利用GAD67-GFP基因敲入方法显示小鼠脊髓内表达GFP的GABA能神经元的分布(英文)

γ-氨基丁酸 (GABA)是脊髓背角、前角内主要的抑制性神经递质。为了更好地观察脊髓背角内 GABA能神经元的形态和功能 ,本研究使用了两种谷氨酸脱羧酶 67-绿色荧光蛋白 (GAD67-GFP)基因敲入小鼠 ,并观察了敲入小鼠脊髓内的 GFP表达状况。用免疫荧光组织化学双标记方法显示脊髓内所有的 GF P阳性神经元基本上都呈 GAD67和 GABA阳性 ;GFP阳性神经元在脊髓背角的 ～ 层最为密集 ,背角深层内侧部及中央管周围呈中等密度分布 ,而在脊髓背角其它部位及前角则呈散在分布。脊髓内 GFP阳性神经元的分布与 GABA能神经元的分布一致。本文作者等还进一步在 GAD67-GFP敲入小鼠中观察了 GFP和神经元标志物神经元核蛋白 (Neu N )的共存状况。脊髓背角内 GFP阳性神经元分别占 、 和 层的 Neu N阳性神经元的 3 1.5 %、3 3 .3 %和 44 .7% ,与以往的 GABA免疫组化研究结果基本一致。本研究表明 GAD67-GFP基因敲入小鼠脊髓内的 GFP在GAD67启动子的调节下正确地表达于 GABA能神经元 ,该基因敲入小鼠可用于脊髓 GABA能神经元的形态学特征和生理学特性及其发育规律等方面的研究     

GAD67-GFP基因敲入小鼠黑质网状部神经元GABA与氯离子转运体KCC2和NKCC1的共存

为了观察谷氨酸脱羧酶67-绿色荧光蛋白(GAD67-GFP)基因敲入小鼠黑质网状部(SNr)内,表达GFP的GABA能神经元与一对功能相反的Cl-共转运体(K+-Cl-cotransporter2,KCC2;Na+-K+-Cl-cotransporter1,NKCC1)的共存情况,本研究分别运用原位分子杂交与免疫组织化学相结合以及GFP与KCC2或NKCC1免疫荧光染色相结合的双重标记方法,在光学显微镜和激光共聚焦显微镜下同时进行观察。结果显示:(1)SNr内95%以上的GFP阳性神经元同时表达KCC2 mRNA,而50%表达KCC2 mRNA的阳性神经元呈GFP阳性;(2)SNr内80%以上的GFP阳性神经元同时表达NKCC1 mRNA,约35%表达NKCC1 mRNA的阳性神经元呈GFP阳性;(3)SNr内90%以上的GFP阳性神经元同时表达KCC2,双标神经元约占KCC2阳性神经元的50.5%;(4)SNr内80.5%以上的GFP阳性神经元同时表达NKCC1,双标神经元约占NKCC1阳性神经元的42.5%。以上结果表明,SNr内表达GFP的GABA能神经元大部分与KCC2和NKCC1共存,提示氯离子共转运体可能对SNr内GABA能神经元起重要的调控作用。     

GAD67-GFP基因敲入小鼠三叉上核内向三叉神经运动核投射的GFP阳性神经元表达c-fos的研究

本文综合应用逆行束路追踪(将四甲基罗达明-TMR注入一侧三叉神经运动核)和免疫荧光组织化学三重标记技术,在激光共聚焦显微镜下对谷氨酸脱羧酶67-绿色荧光蛋白(GAD67-GFP)基因敲入小鼠在口周部给予伤害性刺激时,三叉上核(Vsup)内向对侧三叉神经运动核(Vmo)投射的呈GFP阳性的GABA能神经元表达c-fos的情况进行了研究。结果显示:(1)Vsup内可观察到许多GFP阳性神经元,细胞较小;(2)也可观察到许多TMR或c-fos单标神经元较密集地分布于Vsup内,其中c-fos阳性产物只见于神经元的胞核,在胞浆内未见表达;(3)在激光共聚焦显微镜下可进一步观察到部分神经元同时呈GFP/TMR、TMR/c-fos、GFP/c-fos双重标记或GFP/TMR/c-fos三重标记。其中GFP/TMR双标神经元分别占GFP或TMR阳性神经元的17.8%和19.2%;TMR/c-fos双标神经元分别占TMR或c-fos阳性神经元的34.9%和31.3%;GFP/c-fos双标神经元分别占GFP或c-fos阳性神经元的21.2%和20.5%;而GFP/TMR/c-fos三标神经元分别占GFP、TMR或c-fos阳性神经元的11.1%、12%和10.8%。以上结果表明小鼠Vsup内部分GABA能神经元可接受来自同侧的口面部伤害性信息,并对这些信息进行整合后,直接发出投射纤维至Vmo;故Vsup内部分GABA能运动前神经元可能参与口面部伤害性反射局部环路的构成。     

大鼠延髓背角内5-羟色胺、脑啡肽、γ-氨基丁酸、甘氨酸或P-物质能终末与钙结合蛋白阳性神经元间的联系(英文)

CB(calbindin-D28k),CR(calretinin)和PV(parvalbumin)是最常见的3种钙结合蛋白(calcium-binding proteins,CaBPs)。本研究首先观察了面口部给予伤害性刺激诱发大鼠延髓背角(又称三叉神经脊束核尾侧亚核)神经元表达FOS蛋白的状况;然后通过免疫荧光组织化学技术检测这些神经元内是否含有CaBPs(CB、CR和PV);最后通过免疫荧光和免疫电镜染色技术观察5-HT、GABA、甘氨酸转运体2(glycine transporter 2,GlyT2)、脑啡肽(enkephalin,ENK)或SP与CaBPs/FOS双标神经元间的联系。在光镜下可观察到:(1) FOS阳性神经元在延髓背角各层均有分布,以Ⅱ层最为密集;(2)大多数CB、CR或PV阳性神经元位于Ⅱ层,余者分布在Ⅰ层和Ⅲ层;(3) 5-HT、GABA、GlyT2,ENK及SP阳性纤维和终末主要位于延髓背角浅层(4)部分FOS阳性神经元同时呈CB、CR或PV阳性;(5) 5-HT、GABA、GlyT2或ENK阳性终末分别与FOS/CB、FOS/CR或FOS/PV双标神经元形成密切接触;(6) SP阳性终末与5-HT、GABA、GlyT2或ENK阳性终末同时与CB、CR或PV阳性神经元形成密切接触。在电镜下观察到5-HT、GABA、GlyT2或ENK阳性终末与CB、CR或PV阳性神经元主要形成对称型(抑制性)突触联系。这些结果提示在大鼠延髓背角,5-HT、GABA、甘氨酸或ENK可能通过抑制含钙结合蛋白的伤害性感受神经元来调节面口部伤害性信息的传递。     

大鼠三叉神经尾侧亚核mGluR7,PAG和Glu—ir神经元的定位

本文应用免疫组织化学技术研究了大鼠三叉神经尾侧亚核内代谢型谷氨酸受体７亚型（ｍＧｌｕＲ７）、磷酸激活的谷氨酰胺酶和谷氨酸免疫阳性神经元的定位。结果显示ｍＧｌｕＲ７阳性胞体和纤维主要分布于Ｖｃ浅层（Ⅰ、Ⅱ层），在深层只有散在分布。Ｇｌｕ和ＰＡＧ阳性胞体分布于Ｖｃ各层，尤以浅层密集，Ｇｌｕ和ＰＡＧ阳性纤维及终末主要分布于Ｖｃ浅层。以上结果表明Ｇｌｕ阳性纤维及终末和ｍＧｌｕＲ７亚型阳性胞体及纤维在Ｖｃ内     

GAD67-GFP转基因小鼠三叉神经脊束核吻侧亚核和极间亚核内GABA和甘氨酸共存神经元的观察

本文以GAD67-GFP基因敲入小鼠为研究工具,利用免疫荧光组织化学双重染色技术观察了小鼠三叉神经脊束核(spi-nal trigeminalnucleus,V)的吻侧亚核(Vo)和极间亚核(Vi)神经元内谷氨酸脱羧酶67[GAD67,γ-氨基丁酸(GABA)能神经元的标识物质]和甘氨酸(glycine,Gly)的定位分布和共存情况。结果显示,在Vo和Vi内均有比较密集分布的GAD67和Gly阳性神经元。此外,在Vo和Vi内也可见一些GAD67阳性神经元同时呈Gly阳性反应,即存在GAD67/Gly双标神经元。结果表明,Vo和Vi内有GABA和Gly共存神经元,它们可能在初级传入信息的传递和调制中发挥重要作用。     

GAD67-GFP基因敲入小鼠5-羟色胺样和P物质样阳性终末与三叉神经中脑核神经元的联系

本研究应用免疫荧光组织化学三重标记技术,在激光共聚焦显微镜下观察了GAD67-GFP基因敲入小鼠三叉神经中脑核(Vme)内5-HT样和P物质(substanceP,SP)样阳性终末分别与小白蛋白(parvalbumin,PV)样和GFP阳性神经元之间的联系。结果显示:(1)Vme内有较多的PV样阳性神经元,这些神经元绝大多数为大、中型的假单极神经元,直径约为18～40μm;也可观察到少量的GFP阳性神经元,多为小的多极神经元,直径约为8～15μm;(2)5-HT样阳性终末广泛分布于Vme内,其中有部分阳性终末分别聚集在PV样或GFP阳性的Vme神经元的胞体周围,计数结果表明:大约有77.7%和22.3%的5-HT样阳性终末分别与PV样或GFP阳性胞体相接触;(3)SP样阳性终末也广泛分布于Vme内,并分别与PV样或GFP阳性神经元的胞体形成密切接触,其中有78.2%和21.8%的阳性终末分别与PV样或GFP阳性胞体相接触。以上结果提示,在口面部本体感觉信息向更高一级中枢传递过程中,5-HT能和SP能神经终末不仅对初级传入发挥直接的调控作用,还可能通过影响Vme内的GABA能神经元的活动,从而间接对该信息的传递发挥调控作用。     

大鼠三叉神经尾侧亚核内Fos及SP受体免疫反应神经元向丘脑腹后内侧核的投射

为了探讨三叉尾侧亚核（Ｖｃ）内向丘脑腹后内侧核（ＶＰＭ）直接投射的神经元与面口部伤害性刺激信息传递和ＳＰ能传入的关系，本研究用四甲基罗达明（ＴＭＲ）逆行追踪与Ｆｏｓ和ＳＰ受体免疫组织化学染色相结合的双标方法研究了Ｖｃ向ＶＰＭ投射的神经元。结果表明：（１）Ｆｏｓ阳性神经元主要分布在Ｖｃ浅层（Ⅰ、ⅠⅠ层）；（２）ＳＰ受体（ＳＰＲ）阳性神经元也主要分布在Ｖｃ浅层；（３）ＴＭＲ注射入一侧ＶＰＭ，逆标神经元仅见于对侧Ｖｃ和双侧延髓网状结构（ＭＲＦ）；（４）ＶｃⅠ层内ＴＭＲ逆标神经元总数的２２．３％为Ｆｏｓ阳性，１１．７％为ＳＰＲ阳性；（５）Ｖｃ深层内ＴＭＲ逆标神经元总数的１３．１％为Ｆｏｓ阳性，８．５％为ＳＰＲ阳性；（６）ＭＲＦ内ＴＭＲ逆标神经元总数的４３．３％为Ｆｏｓ阳性，５．１％为ＳＰＲ阳性。上述结果提示：（１）Ｖｃ及ＭＲＦ内直接向ＶＰＭ投射的部分神经元感受面口部伤害性刺激信息；（２）ＶｃⅠ层内直接向丘脑投射的部分神经元可能接受外周ＳＰ能的初级传入。     

大鼠三叉神经尾侧亚核mGluR7、PAG和Glu-ir神经元的定位

本文应用免疫组织化学技术研究了大鼠三叉神经尾侧亚核(Vc)内代谢型谷氨酸受体7亚型(mGluR7)、磷酸激活的谷氨酰胺酶(PAG)和谷氨酸(Glu)免疫阳性神经元的定位.结果显示mGluR7阳性胞体和纤维主要分布于Vc浅层(Ⅰ,Ⅱ层),在深层只有散在分布.Glu和PAG阳性胞体分布于Vc各层,尤以浅层密集,Glu和PAG阳性纤维及终末主要分布于Vc浅层.以上结果表明Glu阳性纤维及终末和mGluR7亚型阳性胞体及纤维在Vc内的分布是相互匹配的,本文还对Vc内Glu和mGluR7在伤害性信息传递和调控中的机能意义进行了讨论.     

大鼠延髓背角内GABA或甘氨酸免疫阳性终末与Fos阳极投射神经元的联系

目的：观察大鼠延髓背角（MDH）内向丘脑或臂旁核投射的Fos阳性神经元与γ-氨基丁酸（GABA）或甘氨酸（Gly）阳性终末的联系。方法：四甲基罗达明（TMR）逆行追踪结合TMR、Fos、GABA或Gly的免疫荧光三重染色技术。结果：GABA或Gly阳性终末主要分布于延髓背角浅层（Ⅰ、Ⅱ层）；给予面口部痛刺激后，Fos阳性神经元也主要分布于浅层；TMR注入一侧丘脑或臂旁核，逆标神经元分别主要见于对侧或同侧MDH的浅层；部分逆标神经元呈Fos阳性；GABA或Gly阳性终末与Fos阳性投射神经元形成密切接触。结论：MDH内感受面口部伤害性刺激信息的部分神经元向丘脑或臂旁核投射，GABA或Gly可能对这些伤害性感受神经元发挥抑制作用。     

大鼠垂体前叶内SP-免疫阳性神经纤维与其周围组织结构中的神经纤维的关系

用周围组织结构完整的大鼠垂体的连续切片，结合免疫组织化学方法，分析大鼠垂体前叶内ＳＰ－免疫阳性神经纤维与其周围组织结构中的ＳＰ－免疫阳性神经纤维的关系。结果显示：垂体前叶的周围脑膜中有着大量的ＳＰ－免疫阳性神经纤维和纤维束，并发出分支，进入垂体前叶内部。同时在垂体两侧的动、静脉壁上亦有着大量的ＳＰ－免疫阳性神经纤维及纤维束，与走行在前叶表面的ＳＰ－免疫阳性神经纤维束相连。此外，在垂体柄腹侧的门静脉壁上有大量的ＳＰ－免疫阳性神经纤维束与垂体前、后叶吻侧血管旁的ＳＰ－免疫阳性神经纤维或纤维束相连。     

一氧化氮合酶阳性神经元在大鼠延髓网状背侧亚核传入投射通路上的分布

目的 探讨一氧化氮合酶(NOS)阳性神经元在大鼠延髓网状背侧亚核传入投射通路上的分布。方法 还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶组织化学和荧光金(FG)逆行追踪法相结合方法。结果 在脊髓后角Ⅰ层、Ⅹ层以及中缝背核、中缝线形核、中缝隐核等处有不同比例的NOS／FG双标神经元，在中脑导水管周围灰质存在较多NOS单标和FG单标神经元，但未见NOS／FG双标神经元。结论 NO作为一种神经信息物质在SRD的传入投射通路上发挥着一定的作用。     

氯胺酮在大鼠脊髓背角胶状质内对突触前神经递质释放的影响

为探讨临床有效浓度的氯胺酮(ketamine,KTM)在脊髓背角胶状质(substansia gelatinosa,SG)内对突触前神经递质释放的影响及其作用机制,本研究应用红外可视神经组织薄片全细胞膜片钳记录方法,在电压钳模式下,观察了KTM对自发性抑制性和兴奋性突触后电流(spontaneous inhibitory and excitatory postsynaptic currents,sIPSCs and sEPSCs)的频率和幅值的影响。结果显示:(1)钳制电压在0mV时,在人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid,ACSF)中加入10-5mol/LAP-V和10-6mol/LCNQX,可记录到sIPSCs。将此时记录到的频率和幅值都作为前对照组的基础值(100%)。给予10-4mol/LKTM后,与前对照组相比,sIPSCs频率为127.93%±25.17%(P<0.05),幅值为104.78%±11.35%(P>0.05,n=7);(2)钳制电压为-70mV时,在ACSF中加入3×10-7mol/L士的宁和10-6mol/L荷包牡丹碱后,可观察到sEPSCs。加入10-4mol/LKTM后,与前对照组相比,sEPSCs的频率和幅值分别为97.89%±4.06%和101.63%±7.66%(P>0.05,n=8)。以上结果提示:(1)KTM增加了sIPSCs的频率,而对幅值没有明显影响,即KTM引起突触前抑制性神经递质的释放增加,而对突触后神经元的作用不明显;(2)KTM对sEPSCs的频率和幅值均未见明显影响,说明KTM在SG内对兴奋性神经递质的释放无显著影响。由此我们推测KTM在脊髓SG内主要通过增强抑制性信息传递发挥作用,KTM增强SG内突触前抑制性神经递质释放可能与其在脊髓背角发挥麻醉和镇痛作用有关。