基质金属蛋白酶3在创伤愈合中作用的实验研究

目的 探讨基质金属蛋白酶3(MMP3)在创伤愈合过程中的变化及其意义.方法 采用本研究前期建立的方法分离大鼠皮肤伤后伤口液和真皮多能干细胞.取伤后1天伤口液作为创伤修复启动微环境刺激真皮多能干细胞,24h后通过免疫组化方法检测MMP3表达水平的变化.同时制作单纯创伤和难愈创伤动物模型,观察伤口局部炎性细胞浸润、肉芽组织形成、成纤维细胞数量、表皮再上皮化程度等创伤愈合过程变化,并通过免疫组化和图像分析方法观察伤后不同时相(3、5、7、10、14天)伤口组织MMP3含量变化.结果 创伤早期伤口液作用后,真皮多能干细胞MMP3表达显著增加.正常大鼠皮肤组织可见一定量的MMP3表达,阳性细胞主要为表皮细胞、毛囊外根鞘细胞、真皮成纤维细胞、血管内皮细胞等.单纯创伤大鼠伤后各时相点MMP3表达均显著增加,尤以真皮组织为著,其峰值在伤后5～7天.难愈创伤组大鼠伤后各时相点MMP3含量亦显著增加,但其表达峰值延迟,为伤后10天,且伤后3、5、7天真皮组织的表达水平显著低于单纯创伤组.结论 MMP3是一种重要的创伤愈合调节分子;高表达MMP3可能是真皮多能干细胞参与创伤修复的途径之一.     

热休克蛋白70在创伤愈合中的作用

目的 探讨热休克蛋白70（heat shock protein70,HSP70）在创伤愈合过程中的变化及其意义。方法 取大鼠伤后1天伤口液作为创伤修复启动微环境,刺激真皮多能干细胞,24小时后检测细胞表达HSP70含量的变化。同时制作单纯创伤和难愈创伤动物模型,通过免疫组化和图像分析方法观察伤后不同时相点伤口组织HSPT0含量变化。结果 创伤早期伤口液作用真皮多能干细胞后,HSP70表达显著增加。单纯创伤组大鼠伤后各时相点伤口局部HSP70表达均显著增加,尤以真皮组织增加明显,其峰值为伤后3天。难愈创伤组大鼠伤口局部HSP70含量在伤后各时相点亦显著增加,但与单纯创伤组相比,其含量在伤后各时相点均显著减少,尤以真皮组织表达减少更为明显,并且HSP70表达峰值显著延迟,为伤后7天。结论 HSP70不仅是一种应激保护分子,而且还是参与调节创伤愈合的一种重要分子。     

真皮间充质干细胞的分离培养及其NOV基因的表达

目的：分离培养大鼠真皮来源成体多能干细胞并研究其NOV基因表达。方法：分离培养新生大鼠真皮间充质干细胞，采用形态学观察及免疫组化法进行鉴定。用脂质体法将构建的NOV基因真核表达载体转染入大鼠真皮多能干细胞中，在荧光倒置显微镜下观察转染产物，RT—PCR法检测转染细胞中NOV基因表达。结果：新生大鼠真皮间充质干细胞86％处于G0／G1期，多向诱导后可分化为神经细胞及中胚层来源细胞。NOV重组质粒体外转染大鼠真皮多能干细胞后，转染细胞中检测到NOV基因。结论：大鼠真皮组织中存在着成体多能干细胞，具有多胚系分化潜能。该细胞可作为NOV基因表达的细胞载体。     

真皮来源间充质干细胞的分离培养及成神经分化的研究

目的：研究真皮来源间充质干细胞的分离培养方法及其向神经细胞分化的条件及可行性。方法：取大鼠真皮组织，采用贴壁传代培养筛选法，分离培养真皮间充质干细胞，流式细胞术检测细胞周期，经β-巯基乙醇诱导，倒置显微镜下观察细胞形态变化，免疫细胞化学方法对分化细胞进行鉴定。结果：分离的早期贴壁的真皮来源间充质干细胞经过连续传代培养至第4代，细胞形态较为均一，86％的细胞处于G0／G1期，细胞表面波形蛋白表达阳性，但因子Ⅷ和角蛋白表达阴性。经β-巯基乙醇诱导，真皮间充质干细胞可向神经细胞分化，细胞突起增多，具有神经元的形态学特征，分化后的细胞表达神经元标志物——神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经微丝（NF-200）。结论：大鼠真皮组织中存在着成体多能干细胞，一定条件下可分化为神经元。提示真皮可能是成体多能干细胞的又—来源，有望在神经组织修复和再生中发挥作用。     

放创复合伤时创伤局部bFGF和NGF含量的变化及意义

生长因子可以调节创伤修复中的多种细胞反应,对细胞增殖、迁移、细胞外基质合成、分泌都具有重要作用¹.碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和神经生长因子(nerve growth factor,NGF)在创伤愈合过程中具有重要作用^[2,3],但合并全身放射损伤的创伤局部其含量变化及其意义仍未见报道,因此本实验拟对此进行研究,以期深入阐明放创复合伤创伤难愈的理论机理,并为进一步制订促愈措施提供实验依据。     

毛囊真皮鞘细胞在皮肤创伤愈合中作用的实验研究

目的：通过体外培养毛囊真皮鞘细胞移植于大鼠皮肤创面的实验研究,探讨真皮鞘细胞在皮肤创伤愈合中的作用。方法：组织块法原代培养Wistar大鼠触须毛囊真皮鞘细胞,5-溴脱氧尿苷（BrdU）标记。Wistar大鼠22只,采用背部皮肤缺损模型,分细胞移植组和生理盐水对照组。术后3d、7d、14d、1个月和2个月取材,图像分析计算创面收缩率,免疫组化观察植入细胞在体内的转归,光镜和扫描电镜观察创面愈合病理过程。结果：术后各时间点细胞移植组创面收缩率均大于对照组（P〈0．01）;术后7d移植组新生肉芽组织中见不均匀分布的标记细胞,14d标记细胞减少并出现凋亡;移植组愈合过程中肉芽组织形成、表皮再生、胶原增生和组织改建均较对照组有所提前。结论：毛囊真皮鞘细胞在皮肤创伤修复过程中参与肉芽组织形成,具有加速创面收缩和促进愈合进程的作用。     

骨髓间充质干细胞在肺损伤大鼠肺组织的分化

目的 探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞的可能性.方法 将SD大鼠MSCs用DAPI标记后注入受体大鼠体内.75只受体大鼠随机分为5组(n＝15):肺损伤组、MSCs治疗组、MSCs对照组、单个核细胞对照组和正常对照组.分别于MSCs、单个核细胞注入受体大鼠体内1、2、4周后观察肺组织结构变化,检测肺组织中植入细胞情况及广谱细胞角蛋白的表达水平.结果 MSCs治疗组大鼠肺组织在各时间点均有少量植入的细胞,并且部分植入的细胞表达广谱细胞角蛋白.MSCs植入后2周大鼠细支气管壁有少量植入的细胞同时表达广谱细胞角蛋白.其余各组未发现植入细胞的标记.结论 MSCs可在损伤的大鼠肺组织中分化为肺泡上皮细胞和支气管上皮细胞.     

合并全身放射损伤对皮肤伤口组织细胞的抑制效应及W11-a12的促愈作用

目的：研究全身放射损伤对皮肤伤口组织细胞的影响及W11－a12促愈作用。方法：小鼠6Gy照射后，于背部造成两个皮肤切口伤，观察伤后伤口截面愈合速度，伤口炎细胞，成纤维细胞和毛细血管数量及表皮细胞中碱性成纤维细胞生长因子含量的变化。结果：与单纯创伤组相比，照射后伤口截面愈合速度降低，伤口不同细胞数量均有抑制效应，但效应程度不同，由重到轻依次为炎细胞，血管内皮细胞，成纤维细胞和表皮细胞；表皮细胞中碱性成纤维细胞生长因子含量显著减少，W11－a12使伤口截中速度加快，细胞数量增加，并使表皮细胞中碱性成纤维细胞生长因子含量增加。结论：伤后伤口局部细胞数量减少和表皮细胞中碱性成纤维细胞生长因子含量下降是合并放射损伤后创面难愈的重要原因之一，W11－a12对伤口的细胞游走，增殖及表皮细胞分泌碱性成纤维细胞生长因子的功能具有促进作用。     

真皮多能干细胞促进大鼠急性放射损伤造血恢复的研究

目的 观察真皮多能干细胞移植对大鼠急性放射损伤后造血恢复的作用。方法 分离新生大鼠真皮多能干细胞体外培养至第10代用于研究，观察干细胞层体外对正常大鼠骨髓粒-巨噬系祖细胞和红系祖细胞集落生长的影响；进一步将真皮多能干细胞经尾静脉输入5Gyγ射线全身照射的大鼠体内，检测移植后骨髓有核细胞、粒-巨噬系祖细胞集落CFU—GM、红系祖细胞集落CFU—E和外周血白细胞数量、血红蛋白含量等指标的恢复情况，观察4周后动物的存活率。结果 真皮多能干细胞层体外可促进正常大鼠CFU—GM和CFU—E集落的生长；全身输入干细胞促进了5Gyγ射线全身照射动物的外周血白细胞和骨髓有核细胞、CFU-GM和CFU—E集落数的恢复。实验组动物4周后的存活率也明显高于对照组。结论 真皮多能干细胞具有一定支持造血的功能，可促进急性放射损伤大鼠的造血恢复，为造血损伤相关疾病的干细胞治疗提供新的细胞来源途径。     

腮腺创伤修复中碱性成纤维细胞生长因子的表达及意义

目的：观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在腮腺创伤修复中的表达变化。方法：采用宏观、体视学、显微镜图象分析及免疫组织化学方法对大鼠腮腺部分切除术后剩余腺体bFGF的表达变化进行了动态分阶段分析。结果：bFGF在损伤刺激后发生高表达，伤后1d最高，之后逐渐降低，至伤后8w恢复正常。与之相伴随，间质组织在前2W明显增生，以后逐渐减少，腺泡细胞在前2w 大量萎缩凋亡，2w后又再生，8w恢复正常。结论：bFGF是强丝裂原和生血管因子，是参与腮腺创伤修复的重要细胞因子。     

肌损伤液对大鼠肌源性干细胞生物学性状的影响

目的 研究肌损伤局部肌损伤液对大鼠肌源性干细胞(muscle derived stem cells,MDSCs)生物学性状的影响.方法 采用差速贴壁法分离培养大鼠MDSCs.制造大鼠肌肉切割伤,用于肌损伤液的提取,比色法检测不同时相肌损伤液蛋白含量,筛选蛋白含量最高时相的肌损伤液作用于MDSCs.四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)和划痕实验检测肌损伤对大鼠MDSCs增殖和迁移的影响.免疫组化法及Westem blot检测肌损伤液培养后α平滑肌动蛋白(α-SMA)和波形蛋白(Vimentin)蛋白表达.结果 体积分数为10%的伤口液在体外促进MDSCs的增殖和迁移的能力最强,肌损伤液能促进体外培养小鼠MDSCs生成α-SMA和Vimentin,且呈时间依赖关系.结论 肌损伤局部微环境肌损伤液一方面可通过诱导MDSCs的增殖、运动而直接参与修复;另一方面肌损伤液有促进MDSCs向肌成纤维母细胞分化,促进肌纤维化的作用.     

局部持续分泌神经生长因子促周围神经再生作用的研究

目的探讨以微囊化基因修饰细胞为载体,在局部持续分泌神经生长因子(nerve growth factor,NGF)促周围神经再生的作用。方法NGF基因修饰3T3细胞(3T3-NGF),采用微胶囊制备技术制备微囊化的3T3-NGF细胞;体外培养后分别检测活性和生物活性。选取SD大鼠制备坐骨神经横断损伤模型后,随机分微囊化3T3-NGF细胞移植组(A组)、裸3T3-NGF细胞移植组(B组)、空胶囊移植组(C组)和阴性对照组(D组)。术后不同的时间采用组织形态学检查分别观察各组坐骨神经恢复情况。结果3T3-NGF细胞在微胶囊内保持正常活性和增殖能力,可以持续分泌NGF。移植术后A组的患肢恢复情况好于B,C和D组。移植术后4,8及12周时,各组动物行组织形态学检查,显示A组的损伤远端神经纤维密度、轴突直径和髓鞘厚度等评价神经再生的指标均优于B,C和D组(P<0.05),而B,C和D三组之间差异无显著性(P>0.05)。结论体外培养的3T3-NGF细胞,在微胶囊内可保持正常的增殖能力和生物活性;微囊化3T3-NGF细胞移植到大鼠周围神经损伤的局部,在微胶囊的免疫保护下,可持续分泌NGF,有促进周围神经再生修复的作用。     

MEBT/MEBO对血管内皮细胞粗面内质网影响的实验研究

目的:本课题旨在进一步探讨烧伤湿性医疗技术(MEBT/MEBO)对皮肤溃疡局部血管内皮细胞粗面内质网结构的影响,以期可以从不同侧面揭示MEBT/MEBO的改善微循环、祛腐生肌、促进创面再生与修复作用的分子生物学机制.方法:将40只SPF级SD雄性大鼠随机分为美宝湿润烧伤膏(MEBO)治疗组和贝复济对照组,每组20只,造模后于次日开始用药,观察用药后治疗组和对照组溃疡创面愈合情况、肉芽组织生长情况,并记录创面愈合时间.在造模后第8天,取两组同时相点创面组织,用电镜观察标本的超微结构,主要观察血管内皮细胞中粗面内质网的结构形态.结果:MEBO组大鼠的皮肤溃疡创面愈合情况明显好于贝复济组,创面愈合时间明显短于贝复济组,有显著性差异(P<0.05).组织病理学检测MEBO组治疗的创面,造模后第8天标本中血管内皮细胞中粗面内质网结构形态多于贝复济组.结论:MEBO较贝复济能明显的缩短实验性SPF级SD雄性大鼠体表皮肤溃疡模型皮肤慢性难愈合创面的修复愈合时间,具有促进创面愈合,减少瘢痕愈合的作用.其部分愈合机制:促进新生毛细血管的增殖等以加速肉芽组织形成.     

外源性碱性成纤维细胞生长因子促进腮腺创伤修复的实验研究

目的 :观察外用重组碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)对腮腺创伤修复的促进作用。方法 :采用宏观、体视学、显微镜图象分析方法 ,对外用重组bFGF对大鼠腮腺创伤修复的影响进行动态分阶段分析研究。结果 :外用重组bFGF明显促进了肉芽组织和毛细血管的增生 ,增强了创伤性炎症增生反应 ,同时无促进腺泡细胞增生和涎液分泌的作用。结论 :外用重组bFGF促进腮腺创伤的愈合 ,减少腮瘘并发证的发生 ,对腮腺创伤的治疗有重要的临床意义     

SC-58236与顺铂联合调控人肺腺癌A549细胞增殖及肺癌移植瘤生长的作用

目的：观察高选择性COX-2抑制剂SC-58236和顺铂联合对人肺腺癌A549细胞增殖及移植瘤生长的影响。方法：采用MTT法观察A549细胞增殖,同时用PTENsiRNA转染A549细胞,并将其接种裸鼠,观察SC-58236和／或顺铂对A549细胞增殖及移植瘤生长的影响。结果：SC-58236可增强顺铂对A549细胞增殖及其对移植瘤生长的抑制作用,并协同促进细胞及瘤组织内PTEN蛋白表达（P〈0．01）。PTENsiRNA转染可减弱顺铂与SC-58236对A549细胞增殖及肿瘤生长的抑制作用（P〈0．01）。结论：SC-58236可增强顺铂对A549细胞的细胞毒性,该作用与增加PTEN蛋白表达有关。     

MC002诱导人喉癌细胞Hep-2凋亡及其作用机制

目的与雷公藤内酯醇（PG490）进行比较,观察雷公藤内酯醇衍生物MC002对人喉癌Hep-2细胞体外增殖的抑制作用及其分子机制。方法以MC002和PG490分别处理人喉癌细胞Hep-2,采用噻唑蓝比色法（MTT）检测药物对Hep-2细胞的增殖抑制作用并计算IC50值;利用软琼脂克隆形成实验观察细胞的锚定非依赖性生长能力;选用Hoechst33258染色法观察细胞凋亡的形态学变化;用ROS检测试剂盒分析药物对细胞活性氧水平的影响;以实时荧光定量PCR技术（Realtime-PCR）检测细胞凋亡相关因子Bcl-2及Bax mRNA水平的表达变化。结果 MC002及PG490均对体外培养的人喉癌Hep-2细胞有增殖抑制作用,且具有剂量依赖性,IC50值分别为183.58nmol/L和119.35nmol/L,而且两种药物可以抑制细胞的锚定非依赖性生长能力;此外,MC002及PG490可以降低ROS水平,并且使凋亡相关因子BaxmRNA表达上调,Bcl-2mRNA表达下调。结论 MC002具有与PG490相同的作用,可以抑制人喉癌细胞株Hep-2的生长,诱导人喉癌Hep-2细胞凋亡,其机制可能与调节凋亡相关因子Bcl-2、Bax及ROS的表达有关。     

微丝在碱性成纤维细胞生长因子调节伤口愈合中的作用

目的 探讨微丝在碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）调节伤口愈合中的作用。方法 采用免疫荧光染色、显微荧光光度计及＾３Ｈ－ＴｄＲ及参入法研究ｂＦＧＦ诱导的成纤维细胞微丝骨架的变化,观察用细胞松弛素Ｂ破坏微丝后,ｂＦＧＦ对细胞运动及细胞增殖的影响。结果 ｂＦＧＦ使成纤维细胞微丝骨架发生有序的变化;使Ｆ－肌动蛋白（Ｆ－ａｃｔｉｎ）含量增高,并呈一定的时间－剂量依赖关系．用细胞松弛素Ｂ破坏微丝,可明显抑制     

NMDA受体对体外培养成年大鼠海马神经前体细胞增殖及细胞内游离钙离子的影响

 目的观察N-甲基-D-天门冬氨酸(N-methy-D-aspartate,NMDA)对体外培养成年大鼠海马神经前体细胞增殖及胞浆内游离钙离子的影响.方法体外传代培养的成年大鼠海马神经前体细胞经碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、NMDA处理后,采用VIT法测定细胞增殖,激光共聚焦显微镜测定细胞胞浆内游离钙离子浓度.结果与对照组相比,NMDA可明显促进成年大鼠海马神经前体细胞增殖和细胞胞浆内游离钙离子浓度的升高(P<0.01),其作用效果呈剂量和时间的效应关系.结论NMDA可促进体外培养成年大鼠海马神经前体细胞的增殖,其可能机制与NMDA受体操控的细胞内Ca2+浓度升高所致的一系列级生物学级联事件的发生有关.