PJ-CW对细胞因子活化的杀伤细胞表型及细胞毒活性的影响

本文介绍我室有关LAK、TIL的体外诱导与活性调节研究及脐血CIK细胞诱导的初步研究.制备LAK-CM与PHA-CM(略)将TIL细胞(2×10~5/ml)分悬于含IL-2(500μ/ml)和/或PJ-CW(25μg/ml)的培液中置37℃,5%CO_2环境中培养,于培养后不同时间测定细胞扩增速度,并于第9天测定TIL细胞表型的变化(采用APAAP法与荧光检测法)及对自体肿瘤细胞与瘤靶细胞的杀伤活性(MIT显色法).将脐血淋巴细胞(1×10~6/ml)分别置含IL-2(2000μ/ml)和/或PJ-CW(25μg/ml)的环境中常规孵育,并于孵育后第5天进行表型分析(方法同前)及细胞毒活性测定.分离脐血淋巴细胞,于培养的不同时间分别加入rIFN-γ(1000U/ml),CD3MAB(20μl/ml),IL-2(300U/ml)及IL-1(100U/ml),测定其表型(方法同前).     

血清IL-2水平对胸水TIL细胞体外扩增及活性的影响

目的通过对血清白介素-2(interleukine-2,IL-2)水平的检测,了解内源性IL-2水平对胸水TIL细胞体外扩增及抗肿瘤活性的影响.方法对54例有恶性胸水患者,第一次抽胸水时无菌收集胸水,进行TIL细胞培养,并同时进行血清IL-2水平检测.TIL细胞体外杀瘤活性用MTT法检测,血清IL-2的水平用ELISA法检测.将IL-2水平较高的27例患者分为1组,IL-2水平较低的27例患者分为另1组,比较两组患者胸水TIL细胞体外增殖速度及杀瘤活性.结果血清IL-2水平较低组,TIL细胞体外培养8天后扩增59.3±20.9倍,培养12天后扩增112.5±32.9倍,明显高于IL-2水平较高组的24.0±11.0倍和62.5±21.9倍.IL-2水平较低组TIL细胞体外杀瘤率为45.3±9.5%,明显高于IL-2水平较高组的26.7±7.3%,P＜0.05.结论血清IL-2水平高低与TIL细胞体外增殖的速度及其杀瘤活性明显相关,IL-2水平较低的患者胸水中TIL细胞体外增殖的速度较快,杀瘤活性较强.血清IL-2水平可望作为恶性胸水IL-2/TIL治疗选择的指标.     

癌性胸水肿瘤浸润淋巴细胞的增殖力、表型和杀伤细胞活性的研究

探讨癌性胸水中肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的生物学特性,便于更好地应用于临床.用低浓度白细胞介素2(IL-2)诱导培养癌性胸水TIL,按常规法计数TIL细胞增殖量,采用流式细胞仪分析TIL细胞表型及MTT法检测其杀伤细胞活性.经低浓度IL-2(10U/ml)诱导培养TIL21d后,TIL增殖倍数为2130±1140,大于1000倍占72%.CD3无显著性变化(P>0.05),CD4,CD8有显著性差异(P<0.01),而CD4/CD8     

IFN-β临床应用研究进展

利用脂质体包被IL-2理论上能达到IL-2用量小、副作用少、疗效提高等效果.们前期应用脂质体IL-2联合CD3AK细胞治疗鼠肝黑色素转移瘤,取得了满意的实验结果.在此基础上,再探讨脂质体IL-2联合TIL、CY抗鼠肝癌的作用,旨在证明脂质体IL-2的优越性.1 材料与方法制备鼠H22肝癌皮下荷瘤模型,然后采用机械、酶消化和不连续密度梯度离心分离获得TIL,体外掺入rIL-2(1000U/ml)后培养、扩增.参照Konno及我所建立的制备脂质体方法制备复层大囊泡rIL-2脂质体(MLV-rIL-2).取昆明鼠40只随机分4组(即对照组、TIL CY组、TIL CY rIL-2组、TIL CY MLV-rIL-2组),每组10只进行体内治疗.后3组治疗开始前3天均用环磷酰胺(CY)腹腔注射,每日1次CY50mg/kg,然后尾静脉注射TIL,每次每只     

两种不同成分培养基制备CIK细胞的生物学特征

目的:采用细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer cell,CIK cell)培养基(含低浓度IL-2、IFN-γ、IL-12和anti-CD3)和NK培养基(含高浓度IL-2和anti-CD3)体外刺激诱导CIK,分析CIK细胞的扩增、表型和细胞因子分泌情况。方法:健康自愿者来源的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),分别加入CIK培养基和NK培养基进行诱导培养,24 h后,换用含IL-2的1%自体血浆培养基继续诱导培养2周。在培养的第6天和第10天检测培养上清中IFN-γ的分泌情况,在培养的第10天以流式细胞术检测两组培养细胞表面CD3、CD4、CD8、CD16、CD56的表达情况。结果:CIK培养基和NK培养基均可使培养细胞在第7天时开始明显扩增,第10天时可扩增至200倍。其中,CIK培养基获得的细胞扩增倍数明显高于NK培养基,其IFN-γ分泌明显高于NK培养基组[(724.7±434.8)vs(108.9±60.6)pg/ml,P<0.01];而以NK培养基培养的细胞,CD3-CD16+CD56+细胞比例高于CIK培养基[(6.27±3.33)%vs(2.88±1.88)%,P<0.05]。结论:不同成分的CIK培养基和NK培养基均可促进CIK细胞的扩增和成熟,但呈现不同的生物学特征。     

从人结直肠癌中分离的肿瘤浸润淋巴细胞体外培养时表型的动态变化

Rosenberg 等报道,他们研究发现直接从手术切除标本中分离的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)杀伤活性比从外周血单个核细胞活化而来的淋巴因子激活细胞(LAK)要强50～100倍。然而从人结直肠癌中分离 TIL 的报道还不多。为了了解 TIL 活化的最佳培养与刺激条件,本文作者研究了从人结直肠癌中分离的 TIL,在体外培养时经 IL-2,及PHA 刺激后其表型与杀伤活性的动态变化。作者从5例结直肠腺癌手术切除标本中分离出肿瘤浸润淋巴细胞体外培养,首先用植物血凝素(PHA-P,最终浓度0.1%)。这是白细胞介素2(IL-2)受体的诱导剂,同时加重组 IL-2(rIL-2 1000 U/ml)刺激3天,然后去除PHA,单独用 rIL-2培养,每三天换培养液,继续培养46～79天,同时观察实验结果。体外培养的 TIL 表型用双色荧光流式细胞仪来检测,得到以下实验结果:一、从每克肿瘤组织可分离得到1.0×10~6至1.6×10~6的 TIL 细胞。经过体外全程培养细胞数量可增加31～3700     

肿瘤浸润淋巴细胞和IL-2治疗晚期癌症

肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)是浸润肿瘤组织的活化淋巴细胞,能从小量肿瘤活检标本中分离,并在体外用白细胞介素-2(IL-2)扩增。这些细胞可能富含特异抗自身肿瘤活性,其活化所需 IL-2约为活化 LAK 细胞的1/100。本文报道非小细胞肺癌、恶性黑色素瘤或肾细胞癌患者应用 TIL 继承免疫疗法和持输注 IL-2的临床效果及免疫应答。对象为28例完成疗程的晚期癌症患者。用Kurnick 等报道的方法扩增 TIL,用~(111)铟标记静脉转输的 TIL(2.5×10~8)。患者在转输后4、24和48小时行 Gamma(γ)摄像机摄像,观察 TIL 在体内分布。在输注后每隔一定时间取外周血1 ml,用γ分光光度计检测放射活性,     

α-CD4单抗对α-CD3单抗刺激和IL-2诱导的肿瘤特异性T细胞的扩增和杀瘤活性的影响

在用a-CD3单抗和20U/ml rIL-2扩增FBL-3红白血病肿瘤细胞免疫的小鼠脾细胞,获取了具有高度杀瘤活性的、FBL-3特异性的T细胞的基础上,观察了a-CD4单抗对FBL-3特异性的T细胞的增殖、杀瘤活性及表型的影响.本研究采用四种不同的培养方案:(1)单独使用a-CD3单抗(CD3组);(2)单独使用20U/ml rIL-2(IL-2组);(3)使用a-CD3单抗48小时后,加入a-CD3单抗和20U/ml rIL-2(CD3 IL-2组);(4)a-CD3单抗和a-CD4单抗同时使用48小时后,加入a-CD3单抗、a-CD4单抗和20U/ml rIL-2(CD3 CD4 IL-2组).实验结果显示,CD3 IL-2组在20天培养过程中细胞扩增为590倍,在培养12天时对FBL-3的最大杀伤活性为83.6%;CD3 CD4 IL-2组在20天培养过程中细胞扩增为950倍,在培养12天时对FBL-3的最大杀伤活性     

转基因的TIL细胞杀伤肿瘤细胞的实验观察

恶性黑色素瘤是一种恶性度很高的肿瘤.肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)是迄今为止恶黑治疗的最为有效的免疫活性细胞.然而,TIL细胞的应用必须同时以大量的白细胞介素2(IL-2)以维持其活性.而IL-2在体内的半衰期很短,用量大、代价昂贵,而且能够引起一系列的毒副作用.如果将IL-2基因插入TIL细胞、使其一方面释放IL-2维持自身的活性,另一方面使TIL细胞能携带IL-2基因到肿瘤部位释放具有广泛免疫活性的IL-2,一定能使TIL细胞的抗肿瘤作用如虎添翼.我们以逆转录载体成功地将IL-2基因导入恶黑的TIL细胞中,并得以持续、稳定的表达.IL-2基因的PCR扩增证实外源性IL-2基因成功插入TIL细胞中,转染率在1‰～     

CD3AK细胞的诱导及其体外抗肿瘤活性的实验研究

本研究采用抗CD3单克隆抗体(CD3McAb)辅以少量的基因重组人白细胞介素2(rIL-2)和植物血凝素(PHA)诱导外周血淋巴细胞,成功地研制出具有抗肿瘤活性的CD3McAb激活的杀伤细胞(anti-CD3monoclonal antibody activated killer cells)简称CD3AK细胞.结果表明,微量的CD3McAb辅以少量的rIL-2和PHA就能诱导和大量扩增CD3AK细胞,30ng/ml的CD3McAb就能激活CD3AK细胞,而且激活作用为一次性完成,并能保持至少16天的增殖生长趋势;当CD3McAb浓度增加到100ng/ml时,细胞扩增倍数为27±3.67,与LAK细胞扩增倍数相接近;当CD3McAb浓度提高到300ng/ml时,CD3AK细胞的扩增倍数为192±9.36明显高于LAK细胞扩增倍数28±6.13(P<0.05);当CD3McAb浓度提高到500ng/ml时,CD3AK细胞扩增倍数可达864±9.31倍.CD3AK细胞是以CD3~ 、CD8~ 和CD4~ 为主的异质性细胞群,CD3~ 和CD8~ 细胞百分率随培养时间延长而增加.培养至第4天的CD3AK细胞已开始具有明显的杀伤活性,并逐渐增强,至第10天达到高峰,随后开始下降,其抗瘤效应最佳时期在     

CD3抗体激活的杀伤细胞实验性抗喉癌作用的研究

基于CD3抗原广泛存在于成熟T细胞表面的理论基础,我们应用CD3单克隆抗体与IL-2在体外成功诱导出了具有较好增殖活性的CD3抗体激活的杀伤细胞(CD3AK细胞),并对其抗喉癌作用进行了观察和研究.结果表明:与常规培养的LAK细胞相比,以健康人新鲜外周静脉血单个核细胞为前体、经CD3单抗(4μg/ml)和IL-2(1000U/ml)诱导产生的CD3AK细胞具有集落形成率高、体外扩增能力强、存活时间长、抗瘤作用持久稳定等优势.在培养初期,CD3AK细胞的扩增情况与LAK细胞相似,但CD3AK细胞生长后劲明显,于培养8～10天达增殖高峰,平均扩增18.5倍,并可维持体外长期存活达两周之久,而同期培养的LAK细胞1周时平均仅增5.5倍,且多于1周后逐渐死亡,二者相比有非常显著性差异;同时,CD3AK细胞在体     

肿瘤特异性γ δ T细胞扩增体系的建立及其抗肿瘤活性研究

目的:建立一种体外诱导肿瘤细胞特异性γ δ T细胞的培养体系.方法:从人外周血中分离单个核细胞(PBMCs),用不同浓度的磷酸抗原(IPP)与rhIL-2联合刺激γ δ T细胞增殖,观察并收集细胞,采用流式细胞仪检测刺激后 CD3+Vγ9+的 γ δ T 细胞数量以及比例,并计算其扩增效率.结果:经15天扩增培养后,高浓度组10μg/ml 的IPP联合500IU/ml rhIL-2刺激得到的γ δ T细胞的扩增效率最高,且扩增培养至第9天的γ δ T细胞对肿瘤细胞有一定的杀伤活性.结论:适宜浓度磷酸抗原(IPP)联合rhIL-2能有效体外诱导具有较强抗肿瘤活性γ δ T细胞的扩增.     

卵巢癌肿瘤浸润淋巴细胞某些细胞因子基因表达的研究

目的:研究卵巢癌肿瘤浸润淋巴细胞在体外扩增后某些细胞因子的表达.方法:利用RT-PCR和免疫学方法,分离5例刚分离的上皮性卵巢癌肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和其中3例腹水标本中肿瘤相关淋巴细胞(TAL),检测其在体外扩增后,IL-2,IL-2R,TNF-α,IFN-γ,IL-6等细胞因子基因的表达的水平与变化;测定细胞培养上清液中细胞因子的活性,分析TIL或TAL扩增前后杀伤肿瘤细胞的能力和免疫学特性的变化.结果:TIL在扩增前后的4周时间内,仅TNF-α mRNA基因表达是持续的,并可维持相当长一段时间;IFN-γmRNA基因的表达缺乏;IL-2mRNA基因表达只是一过性.体外加入抗CD3单抗或PHA(合适浓度)刺激TIL或TAL,IL-2,TNF-α,IhN-γmRNA表达明显增强.和TIL细胞因子基因表达不尽相同的是,TAL表达IL-6 mR-NA.结果还发现,体外IL-2的浓度对TIL的免疫学特性有很大的影响.结论:TIL在体外经rIL-2扩增后,免疫活性有明显提高.TIL的抗肿瘤活性在很大程度上依靠其分泌的多种细胞因子.     

IL-7与IL-2,PHA或/及αCD3联用诱导人外周血LAK细胞的协同和抑制作用的研究

本文将IL-7与IL-2,PHA或/及αCD3联用诱生PHA-LAK,CD3Ak和PHA-αCD3LAK细胞,观察IL-7对上述三种细胞的激活作用,为肿瘤的过继性细胞免疫治疗提供新思路.方法:应用活细胞计数的方法测定细胞增殖活性;应用MTT法测定外源性IL-2的消耗和细胞毒活性;应用APAAP法检测mIL-2R的表达和效应细胞表型等指标.结果发现,1.IL-7对效应细胞增殖活性的影响各组效应细胞增殖曲线均于第6天达增殖的峰值,但以IL-7 PHA-LAK细胞为最高,达2.22×10~6/ml,IL-7 CD3AK也高于其IL-7~-对照组,而IL-7 PHA-αCD3LAK细胞则最低,仅有1.49×10~6/ml.IL-7~ PHA-LAK和IL-7 CD3AK细胞扩增倍数也高于各自的IL-7~-对照组(P<0.01),IL-7 PHA-αCD3LAK细胞的扩增     

小鼠肝癌肿瘤浸润性淋巴细胞抗瘤活性的研究

作者对小鼠肝癌肿瘤浸润性淋巴细胞(Tumor-infiltrating lymphocyte,TIL)的抗瘤活性进行了初步研究。结果表明,新鲜分离的TIL对自身肝癌细胞的杀伤效应很低,经与IL-2共育后显著提高。培养10～30天达高峰,以后开始下降,灭活自身肿瘤细胞的再刺激,可对抗这种下降趋势。TIL对自身肝癌细胞的杀伤后性明显强于LAK细胞(P<0.01),并且表现为较强的肿瘤特异性,即对自身肿瘤细胞的杀伤明显强于对其它肿瘤的杀伤。将TIL与肿瘤细胞混合(10:1)注入小鼠皮下,肿瘤细胞的生长受到明显抑制。上述结果提示,TIL可望成为肿瘤过继免疫治疗中较LAK细胞更有效的活性细胞。     

TIL肿瘤过继细胞治疗研究进展

肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)是从肿瘤组织中分离出的CD4+、CD8+T细胞,在体外经白介素2(interleukin-2,IL-2)的刺激、活化、扩增后可应用于临床肿瘤过继细胞治疗(adoptive cell therapy,ACT)。为避免IL-2在扩增中的大量使用使得TIL中CD4+CD25+Treg数量增加所产生的免疫耐受现象,现在研究集中于改进TIL的体外扩增方法;研究显示,"年轻"型TIL(young TIL)靶向肿瘤的特异性更高,故其是潜在的扩增对象。临床使用TIL过继治疗前需对肿瘤患者进行全身放疗处理;TIL过继治疗联合化疗药物(如环磷酰胺,氟达拉滨等)对自体淋巴清除(lymphodepletion)的肿瘤患者疗效显著,将成为以后肿瘤免疫治疗的主要方向;除化疗药物外,还可开发肿瘤疫苗、单克隆抗体等联合TIL过继治疗。本文主要介绍TIL培养体系、功能改进的研究以及TIL过继治疗联合化疗药物在临床恶性肿瘤治疗中的应用,讨论其可能存在的问题并展望未来的发展方向。     

人胃癌肿瘤浸润淋巴细胞的体外抗肿瘤活性研究

 根据11例胃癌手术标本的研究,肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)经重组白细胞介素2(rIL-2)诱导能在体外长期生长、扩增,长期培养的6例平均扩增15.1倍。细胞毒活性试验对多种瘤靶细胞有杀伤活性,并对自体瘤细胞和胃癌细胞系显示靶细胞特异性,其杀伤高峰在培养的第三、四周。冻存对TIL的扩增和杀伤活性均无明显影响。提示胃癌TIL临床应用的可能性。     

免疫调节剂分枝杆菌多糖对喉癌的实验研究

分枝杆菌多糖(MPS)是由非致病性分枝杆菌中提取的多糖成分制成的一种免疫调节剂.我们观察了NPS对加强LAK细胞体外对喉癌细胞的杀伤作用.观察表明,LAK细胞培养联合应用MPS0.4mg/ml可使LAK细胞扩增明显增加达25倍,而单纯用lL-2时LAK细胞扩增倍数为10.7倍,二组比较,P<0.01,有极显著性差异,且使lL-2用量减少4/5.而且MPS尚能增加LAK细胞于体外对喉癌细胞HEP-2细胞的杀伤活性,于LAK细胞培养第10天,其对HEP-2细胞的杀伤活性为15.6%,而加用     

氩氦冻融的肺癌细胞对人外周血单个核细胞免疫功能的影响

[目的]观察氩氦冻融的小细胞肺癌细胞NCI-H446对正常人外周血单个核细胞免疫功能的影响。[方法]分离正常人外周血单个核细胞,与氩氦冻融的小细胞肺癌细胞NCI-H446混合培养,设一个空白对照组,培养过程中隔天加入IL-210U,分别在第3、7、14d检测培养上清液中IL-12、IL-10含量及NK细胞、CTL细胞的杀伤活性。[结果]氩氦冻融的肺癌细胞NCI-H446与PBMC混合培养后,第3、7d时,培养上清液中IL-12含量分别为71.8±19.1pg/ml,106.2±13.6pg/ml,对照组IL-12含量为38.5±8.4pg/ml,40.8±8.3pg/ml,试验组较对照组明显升高(P<0.05),在第14d时试验组与对照组IL-12表达相当。IL-10的表达在试验组与对照组之间始终未发现明显差异。试验组NK细胞、CTL细胞的杀伤活性在14d内均明显高于对照组(P<0.05)。[结论]氩氦冻融的肺癌细胞可以上调PBMC对IL-12的表达,而对IL-10的表达无影响,同时可明显增强NK细胞和CTL活性。     

IL-2、IL-15增强免疫编辑后NK细胞NKG2D的表达及其对鼻咽癌CNE2细胞的杀伤活性

目的:观察IL-2、IL-15对免疫编辑后NK细胞NKG2D的表达及其对鼻咽癌CNE2细胞杀伤活性的影响.方法:抗CD56磁珠纯化NK细胞后分为4组:(1)编辑前NK细胞组:加入1130 U/ml IL-2;(2)单纯编辑组:NK细胞与CNE2细胞10:1混合,加入100U/ml IL-2;(3)IL-2再培养组:纯化编辑后的NK细胞,加入1 000 U/ml IL-2;(4)IL-15再培养组:纯化编辑后的NK细胞,加入10 ng/ml IL-15.24 h后,流式细胞仪检测各组NK细胞表面NKG2D的表达;LDH释放测定法测定效靶比20:1时各组NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性.结果:编辑前NK细胞组、单纯编辑组、IL-2再培养组、IL-15再培养组NK细胞表面NKG2D的表达率分别为(97.63±0.83)%、(53.50±1.25)%、(94.47±1.00)%、(98.07±0.21)%.IL-2、IL-15再培养组NK细胞NKG2D的表达分别比单纯编辑组有显著的增加(P＜0.01),该4组NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性分别为(35.90±3.27)%、(4.70±2.30)%、(31.70±3.56)%、(40.18±2.94)%,IL-2再培养组、IL-15再培养组明显提高编辑后NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性(P＜0.01),IL-15的作用强于IL-2.结论:高剂量IL-2、IL-15可以上调免疫编辑后NK细胞表面NKG2D的表达,恢复编辑后NK细胞对鼻咽癌细胞CNE2的杀伤活性,IL-15的作用强于IL-2.