猪囊尾蚴一种蛋白抗原的cDNA分子克隆

目的从猪囊尾蚴cDNA文库中克隆某种编码蛋白抗原的基因.方法用脑囊尾蚴病人血清筛选猪囊尾蚴cDNA文库,获得阳性克隆后,经PCR技术扩增噬菌体载体中插入的cDNA片段,并将其亚克隆入pUC18质粒载体中,用双脱氧核苷酸末端终止法测定插入片段的核苷酸序列.测序后与GenBank中的核苷酸序列进行同源性分析.结果经3次筛选,从cDNA文库中克隆出一个阳性克隆,测序后其长度为546 bp,含有一个开放读码框,编码158个氨基酸.同源序列分析结果表明此基因片段与编码猪囊尾蚴的一种免疫原性蛋白基因(NC-9)同源性高达99%.结论本研究克隆出一种编码猪囊尾蚴蛋白抗原的基因.     

猪囊尾蚴cDNA文库的筛选与重组蛋白的初步鉴定

目的从猪囊尾蚴cDNA文库中免疫学筛选阳性蛋白的编码基因,以期获得囊尾蚴病新的免疫学诊断候选分子。方法免疫学筛选cDNA文库,用PCR法扩增出猪囊尾蚴候选蛋白基因编码序列,T载体连接,鉴定后将其亚克隆入pET28a(+)载体中,经酶切、测序证实正确后,转化入大肠杆菌BL21并用IPTG对该重组菌诱导表达,SDS-PAGE和Western blot方法观察表达结果。结果通过cDNA文库免疫筛选、测序和EXPASY软件分析,其一个684bp ORF DNA序列为新基因(命名为Ts1),录入号为EU009656;将Ts1基因克隆入pET28a(+)载体中诱导表达,可得到一分子量约28.0kDa融合蛋白,并能被囊尾蚴病人血清识别。结论本试验成功筛选、克隆出一个新囊尾蚴编码基因,并在原核细胞中表达,为进一步验证其免疫诊断价值奠定了基础。     

猪囊尾蚴Ts2基因的免疫筛选克隆及生物信息学分析

目的筛选并分析猪囊尾蚴新基因,为猪囊尾蚴病患者的免疫学诊断提供特异的重组抗原及有效的疫苗候选分子。方法用猪囊尾蚴病患者血清抗体筛选猪囊尾蚴cDNA文库,将所获阳性克隆的插入片段进行扩增并测序,通过互联网NCBI GenBank和蛋白质分析软件进行分析。结果筛选阳性克隆,经分析具有738bp完整开放阅读框,是1个新基因,登录号EU221317,命名为Ts2。结论成功克隆了猪囊尾蚴Ts2基因片段,为进一步实验提供了条件。     

Mago nashi:一个日本血吸虫性别决定基因的发现与鉴定

目的　运用免疫学方法筛选日本血吸虫 (中国大陆株 )童虫cDNA文库 ,寻找血吸虫新基因 ,并克隆和鉴定一个日本血吸虫决定性别的Magonashi样蛋白基因。方法　用混合的血吸虫感染者血清免疫学筛选日本血吸虫童虫cDNA文库 ,随机挑取阳性重组克隆进行测序 ,以获得血吸虫基因 ,并通过BLAST程序进行比较及同源性分析 ,根据分析结果设计合成引物 ,用PCR法扩增出日本血吸虫Magonashi样蛋白基因 (SiM)编码序列 ,将其克隆入pGEM T载体和 pBKCMV载体 ,用双酶切、以质粒为模板进行PCR扩增和测序进行鉴定。结果　本研究共挑取 7个阳性克隆 ,通过测序获得了 5个有表达序列标签(ExpressedSequenceTag .EST)价值的序列 ,并进行了同源性分析 ;用PCR法扩增出大小为 4 4 1bpSjM开放阅读框 ,重组质粒pGEM SjM和 pBKCMV SjM经双酶切均可获得一条为PCR产物一致的DNA片段。 结论　本实验获得了 5个有EST价值的序列 ,并成功地克隆了其中SjM编码基因。     

猪囊尾蚴抗原基因GP50的表达及鉴定

目的为了寻找猪囊尾蚴病新的免疫学候选诊断分子,克隆猪囊尾蚴抗原GP50编码基因,并进行表达、鉴定。方法设计合成引物,用PCR法从猪囊尾蚴cDNA文库中扩增出猪囊尾蚴抗原GP50基因编码序列,将其克隆入pGEM-T载体,然后在真核表达载体pBKCMV中亚克隆,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Westernblot观察表达结果。结果RT-PCR法扩增出一条大小约897bp的特异性片段,克隆质粒pGEM-GP50和真核表达质粒pBKCMV作BamHⅠ和XhoⅠ双酶切和以重组质粒为模板进行PCR扩增,均可获得一条与PCR产物一致的DNA片段。诱导表达后,经SDS-PAGE可见一条约36kDa大小的融合蛋白条带,Western blot结果显示其可与猪囊尾蚴病人血清起反应。结论本实验成功地克隆了猪囊尾蚴抗原GP50编码基因,并在原核细胞中进行了表达及鉴定,为进一步的免疫诊断研究奠定了基础。     

猪带绦虫抗原基因TS76的克隆及原核表达

目的　测定和分析自猪囊尾蚴表达型cDNA文库中筛选出的cDNA克隆 (TS76 )的序列 ,并进行该片段的原核表达研究。方法　采用PCR扩增重组 (噬菌体 (TS76中的TS76cDNA片段 ,亚克隆至 pUC18,得到的重组子用于测序 ,并对测定结果进行分析及同源性比较 ;将TS76片段亚克隆到原核表达载体pGEX - 1(T中 ,免疫印迹方法筛选得到能正确表达TS76片段的重组子 pGTS76 ;制备pGTS76原核表达产物 ,进行浓度梯度SDS -PAGE和Westernblotting分析。 结果　TS76克隆含 5 16对核苷酸 ,编码含 83个氨基酸残基的多肽 ,与EMBL数据库中的猪囊虫免疫原性蛋白质mRNA有 383bp的同源区域。重组质粒在大肠杆菌中表达的融合蛋白分子量为 34KD ,能与抗猪囊尾蚴兔血清产生很强的免疫反应。结论　分离到一个编码具较强免疫原性猪囊尾蚴抗原的基因。     

日本血吸虫童虫文库免疫筛选及其高丰度表达膜蛋白初步鉴定

目的 获得新的可能具有诊断意义的血吸虫蛋白分子并对其鉴定。 方法 免疫学方法筛选日本血吸虫童虫cDNA文库，对获得的阳性克隆进行测序分析，设计引物体外扩增目的蛋白基因，将其亚克隆入原核表达载体pET28a中，并转化大肠埃希菌BL21，进行诱导表达，最后用Western blotting鉴定。 结果 获得34个阳性克隆，选择其中24个进行测序，其中13个是日本血吸虫相对分子质量（Mr）为22 600膜相关蛋白（Sj22.6）基因。Sj22.6基因在体外被成功扩增，并被亚克隆入pET28a中进行表达。Western Blotting 结果显示，菌体表达的条带可以被感染兔血清以及血吸虫患者血清识别。 结论 Sj22.6膜相关蛋白基因在童虫cDNA文库中可以被高频率筛出，融合蛋白Sj22.6成功地在BL21中表达并具有免疫反应性。     

Mago nashi：—个日本血吸虫性别决定基因的发现与鉴定

目的运用免疫学方法筛选日本血吸虫(中国大陆株)童虫cDNA文库，寻找血吸虫新基因，并克隆和鉴定一个日本血吸虫决定性别的Mago nashi样蛋白基因。方法用混合的血吸虫感染者血清免疫学筛选日本血吸虫童虫eDNA文库，随机挑取阳性重组克隆进行测序，以获得血吸虫基因，并通过BLAST程序进行比较及同源性分析，根据分析结果设计合成引物，用PCR法扩增出日本血吸虫Mago nashi样蛋白基因(SiM)编码序列，将其克隆入pGEM—T载体和pBKCMV载体，用双酶切、以质粒为模板进行PCR扩增和测序进行鉴定。结果本研究共挑取7个阳性克隆，通过测序获得了5个有表达序列标签(Expressed Sequenee Tag.EST)价值的序列，并进行了同源性分析；用PCR法扩增出大小为441bp SjM开放阅读框，重组质粒pGEM—SiM和pBKCMV-SjM经双酶切均可获得一条为PCR产物一致的DNA片段。结论本实验获得了5个有EST价值的序列，并成功地克隆了其中SjM编码基因。     

猪囊尾蚴RNA聚合酶亚基基因的筛选及结构初探

目的　从构建的剪切引导序列(SL)cDNA文库中筛选猪囊尾蚴相关基因。　方法　提取猪囊尾蚴总RNA,利用SL特异序列和带有噬菌体M13M4的olig(dT)为引物,反转录成cDNA,构建猪囊尾蚴SLcDNA文库。随机筛选并通过酶切、PCR鉴定阳性克隆,分析其同源性。　结果　鉴定出一 332bp的插入片段,含有204bp的开放阅读框(ORF)和 3′端20bp的polyA尾巴,经核苷酸和氨基酸序列分析,所克隆的基因的氨基酸序列与其他真核生物如人、秀丽隐杆线虫、果蝇及拟南芥等的RNA聚合酶亚基基因同源性均高达71.6%以上。　结论　筛选鉴定的基因推测为猪囊尾蚴RNA聚合酶亚基基因,而且在不同物种间很保守。     

猪囊尾蚴抗原-B基因cDNA编码区的克隆

[目的 ]扩增和克隆猪带绦虫囊尾蚴 Ag B基因的 c DNA编码区。 [方法 ]提取猪囊尾蚴总 RNA中 ,利用 RT- PCR技术扩增出 Ag B基因 c DNA编码区 ,然后将其克隆到载体 p UC118中进行序列分析。 [结果 ]PCR反应产物为单一条带 ,大小为 2 .6 kb。测序结果与澳大利亚株猪囊尾蚴 Ag B序列有 99.8%的同源性 ,二者的氨基酸序列有 99.3%的同源性。 [结论 ]成功地克隆了猪囊尾蚴 Ag B基因 c DNA编码区。     

猪囊尾蚴跨膜蛋白T24基因的克隆及序列分析

目的 寻找猪囊尾蚴病新的免疫学候选诊断分子.方法 设计合成引物,用PCR法从猪囊尾蚴cDNA文库中扩增出猪囊尾蚴跨膜蛋白T24基因编码序列,将其与线性克隆载体PMD-18T连接,分别进行酶切和PCR鉴定及DNA测序证实.结果 PCR法扩增出一条长度约678 bp的特异性片段,将重组质粒PMD-18T-T24作BamHⅠ和XhoⅠ双酶切,均能得到一个大小与PCR扩增产物一致的插入片段,对插入片段的测序结果表明,T24具有一个长度为678 bp的完整开放阅读框,编码225个氨基酸,理论分子量为23.91 kDa,与GenBank收录的猪囊尾蚴T24基因(编号为AY211879)具有高度的同源性(99.85%).结论 猪囊尾蚴跨膜蛋白T24编码基因克隆成功,为进一步的表达、鉴定及免疫诊断研究奠定了基础.     

猪囊尾蚴磷蛋白基因P2的克隆及在大肠杆菌中的表达

本研究从猪囊尾蚴虫体中提取总RNA ,用磷蛋白特异性引物 ,通过RT -PCR扩增出 - 36 6bp的片段 ,扩增产物连接到PGEM -Teasy载体中 ,经酶切鉴定、PCR分析以及确证性测序后证明 ,所克隆的 36 6bp的片段含P2蛋白基因完整的开放阅读框。将重组质粒PGEM -P2和表达载体pProEX -HTb分别酶切后 ,亚克隆至原核表达载体 pProEX -HTb中 ,筛选阳性克隆 ,用IPTG诱导表达 ,收集不同时间的菌液进行SDS -PAGE电泳、Westernblot分析 ,结果表明 ,磷蛋白基因 p2在大肠杆菌中成功表达 ,其表达产物为分子量 15kDa的融合蛋白 ,并能被猪囊虫阳性血清所识别。     

猪囊尾蚴Ts3基因的克隆表达及编码蛋白的结构预测

目的寻找猪囊尾蚴病诊断抗原候选分子基因。方法用猪囊尾蚴病患者血清免疫筛选cDNA文库,用生物学软件EXPASY预测分析所获阳性蛋白基因(Ts3)及其编码蛋白的理化性质。对Ts3基因进行克隆,构建原核表达载体pET28a(+)-Ts3,并用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)分析观察其表达情况。结果获得大小为531bp的含完整阅读框(ORF)DNA序列的基因Ts3(GenBank登录号为EU338456),预测分析该蛋白结构和理化性质比较稳定,为非跨膜蛋白和含有较多蛋白激酶C磷酸化位点;将Ts3基因克隆入载体pET28a(+)诱导表达,获得相对分子质量(Mr)约21000蛋白,并能被囊尾蚴病患者血清识别。结论囊尾蚴Ts3重组蛋白具有免疫反应性。