神经细胞移植对大鼠脑损伤修复及行为功能的影响

目的：观察神经胶质细胞、神经元颅内移植对大鼠脑损伤修复作用及其神经行为功能的变化。 方法：实验于2005-04／11在青岛大学医学院附属医院脑血管病研究所完成。①选取出生24h清洁级Wistar大鼠2只作为供体。另选用4月龄清洁级Wistar大鼠48只，随机分为4组：正常对照组3只，模型对照组3只，神经胶质纤维酸性蛋白（G1ial fibrillary acidic protein，GFAP）移植组21只，5-溴脱氧尿嘧啶尿苷（5-bromo2’-deoxy-uridine，Brdu）移植组21只。②取供体鼠脑组织进行神经干细胞的培养，经GFAP抗体、Brdu免疫荧光标记的阳性细胞分别制成单细胞悬液待移植。③除正常对照组外，其余组均建立脑损伤模型。造模后GFAP移植组进行神经胶质细胞移植，Brdu移植组进行神经元移植，正常对照组不接受任何细胞移植。④细胞移植后观察大鼠行为变化，并进行神经行为功能评分。采用免疫荧光法检测组织片GFAP、Brdu标记阳性细胞在脑皮质区、海马齿状回及纹状体区的动态变化。 结果：实验选取清洁级4月龄Wistar大鼠48只，全部进入结果分析。①神经行为功能测试及等级评分：与模型对照组比较，GFAP移植组、Brdu移植组于移植ld无明显变化，均呈重度损伤（15-16分）；移植8d差异明显，呈中度损伤（9-10分）；移植12d差异有显著性意义（P〈0．05），呈轻度损伤（4-5分）；移植16d差异有非常显著性意义（P〈0．01），呈完成不稳定或反射缺陷（1分），接近正常对照组；移植24d呈稳定持续状态。②不同时间点各梗死区域GFAP标记阳性细胞的表达：GFAP移植组标记阳性细胞，第l天脑皮质区、海马齿状回、纹状体区的细胞表达无明显变化；第4天各区细胞表达略有增加；第16天细胞表达为最高值；第20天细胞表达呈下降趋势；第24天细胞表达为最低值。③不同时间点各梗死区域BrdU标记阳性细胞的表达：Brdu移植组标记阳性细胞，第1天脑皮质区、海马齿状回、纹状体区的纽胞表达无明显变化；第4天各区细胞表达略有增加；第16天细胞表达为最高值；第20天细胞表达呈下降趋势；第24天细胞表达为最低值。 结论：神经胶质细胞、神经元颅内移植能够促进大鼠脑损伤的修复，改善大鼠神经行为功能。     

移植神经干细胞的存活与迁移:电刺激小脑顶核可提高移植效率吗?

背景:缺血早期半暗带中神经元和内皮细胞的坏死和凋亡无法得到缓解,加之移植后的存活率低,向功能细胞的分化率低,是单纯神经干细胞移植的缺陷.课题组提出整体干预理念,期望给移植细胞提供优化的整体环境.目的:观察神经干细胞移植与电刺激小脑顶核相结合整体干预对移植神经干细胞存活与迁移的影响.方法:体外分离、培养新生Wistar大鼠海马表皮生长因子反应性神经干细胞,Brdu标记,并用胎牛血清诱导,观察其多向分化潜能;80只Wistar大鼠分为4组:顶核刺激+神经干细胞移植组(n=32):左侧小脑顶核刺激24 h后行右侧大脑中动脉梗死,再24 h后将神经干细胞立体定向注入右侧侧脑室内;顶核刺激组(n=8):PBS代替神经干细胞,其余同顶核刺激+神经干细胞移植组;单纯神经干细胞移植组(n=32):同心圆电极插入小脑顶核,不通电其余同顶核刺激+神经干细胞移植组;对照组(n=8):同心圆电极插入小脑顶核后不通电,其余同顶核刺激组.记录梗死后6,24 h,3,7,14,28 d大鼠的神经功能;分别在移植后3,7,14,28 d处死大鼠,以梗死灶为中心切片,Brdu免疫组织化学染色,观察移植神经干细胞的存活与迁移.结果与结论:分离培养的表皮生长因子反应性细胞表达nestin抗原,并有自我更新及多向分化潜能,在胎牛血清诱导下可分化为神经胶质细胞和神经元.经Brdu标记后,85%以上神经干细胞表达Brdu抗原.移植28 d内顶核刺激+神经干细胞移植组功能评分明显优于与其他3组(P < 0.05～0.01).顶核刺激+神经干细胞移植组在移植14,28 d存活细胞数明显多于单纯神经干细胞移植组;提示电刺激小脑顶核可显著提高移植神经干细胞的存活率及大脑中动脉梗死大鼠的神经功能评分;优化的整体环境可提高移植神经干细胞对局灶性脑缺血损伤细胞的替代作用.     

神经细胞移植对大鼠脑损伤修复及行为功能的影响

目的:观察神经胶质细胞、神经元颅内移植对大鼠脑损伤修复作用及其神经行为功能的变化。方法:实验于2005-04/11在青岛大学医学院附属医院脑血管病研究所完成。①选取出生24h清洁级Wistar大鼠2只作为供体。另选用4月龄清洁级Wistar大鼠48只,随机分为4组:正常对照组3只,模型对照组3只,神经胶质纤维酸性蛋白(Glialfibrillaryacidicprotein,GFAP)移植组21只,5-溴脱氧尿嘧啶尿苷(5-bromo2’-deoxy-uridine,Brdu)移植组21只。②取供体鼠脑组织进行神经干细胞的培养,经GFAP抗体、Brdu免疫荧光标记的阳性细胞分别制成单细胞悬液待移植。③除正常对照组外,其余组均建立脑损伤模型。造模后GFAP移植组进行神经胶质细胞移植,Brdu移植组进行神经元移植,正常对照组不接受任何细胞移植。④细胞移植后观察大鼠行为变化,并进行神经行为功能评分。采用免疫荧光法检测组织片GFAP、Brdu标记阳性细胞在脑皮质区、海马齿状回及纹状体区的动态变化。结果:实验选取清洁级4月龄Wistar大鼠48只,全部进入结果分析。①神经行为功能测试及等级评分:与模型对照组比较,GFAP移植组、Brdu移植组于移植1d无明显变化,均呈重度损伤(15～16分);移植8d差异明显,呈中度损伤(9～10分);移植12d差异有显著性意义(P<0.05),呈轻度损伤(4～5分);移植16d差异有非常显著性意义(P<0.01),呈完成不稳定或反射缺陷(1分),接近正常对照组;移植24d呈稳定持续状态。②不同时间点各梗死区域GFAP标记阳性细胞的表达:GFAP移植组标记阳性细胞,第1天脑皮质区、海马齿状回、纹状体区的细胞表达无明显变化;第4天各区细胞表达略有增加;第16天细胞表达为最高值;第20天细胞表达呈下降趋势;第24天细胞表达为最低值。③不同时间点各梗死区域BrdU标记阳性细胞的表达:Brdu移植组标记阳性细胞,第1天脑皮质区、海马齿状回、纹状体区的细胞表达无明显变化;第4天各区细胞表达略有增加;第16天细胞表达为最高值;第20天细胞表达呈下降趋势;第24天细胞表达为最低值。结论:神经胶质细胞、神经元颅内移植能够促进大鼠脑损伤的修复,改善大鼠神经行为功能。     

兔脊髓损伤不同时期的神经干细胞移植治疗的效果

目的：研究新西兰大白兔脊髓损伤后不同时期神经干细胞(neuralstem cells，NSCS)移植治疗的不同效果，探讨脊髓损伤移植治疗的最佳时机。方法：体外培养、诱导新西兰大白兔骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)为NSC并行5-溴-2-脱氧尿苷(bromodeoxy uridine／5-bromo-2-deoxy uridine，BrdU)标记。手术造成兔脊髓全横断模型。在术后即时，7，14，21，28d分别行NSC局部移植，同时设立脊髓全横断空白对照组，正常对照组。于移植后3个月观察动物脊髓损伤局部病理变化。结果：术后即时移植组局部仅有少量Brdu标记阳性细胞存活，通过脊髓损伤区的神经纤维数目少；7，14d移植组局部有大量Brdu标记阳性细胞存活，通过脊髓损伤区的神经纤维数目多。神经纤维排列较整齐；21，28d移植组局部有大量Brdu标记阳性细胞存活，但通过脊髓损伤区的神经纤维数目少，且再生的神经纤维排列紊乱；空白对照组未发现Brdu标记阳性细胞，在脊髓损伤区域未发现再生通过的神经纤维。结论：实验证明了脊髓损伤后7～14d为NSC最佳移植时期，同时提示NSC移植对动物脊髓损伤后的组织修复具有促进作用。     

立体定向移植骨髓间充质干细胞改善血管性大鼠的学习记忆能力

背景：大量的实验证明将骨髓间充质干细胞移植到复制的中枢神经系统疾病大鼠模型后,能迁移到损伤部位,表达神经细胞的潜在特性并且提高神经功能。目的：验证骨髓间充质干细胞对拟人类血管性痴呆模型大鼠学习记忆障碍的改善作用。方法：分离SD大鼠骨髓间充质干细胞,于细胞移植前掺入10mg/L的BrdU进行标记。建立Wistar大鼠血管性痴呆样学习记忆障碍动物模型,随机分为模型组、假手术组与移植组。移植组致伤后第14天,通过立体定向途径移植骨髓间充质干细胞到大鼠海马,假手术组给予等量生理盐水,模型组大鼠不做处理。采用Morris水迷宫检测大鼠空间学习记忆能力。损伤后第90天处死大鼠,观察海马组织有无Brdu＋神经元特异性烯醇化酶、Brdu＋胶质纤维酸性蛋白免疫组织化学双染阳性细胞,并且观察从侧脑室到海马是否存在神经元前体细胞的标志Doublecortin（DCX）吻侧迁移流。结果与结论：①移植组大鼠采用Morris水迷宫检测大鼠空间学习记忆能力逃避潜伏期及跨越平台次数优于模型组及假手术组（P〈0.05）。②移植组大鼠海马组织及其周围可见免疫组织化学双染阳性细胞,但未见从侧脑室到海马关于神经元前体细胞的标志Doublecortin（DCX）吻侧迁移流。结果提示,骨髓间充质干细胞移植可以促进脑损伤大鼠的神经功能的恢复,其机制可能与移植细胞分化为神经元样和神经胶质细胞样细胞,并分泌或促进宿主分泌神经营养因子有关。     

胶质细胞源性神经营养因子与转化生长因子β1联合诱导大鼠脊髓源性神经干细胞的分化特点

目的:观察胶质细胞源性神经营养因子与转化生长因子β1体外联合诱导对脊髓源性神经干细胞分化的影响,为了解神经干细胞在体内多因素环境下的分化表现提供实验依据。方法:实验于2005-10/2006-09在南方医科大学附属深圳医院中心实验室完成。①碱性成纤维细胞生长因子,表皮生长因子,胶质细胞源性神经营养因子,转化生长因子β1(PeproTech);胎牛血清(Hyclone);神经巢蛋白多抗(武汉博士德);胶质纤维酸性蛋白多抗,神经丝蛋白单抗(Sigma)。②选用清洁级孕16d的SD大鼠10只,无菌条件下取出胚胎,进行脊髓源性神经干细胞的分离培养。基础培养基组成:含青霉素、链霉素、两性霉素B及体积分数为0.02B27添加液的DMEM/F12。③原代培养1周后,获取体外稳定增殖的鼠脊髓源性神经干细胞克隆,在基础培养基中加入体积分数为0.1的胎牛血清作为对照。同时设立碱性成纤维细胞生长因子组、转化生长因子β1组、胶质细胞源性神经营养因子 转化生长因子β1组,换用诱导培养基,即分别在基础培养基中加入20μg/L碱性成纤维细胞生长因子、2μg/L转化生长因子β1、10μg/L胶质细胞源性神经营养因子 2μg/L转化生长因子β1。观察在不同因子诱导情况下脊髓源性神经干细胞的分化行为,免疫细胞化学染色标记神经元与星状胶质细胞的表达。④通过荧光激发流式细胞仪分选技术对分化细胞计数,检测不同诱导环境下神经干细胞分化为神经元及星状胶质细胞的阳性百分率。结果:①细胞分化的形态学观察:分化早期可见神经球贴壁,大量细胞向四周爬出,1周后迁徙的大部分细胞完全贴壁,完成分化过程。在细胞密度较低区域可辨认出3种神经细胞类型:神经元样细胞、星状胶质样细胞、寡突胶质样细胞。②神经干细胞免疫组织化学检测:血清对照组、转化生长因子β1组存在大量胶质纤维酸性蛋白染色阳性的星状胶质细胞;而碱性成纤维细胞生长因子组、胶质细胞源性神经营养因子 转化生长因子β1组分化的神经元细胞数量较多,神经丝蛋白染色阳性。③流式细胞荧光分选计数:诱导1周后,胶质细胞源性神经营养因子 转化生长因子β1组神经元分化比例最高,明显高于碱性成纤维细胞生长因子组(χ2=19.56,P<0.05),而与血清对照组、转化生长因子β1组比较差异有极其显著性意义(χ2=24.15,25.32,P均<0.01)。碱性成纤维细胞生长因子组星状胶质细胞分化比例最低,胶质细胞源性神经营养因子 转化生长因子β1组组与其相近(χ2=17.23,P>0.05),而血清对照组、转化生长因子β1组则显著升高(χ2=24.45,23.79,P均<0.01)。结论:体外胶质细胞源性神经营养因子与转化生长因子β1的联合诱导有利于脊髓源性神经干细胞向神经元的分化,为脊髓原位神经干细胞分化及神经干细胞移植体内后的分化表现提供了实验数据。     

促红细胞生成素促进脊髓损伤大鼠移植神经干细胞存活和迁移

背景：如何有效促进移植入脊髓损伤组织内的神经干细胞存活和迁移,是目前神经修复研究的重点。目的：观察促红细胞生成素对脊髓损伤大鼠移植神经干细胞存活、增殖和迁移的影响。方法：将60只SD大鼠随机分为3组,均制备脊髓横断损伤模型。造模7d,神经干细胞移植组和促红细胞生成素组于脊髓损伤处移植BrdU标记的神经干细胞7μL（1×109L-1）,脊髓损伤对照组移植DMEM/F12培养基;促红细胞生成素组腹腔内注射促红细胞生成素5000U/kg,1次/d,连续注射7d,其余两组注射等量生理盐水。于细胞移植后8周取损伤脊髓组织。结果与结论：造模2周后,神经干细胞移植组和促红细胞生成素组BBB评分明显高于脊髓损伤对照组（P〈0.05）,造模4周后,促红细胞生成素组BBB评分明显高于神经干细胞移植组（P〈0.05）。免疫荧光染色显示促红细胞生成素组大鼠损伤脊髓组织BrdU阳性细胞数量及迁移距离均大于神经干细胞移植组（P〈0.05）。说明促红细胞生成素能促进损伤脊髓组织原位移植的神经干细胞的存活与迁移,加速神经功能修复。     

骨髓间充质干细胞立体定向移植治疗大鼠脊髓损伤

背景:干细胞治疗神经组织损伤的关键在于移植具有再生能力的干细胞,通过多种作用机制,重建中枢神经系统的结构和功能.目的:立体定向移植骨髓间充质干细胞观察其对大鼠脊髓损伤修复的影响并探讨其机制.方法:密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离骨髓间充质干细胞,于细胞移植前掺入10 mg/L的BrdU进行标记.将成年雌性Wistar大鼠以动脉瘤夹闭法制备大鼠脊髓损伤模型后随机分为对照组、生理盐水组与移植组.移植组大鼠致伤后第7天,通过立体定向途径移植骨髓间充质干细胞到脊髓损伤中心,生理盐水组给予等量生理盐水,对照组大鼠不做处理.于大鼠脊髓损伤前及损伤后第7,14,30,60,90天进行BBB评分;损伤后第90天处死大鼠,观察其脊髓组织中有无BrdU阳性细胞、Brdu+神经元特异性烯醇化酶、Brdu+胶质纤维酸性蛋白、Brdu+碱性成纤维细胞生长因子、Brdu+脑源性神经生长因子免疫组织化学双染阳性细胞及单染阳性细胞.结果与结论:①骨髓间充质干细胞移植组大鼠BBB后肢功能评分恢复优于对照组(P＜0.05):生理盐水组BBB评分在损伤后30 d内恢复速度慢于对照组(P＜0.05),至第90天与对照组比较差异无显著性意义(P＞0.05).②移植组大鼠脊髓内在损伤中心及头、尾端距离脊髓损伤中心1 cm处均可见BrdU染色阳性细胞及免疫组织化学双染阳性细胞.移植组神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、脑源性神经生长因子单染阳性细胞数明显高于对照组和生理盐水组(P＜0.05).结果提示,骨髓间充质干细胞移植可以促进脊髓损伤大鼠的神经功能的恢复,其机制可能与移植细胞分化为神经元样和神经胶质细胞样细胞,并分泌或促进宿主分泌神经营养因子有关.     

白藜芦醇对神经干细胞诱导分化为多巴胺能神经元移植治疗帕金森模型鼠的影响

背景:目前神经干细胞体外诱导分化的多巴胺能神经元移植治疗帕金森病仍面临细胞存活率低的问题,大部分细胞因氧自由基形成及脂质过氧化而发生程序性凋亡.目的:探讨白藜芦醇对神经干细胞体外诱导分化的多巴胺能神经元移植至帕金森模型鼠后的细胞存活及移植效果的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-10/2008-06在中山大学动物实验中心完成.材料:成年健康雄性SD大鼠32只,随机分为模型对照组、多巴胺能神经元组、白藜芦醇组、联合组,8只/组;孕十四五天的健康SD大鼠4只,取胎鼠用于神经干细胞的分离培养.白藜芦醇为深圳晶美生物工程有限公司产品.方法:取体外分离培养的胎鼠中脑神经干细胞,在含表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养液中传代扩增后,在分化液中诱导向多巴胺能神经元方向分化.各组大鼠均应用6-羟基多巴胺制备帕金森病模型.采用两点移植法,多巴胺能神经元组向大鼠毁损同侧纹状体注入多巴胺能神经元细胞悬液3μL(1×105个/μL):白藜芦醇组注入40 mg/L白藜芦醇3 μL;联合组注入40 mg/L白藜芦醇3 μL+多巴胺能神经元细胞悬液3 pL(1×105个/μL).模型对照组注入DMEM/F12细胞培养液3 μL.主要观察指标:胎鼠神经干细胞诱导分化的酪氨酸羟化酶染色阳性细胞率,细胞移植后帕金森模型鼠不对称旋转行为的变化,纹状体移植区酪氨酸羟化酶染色阳性细胞存活情况.结果:流式细胞仪检测诱导分化6 d的细胞中酪氨酸羟化酶染色阳性细胞率为(17.8±4.2)%.与模型对照组比较,联合组大鼠移植后10d不对称旋转行为有显著性改善(P<0.01),移植后20d不对称旋转圈数开始明显下降(P<0.01).移植后10～60 d,联合组大鼠的不对称旋转圈数明显低于多巴胺能神经元组(P<0.01).白藜芦醇组、模型对照组均未见酪氨酸羟化酶染色阳性细胞,联合组酪氨酸羟化酶染色阳性细胞数明显多于多巴胺能神经元组(P<0.01).结论:胎鼠神经干细胞诱导分化的多巴胺能神经元移植至帕金森模型鼠后,白藜芦醇可提高纹状体移植区植入细胞的存活率,改善大鼠不对称旋转行为.     

立体定向移植骨髓间充质干细胞改善血管性大鼠的学习记忆能力

背景:大量的实验证明将骨髓间充质干细胞移植到复制的中枢神经系统疾病大鼠模型后,能迁移到损伤部位,表达神经细胞的潜在特性并且提高神经功能。目的:验证骨髓间充质干细胞对拟人类血管性痴呆模型大鼠学习记忆障碍的改善作用。方法:分离SD大鼠骨髓间充质干细胞,于细胞移植前掺入10mg/L的BrdU进行标记。建立Wistar大鼠血管性痴呆样学习记忆障碍动物模型,随机分为模型组、假手术组与移植组。移植组致伤后第14天,通过立体定向途径移植骨髓间充质干细胞到大鼠海马,假手术组给予等量生理盐水,模型组大鼠不做处理。采用Morris水迷宫检测大鼠空间学习记忆能力。损伤后第90天处死大鼠,观察海马组织有无Brdu+神经元特异性烯醇化酶、Brdu+胶质纤维酸性蛋白免疫组织化学双染阳性细胞,并且观察从侧脑室到海马是否存在神经元前体细胞的标志Doublecortin(DCX)吻侧迁移流。结果与结论:①移植组大鼠采用Morris水迷宫检测大鼠空间学习记忆能力逃避潜伏期及跨越平台次数优于模型组及假手术组(P<0.05)。②移植组大鼠海马组织及其周围可见免疫组织化学双染阳性细胞,但未见从侧脑室到海马关于神经元前体细胞的标志Doublecortin(DCX)吻侧迁移流。结果提示,骨髓间充质干细胞移植可以促进脑损伤大鼠的神经功能的恢复,其机制可能与移植细胞分化为神经元样和神经胶质细胞样细胞,并分泌或促进宿主分泌神经营养因子有关。