组细胞的凋亡率显著高于10 mmol/L二甲双胍组(P<0.05)。与对照组比较,10、20 mmol/L二甲双胍组迁移细胞数均显著减少,且20 mmol/L二甲双胍组显著少于10 mmol/L二甲双胍组(P<0.05);10、20 mmol/L二甲双胍组细胞中E-cadherin mRNA及其蛋白的相对表达量均显著升高,且20 mmol/L二甲双胍组E-cadherin mRNA的相对表达量显著高于10 mmol/L二甲双胍组;10 mmol/L二甲双胍组细胞中Vimentin mRNA,20 mmol/L二甲双胍组细胞中Vimentin mRNA及其蛋白以及10、20 mmol/L二甲双胍组细胞中RGC-32 mRNA及其蛋白的相对表达量均显著降低,且20 mmol/L二甲双胍组Vimentin mRNA及其蛋白、RGC-32 mRNA的相对表达量均显著低于10 mmol/L二甲双胍组(P<0.05或P<0.01)。结论:二甲双胍可剂量依赖性地通过Smad4非依赖性通路抑制BxPC-3细胞的增殖和迁移,促进其凋亡,这可能与胰腺癌细胞上皮间质转化过程以及RGC-32表达受到抑制有关。     

黄芪甲苷调控自噬抑制缺氧缺糖/复氧复糖HT22细胞凋亡

目的探讨黄芪甲苷通过调控自噬,对缺氧缺糖/复氧复糖HT22细胞凋亡的影响。方法将HT22细胞随机分为正常组(Control)、模型组(Model)、溶剂对照组(DMSO)、黄芪甲苷组(AS-IV)、黄芪甲苷组加正常细胞组(AS-IV+N)、黄芪甲苷加自噬抑制剂组(AS-IV+3-MA)、自噬抑制剂组(3-MA)、自噬激活剂组(Rapa)。除正常组外,其余各组细胞均在缺氧缺糖6 h后复氧复糖。镜下观察细胞形态,CCK-8法检测细胞存活率,LDH法检测细胞损伤,免疫荧光染色检测细胞凋亡。结果与正常组比较,模型组细胞胞体突触减少,细胞皱缩,细胞间连接减少;细胞存活率明显降低,LDH漏出率、Bax/Bcl-2明显升高(P<0.01)。与模型组比较,AS-IV组、Rapa组细胞存活率明显升高,LDH漏出率、Bax/Bcl-2明显降低(P<0.01);3-MA组细胞存活率明显降低,Bax/Bcl-2明显升高(P<0.01);AS-IV+3-MA组无明显差异。结论黄芪甲苷可通过激活自噬,抑制缺氧缺糖/复氧复糖HT22细胞凋亡。     

二甲双胍与二氯乙酸盐对MYCN扩增神经母细胞瘤BE-2C细胞的协同抗肿瘤作用

目的研究二甲双胍和二氯乙酸盐(dichloroacetate,DCA)单独与联合应用,对MYCN扩增神经母细胞瘤BE-2C细胞增殖的抑制作用及其作用机制。方法 CCK-8法检测二甲双胍与DCA单独或联用对BE-2C细胞增殖的抑制作用;采用葡萄糖和乳酸测定试剂盒,检测葡萄糖吸收量和乳酸生成量的变化;Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡; Western blot分析凋亡相关蛋白的表达变化。结果二甲双胍和DCA对BE-2C细胞增殖均具有明显的抑制作用,联用组的葡萄糖消耗和乳酸的产生量较二甲双胍单独用药组明显减少(P<0. 01);联用组的细胞凋亡率较单独用药组均明显升高(P<0. 01);联用组细胞的Bax、cleaved caspase-3蛋白表达水平较单用组均明显增加,而Bcl-2蛋白表达水平较单用组明显降低。结论二甲双胍联用DCA对MYCN扩增神经母细胞瘤BE-2C细胞具有协同抗肿瘤作用,且与减少二甲双胍引起的乳酸堆积和诱导肿瘤细胞发生凋亡有关。     

二甲双胍联合马法兰抑制多发性骨髓瘤细胞增殖作用的实验性研究

目的探讨二甲双胍联合马法兰抑制多发性骨髓瘤细胞增殖作用的效果。方法选择骨髓瘤细胞株RPMI8226和U266作为研究细胞株,将不同浓度的二甲双胍与马法兰联合作用于细胞株24、48、72 h,采用CCK-8法检测二甲双胍与马法兰对骨髓瘤细胞株增殖的影响,采用流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果当二甲双胍和马法兰浓度为80 mmol/L时,培养24、48、72 h的RPMI8226细胞株凋亡率均显著高于浓度为20mmol/L和5 mmol/L(P<0.05);当二甲双胍和马法兰浓度为80 mmol/L时,培养24、48、72 h的U266细胞株凋亡率均显著高于浓度为20 mmol/L和5 mmol/L(P<0.05);观察组C骨髓瘤细胞RPMI8226、U266凋亡率均显著高于观察组A、观察组B,且当二甲双胍和马法兰浓度为80 mmol/L时,培养24、48、72 h的U266细胞株凋亡率均显著高于浓度为20 mmol/L和5 mmol/L。结论二甲双胍与马法兰联合使用抑制多发性骨髓瘤细胞增殖作用的效果明显,可有效促使细胞凋亡,可在临床上广泛推荐应用。     

二甲双胍对血管内皮细胞磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶和一氧化氮含量的影响

目的观察二甲双胍(降血糖药)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(P-AMPK)表达和一氧化氮含量的影响。方法将体外培养的人脐静脉内皮细胞分为6组:①空白对照组(常规培养);②二甲双胍(Met)2 mmol·L-1组;③软脂酸(PA)300μmol·L-1组;④软脂酸300μmol·L-1+二甲双胍2 mmol·L-1组;⑤5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸(AIC-AR)1 mmol·L-1组及⑥软脂酸300μmol·L-1+AICAR 1 mmol·L-1组,经孵育24 h后,收集细胞和培养上清液,用Western blot方法,测定各组的AMPK的表达;用硝酸盐还原法,观察各组培养上清液中的一氧化氮的含量。结果与空白对照组比较,Met组AMPK的磷酸化表达水平升高,培养上清液中NO生成增加。(Met+PA)组AMPK的磷酸化表达水平升高,NO生成增加。结论二甲双胍通过激活AMPK使NO生成增加,改善HUVECs的内皮功能,从而起到抗动脉粥样硬化的作用。     

二甲双胍增强Ishikawa细胞对顺铂化疗敏感性的实验研究

目的观察二甲双胍体外增强顺铂对子宫内膜癌Ishikawa细胞化疗敏感性的作用,并探讨可能的作用机制。方法实验分为空白对照组、二甲双胍组(培养液中二甲双胍终浓度为10mmol/L)、顺铂组(培养液中顺铂终浓度为20μmol/L)、联合组(培养液中二甲双胍和顺铂的终浓度分别为10mmol/L和20μmol/L),各组作用24h,CCK-8法和细胞克隆形成法检测细胞增殖抑制率和存活率,金氏公式评价二药协同效果;Transwell法检测细胞侵袭力;流式细胞仪检测细胞周期分布及凋亡率;蛋白质印迹法检测葡萄糖调节蛋白(GRP)78蛋白表达水平。结果二甲双胍、顺铂均可抑制Ishikawa细胞增殖、诱导细胞凋亡、降低细胞存活率和侵袭力;二甲双胍可阻滞细胞周期于G0/G1期,顺铂单独或联用二甲双胍可阻滞细胞周期于G2/M期,并能下调GRP78蛋白表达水平(P<0.05),二药联用上述作用效果更为显著(P<0.01)。结论二甲双胍能够增强顺铂对子宫内膜癌Ishikawa细胞的化疗敏感性,这种作用部分是通过下调GRP78蛋白实现的。     

没食子儿茶素没食子酸酯对百草枯诱导SK-N-SH细胞凋亡的保护作用

目的探讨茶多酚中主要活性成分没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对百草枯诱导人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞凋亡的保护作用。方法培养的SK-N-SH细胞给予400μmol·L-1百草枯诱导细胞凋亡。实验分为6组:空白对照组、百草枯模型组、维生素E(10μmol·L-1)组和3个EGCG(1、5、10μmol·L-1)剂量组。以药物处理细胞2h后,加入百草枯,72h后MTT法检测细胞活力,取培养细胞上清液测定乳酸脱氢酶(LDH)漏出量,Hoechst 33258荧光染色法和流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果与空白对照组相比,百草枯明显降低细胞活力(P<0.01),增加LDH漏出量(P<0.01),细胞膜结构不完整,出现空泡等凋亡现象,细胞凋亡发生率达到30.5%。EGCG处理后,显著提高细胞活力,减少LDH的漏出和降低细胞凋亡率(P<0.01),其中10μmol·L-1组的作用明显高于5μmol·L-1组或1μmol·L-1组(P<0.05或P<0.01)。结论EGCG具有抑制百草枯诱导的SK-N-SH细胞凋亡作用。     

内质网应激信号通路在棕榈酸诱导的血管内皮细胞凋亡中的作用

目的探讨内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)信号通路在棕榈酸诱导的人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)凋亡中的作用。方法不同浓度(0.1、0.2、0.4、0.8 mmol·L~(-1))棕榈酸刺激HUVECs(0、12、24、48 h),CCK-8法检测血管内皮细胞增殖能力;免疫印迹法检测血管内皮细胞GRP78、CHOP、PERK、IRE1、ATF6等ERS信号通路蛋白的表达水平;免疫荧光法检测细胞内凋亡水平。结果 0.4 mmol·L~(-1)棕榈酸刺激血管内皮细胞24 h,细胞增殖率明显降低;GRP78、CHOP、PERK、IRE1、ATF6等ERS信号通路蛋白的表达明显升高(P<0.05),细胞凋亡水平明显增高(P<0.05);ERS抑制剂4-苯基丁酸(4-PBA,10 mmol·L~(-1))预处理组血管内皮细胞凋亡水平明显下调(P<0.05)。结论 ERS信号通路在棕榈酸所致血管内皮细胞凋亡的防治中有重要意义。