高糖状态下人牙龈上皮细胞的生物学特性

目的观察高糖状态对人牙龈上皮细胞生物学特性的影响。方法原代培养人牙龈上皮细胞(h GEC),取第三代细胞分为正常组(培养液含5.5 mmol/L D-葡萄糖)、高糖组(培养液含25 mmol/L D-葡萄糖)和甘露醇组(含5.5 mmol/L D-葡萄糖及19.5 mmol/L甘露醇的培养基),采用MTS法检测细胞的增殖情况,流式细胞术检测细胞的生长周期及凋亡情况,划痕实验检测细胞迁移能力。采用重复测量的方差分析进行统计分析。结果高糖组、正常组、甘露醇组三组h GEC相比较,细胞增殖活性(F=5.053,P=0.052)、细胞周期分布(F=1.252,P=0.351)及凋亡细胞比例(F=0.325,P=0.717)差异均无统计学意义;划痕24 h时,糖尿病组的划痕迁移率显著低于正常组(F=54.453,P=0.000)。结论高糖状态下h GEC增殖及凋亡无显著性改变,但细胞迁移能力出现显著下降。     

不同浓度葡萄糖对人牙髓细胞增殖凋亡及矿化的影响

目的:探讨人牙髓细胞(hDPCs)在不同浓度葡萄糖作用下，细胞增殖凋亡及矿化情况。方法:体外培养的第4代hDPCs分为正常组、高糖1组和高糖2组，分别用含葡萄糖浓度为0、 5.5、 40和50 mmol/L的培养基培养，21 d后CCK-8实验检测细胞存活率，流式细胞仪检测细胞凋亡率，qRT-PCR检测DMP1和DSPP mRNA相对表达量；茜素红染色观察矿化结节情况，试剂盒检测MDA含量及SOD和ALP活性，Wester blot检测Bcl-2、Bax及DSPP和DMP1蛋白相对表达量。结果:正常组矿化结节明显，其余2组矿化结节少。正常组细胞存活率、SOD和ALP活性、DMP1和DSPP mRNA相对表达量、Bcl-2以及DMP1和DSPP蛋白相对表达量均高于高糖1组(P<0.05)和高糖2组(P<0.05),而细胞凋亡率、MDA含量、Bax蛋白相对表达量均低于高糖1组(P<0.05)和高糖2组(P<0.05)，以上指标差异在高糖2组比1组更明显(P<0.05)。结论:高糖抑制人牙髓细胞增殖和矿化，可能是高糖增强氧化应激反应引起。     

胰岛素对高糖条件下体外培养的大鼠牙囊细胞增殖、分化的影响

目的:探讨胰岛素对高糖条件下体外培养的大鼠牙囊细胞(dental follicle cells,DFC.)增殖、分化的影响.方法:取出生7d的SD大鼠上、下颌磨牙牙囊,原代培养牙囊细胞,选取生长状态良好的第4代细胞,在糖生理浓度(5.5mmol/L)和高糖条件下(16.5 mmol/L和49.5 mmol/L)与6μg/mL胰岛素共同孵育,分别于培养1、3、7、9d时采用MTT法和1～7d采用碱性磷酸酶试剂盒检测胰岛素对高糖条件下体外培养的大鼠牙囊细胞增殖、分化的影响.采用SPSS13.0软件包对数据进行统计学分析.结果:所培养的细胞波形丝蛋白阳性,角蛋白阴性.在第1、3天,16.5mmol/L葡萄糖促进第4代大鼠牙囊细胞的增殖,而49.5 mmol/L葡萄糖抑制牙囊细胞的增殖,胰岛素下调16.5 mmol/L葡萄糖下牙囊细胞的增殖,上调49.5 mmol/L葡萄糖下牙囊细胞增殖;在第7、9天,高糖促进牙囊细胞增殖,胰岛素上调高糖下牙囊细胞的增殖.在1～7d内,高糖提高第4代大鼠牙囊细胞碱性磷酸酶活性,胰岛素下调高糖下牙囊细胞的碱性磷酸酶活性(P<0.05).结论:本实验培养的细胞是来源于外胚层间充质的牙囊细胞.实验结果表明,胰岛素能纠正急性高糖对大鼠牙囊细胞增殖和分化的影响.     

骨形态发生蛋白7在高糖环境下对成骨细胞分化的影响

目的:研究对于重组人骨形态发生蛋白7(bone morphogenetic protein7,BMP7)在持续稳定高糖环境下对成骨细胞生物学性能及成骨活性的影响。方法:细胞取小鼠颅顶前成骨细胞亚克隆14(MC3T3-E1Subclone 14,MC3T3),分为4组:正常生理糖浓度组(葡萄糖浓度为5.5 mmol/L)为对照组,生理糖浓度+BMP7组高糖组(葡萄糖浓度为5.5 mmol/L,BMP7浓度为100 μg/L)(葡萄糖浓度为25 mmol/L),高糖+BMP7组(葡萄糖浓度为25 mmol/L,BMP7浓度为100 μg/L)。甲基噻唑基四唑(MTT)法检测不同条件培养后1 d、3 d、5 d、7 d后的细胞增殖情况,成骨诱导检测细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性。罗丹明-鬼笔环肽染色后以激光共聚焦显微镜观察MC3T3细胞骨架于BMP7作用24h后的形态变化,荧光实时定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-qPCR)检测BMP7作用48 h后成骨基因特异性转录因子2(Runx2),骨钙素(osteocalcin,OCN)、碱性磷酸酶(ALP)的mRNA表达。结果:MTT实验显示25 mmol/L葡萄糖可抑制MC3T3增殖(P<0.05),加入BMP7后可提高细胞增值率(P<0.05)。并可上调高糖导致的ALP活性下降。细胞骨架观察结果显示,对照组细胞骨架成束状铺开,交织成网,较为均匀。高糖组细胞微丝解聚成团状,模糊不清。RT-qPCR结果显示BMP7可促进MC3T3细胞的ALP、OCN及Runx2(P<0.05)的表达。结论:持续稳定高糖环境能够抑制成骨细胞的增殖及ALP活性,影响细胞骨架结构,抑制成骨基因表达,添加BMP7可以在不同程度上反转该趋势,但仍较正常水平低。     

糖基化终产物对人牙周膜细胞增殖和NF-κB mRNA表达的影响

目的:研究比较在体外高糖、糖基化终产物(advanced glycation end of products,AGEs)刺激环境下对人牙周膜细胞(hPDLFs)增殖能力和NF-κB mRNA表达的影响。方法:选取因正畸治疗而拔除的前磨牙体外分离培养人牙周膜细胞,根据不同的刺激环境分为阴性对照组(5.5 mmol/L葡萄糖)、高糖组(25 mmol/L葡萄糖)、AGEs组(100μg/mL AGEs)3组。培养12、24、36 h,3个时间点,使用Real Time PCR检测各组NF-κBmRNA的表达差异情况;流式细胞仪检测培养hPDLFs 36 h时细胞增殖差异情况。结果:在培养12、24、36 h,高糖组和AGEs组NF-κB mRNA的表达均高于阴性对照组(P<0.05),其中AGEs组最高,与高糖组相比,24、36 h时均有统计学差异(P<0.05);培养36 h AGEs组hPDLFs增殖能力明显低于阴性对照组和高糖组(P<0.05);高糖组与阴性对照组相比无统计学差异(P>0.05)。结论:AGEs能够显著的抑制hPDLFs增殖,并上调NF-κB的表达呈时间依赖性。     

血清饥饿法对人牙髓细胞周期同步化的研究

血清直接饥饿和梯度饥饿处理人牙髓细胞。倒置显微镜观察细胞形态;CCK-8检测血清饥饿处理对HDPCs增殖能力的影响;流式细胞术检测细胞周期验证HDPCs同步化的效果。结果:血清直接饥饿处理或梯度饥饿处理后其G0/G1期HDPCs的比例均显著高于一般培养组(P<0.05),但血清直接饥饿组和梯度饥饿组间无显著性差异(P>0.05)。用含5mL/L FBS的DMEM培养基培养48h能获得较满意     

P38MAPK信号通路抑制剂SB203580对高糖状态下成骨细胞MC3T3-E1增殖和分化的影响

目的:探讨P38MAPK信号通路抑制剂SB203580对高糖状态下成骨细胞MC3T3-E1增殖和分化的影响。方法:将培养的MC3T3-E1细胞按培养基内含葡萄糖浓度分为5.5 mmol/L正常对照组,25.5 mmol/L高糖组和25.5 mmol/L+SB203580组,观察细胞增殖、碱性磷酸酶(ALP)、矿化结节(AR-S)、成骨相关基因Runx2和OCN mRNA的表达。结果:高糖培养后,MC3T3-E1细胞增殖明显受到抑制(P<0.05)。高糖组的ALP活性光密度值在各个时间点均低于对照组(P<0.05),OCN mRNA,Runx2 mRNA表达随着葡萄糖浓度升高而明显下降,给予SB203580处理后,细胞增殖仍呈下降趋势,OCN、Runx2 mRNA、ALP活性较未加入抑制剂组升高。结论:SB203580可抑制P38MAPK在高糖状态对MC3T3-E1的作用。     

胰岛素对高糖环境下大鼠颌骨骨髓基质细胞成骨分化过程中peroxiredoxin-6表达的影响

目的：探讨胰岛素对高糖环境下大鼠颌骨骨髓基质细胞(rat bone marrow stromal cells, rBMSCs)成骨分化过程中peroxiredoxin-6表达的影响。方法：从Wistar大鼠下颌骨中分离培养骨髓基质细胞,分别于不同糖浓度(5.5、25、45 mmol/L)及胰岛素(0、10-5 mol/L)的干预下成骨诱导(5.5 mmol/L组、5.5 mmol/L +Ins组、25 mmol/L组、25 mmol/L+Ins组、45 mmol/L组、45 mmol/L+Ins组)。成骨诱导21 d后,进行茜素红染色,矿化结节定量分析。成骨诱导1、3、7、14、21 d后, 用ELISA试剂盒检测peroxiredoxin-6蛋白的表达。采用SPSS15.0软件包对数据进行统计学分析。结果：45 mmol/L高糖环境显著抑制rBMSCss的矿化,胰岛素可改善高糖对rBMSCs矿化的抑制。45 mmol/L组peroxiredoxin-6的表达较5.5 mmol/L组和25 mmol/L组均显著下降。矿化诱导第21天,各组peroxiredoxin-6蛋白的表达均达到最高峰。在25 mmol/L和45 mmol/L的糖浓度下,10-5 mol/L的胰岛素可显著上调rBMSCs peroxiredoxin-6蛋白的表达。结论：高糖环境抑制peroxiredoxin-6蛋白的表达,胰岛素可改善高糖环境对peroxiredoxin-6蛋白在大鼠颌骨骨髓基质细胞成骨分化过程中表达的影响。Peroxiredoxin-6蛋白在大鼠颌骨骨髓基质细胞成骨分化后期表达显著。     

血清饥饿法对人牙髓细胞周期同步化的研究

目的:探讨不同的血清饥饿方法和饥饿时间对人牙髓细胞(HDPCs)细胞周期的影响.方法:血清直接饥饿和梯度饥饿处理人牙髓细胞.倒置显微镜观察细胞形态;CCK-8检测血清饥饿处理对HDPCs增殖能力的影响;流式细胞术检测细胞周期验证HDPCs同步化的效果.结果:血清直接饥饿处理或梯度饥饿处理后其G0/G1期HDPCs的比例...     

富血小板血浆促进人牙髓细胞增殖的实验研究

目的探讨不同浓度富血小板血浆(Platelet rich plasma,PRP)对人牙髓细胞(human dental pulp cells,HDPCs)的增殖作用。方法两步离心法制备PRP,通过ELISA的方法测定PRP中两种主要生长因子血小板源性生长因子(PDGF-AB)和转化生长因子(TGF-β1)的浓度;用四唑盐比色法(MTT)观察5%、10%、20%PRP在2d、4d时对牙髓细胞的增殖作用,并探讨这种作用是否依赖于胎牛血清(FBS)的存在。结果所制备的PRP中血小板的浓度大于1000×109个/L,为全血中的4倍以上,经ELISA的方法测定PRP及贫血小板血浆(Platelet poor plasma,PPP)中PDGF-AB、TGF-β1的浓度分别增加4倍以上。MTT法测定不同浓度组的PRP对牙髓细胞均有增殖作用,以10%PRP增殖效应最明显,P值均<0.05;4d时PRP对细胞的增殖作用明显强于2d时,P值<0.05;10%PRP组较10%胎牛血清组增殖作用明显,P值<0.05。结论本实验制备的PRP含有较高浓度的PDGF-AB及TGF-β1,不同浓度的PRP均能有效促进牙髓细胞增殖,以10%PRP浓度增殖效应最明显;并且这种增殖作用并不依赖于胎牛血清的存在;随着时间延长,PRP对细胞增殖作用增加。     

The Effect of SIRT6 on the Odontoblastic Potential of Human Dental Pulp Cells

Introduction

The aim of this study was to investigate whether SIRT6 is expressed in human dental pulp as well as the effect of SIRT6 on proliferation and odontoblastic differentiation of human dental pulp cells (HDPCs).

Methods

Immunohistochemical and immunocytochemical assays were used to detect the expression of SIRT6 in human dental pulp tissue and HDPCs. To determine the effect of SIRT6 on odontoblast differentiation, HDPCs with loss (HDPCs SIRT6 knockdown) and gain (HDPCs SIRT6 overexpression) of SIRT6 function were developed, and their proliferation ability was examined. Odontogenic differentiation of HDPCs was determined by alkaline phosphatase (ALP) activity, ALP-positive cell staining, alizarin red staining, and von Kossa staining. Mineralization-related genes, including ALP, dentin sialophosphoprotein (DSPP), and dentin matrix acidic phosphoprotein 1, were determined by real-time quantitative polymerase chain reaction. Western blot analysis was performed to detect the expression of DSPP protein.

Results

SIRT6 was found in the dental pulp tissue and HDPCs. SIRT6 knockdown decreased ALP activity in HDPCs; calcium nodule formation ability; and the expression of mineralization-related genes such as ALP, DSPP, and DMP1, whereas these were increased with the overexpression of SIRT6.

Conclusions

SIRT6 is expressed in human dental pulp and participates in the odontoblast differentiation of HDPCs.     

低分子釉原蛋白的纯化及其对人牙髓细胞和牙周膜细胞作用的研究

目的：纯化低分子猪釉原蛋白（LMWPA）,并观察其对人牙髓细胞（HDPCs）和牙周膜细胞（HPLCs）增殖及碱性磷酸酶（ALP）活性的影响。方法：取六月龄猪第二磨牙牙胚牙釉质,用液相色谱法分离纯化LMWPA,分别采用MTT法和酶动力学方法测定LMWPA对HDPCs和HPLCs的体外作用。结果：得到的LMWPA是分子量约为5.0KDa的单一组分;在50和100μg/mL时,能的显著促进HDPCs和HPLCs的增殖,ALP活性上调（P〈0.01）;而在≥150μg/mL时,能显著抑制细胞的增殖,ALP活性下调（P〈0.01）。结论：LMWPA影响HDPCs和HPLCs的增殖和碱性磷酸酶活性,并存在剂量和时间依赖性。     

人牙龈上皮细胞上清液对牙髓细胞增殖及分化影响的研究

目的:研究体外培养的人牙龈上皮细胞(human gingival epithelium cells,HGECs)上清液对人牙髓细胞(human dental pulp cells,HDPCs)增殖及分化的影响,探讨在体外建立HGECs和HDPCs共培养模型的可行性。方法:采用组织块法分别进行HGECs和HDPCs原代培养,收集第2、4、6d的HGECs上清液,均以10%、30%、50%浓度作用于HDPCs,MTT法测定HDPCs增殖情况,通过测定细胞裂解液中ALP水平研究对HDPCs分化的影响,以加入相应浓度的上皮细胞培养基K-SFM为对照。结果:加入不同浓度的第2、4、6d的HGECs上清液后HDPCs的增殖均上升,并有促进HDPCs分化的作用,而对照组则抑制了HDPCs增殖和分化。结论:体外培养HGECs的上清液能够促进HDPCs增殖和分化。     

神经生长因子对人牙髓细胞增殖与分化作用的研究

目的 研究神经生长因子对体外培养的人牙髓细胞增殖和分化作用的影响。方法 组织块法行人牙髓细胞的原代培养后，采用四唑盐比色法和酶动力学方法，测定不同浓度（1、10、100U／mL）的神经生长因子对体外培养的第5-8代人牙髓细胞增殖及碱性磷酸酶活性的作用。结果 与对照组相比，10U／mL的神经生长因子可显著促进人牙髓细胞的增殖（P〈0．05）；100U／mL的神经生长因子可显著促进碱性磷酸酶的活性（P〈0．01）。结论 不同浓度的神经生长因子可显著促进人牙髓细胞的增殖与分化。     

人牙髓干细胞体外分选分化的初步实验研究

目的体外培养人牙髓细胞,分选牙髓干细胞并诱导其分化。方法选择因正畸目的而拔除的健康完整双尖牙,酶消化法进行牙髓细胞培养,并进行来源鉴定。单抗Stro-1标记牙髓干细胞、免疫磁珠分选系统进行分选。矿化液定向诱导分选后的牙髓干细胞,比较诱导前后stro-1染色及改良Gomori钙钴法染色检测碱性磷酸酶（ALP）的改变。结果体外培养人牙髓细胞呈成纤维细胞样,抗波形丝蛋白染色阳性,抗角蛋白染色阴性。牙髓干细胞Stro-1检测阳性,牙髓细胞中干细胞阳性率约为10％。矿化诱导后细胞stro-1阴性、ALP阳性表达。结论采用免疫磁珠分选系统分离出人牙髓干细胞,初步验证干细胞分化潜能,为其后续生物学特性研究提供实验基础。     

人牙髓干细胞体外分选分化的初步实验研究

目的 体外培养人牙髓细胞,分选牙髓干细胞并诱导其分化.方法 选择因正畸目的 而拔除的健康完整双尖牙,酶消化法进行牙髓细胞培养,并进行来源鉴定.单抗Stro-1标记牙髓干细胞、免疫磁珠分选系统进行分选.矿化液定向诱导分选后的牙髓十细胞,比较诱导前后Stro-1染色及改良Gomori钙钴法染色检测碱性磷酸酶(ALP)的改变.结果 体外培养人牙髓细胞呈成纤维细胞样,抗波形丝蛋白染色阳性,抗角蛋白染色阴性.牙髓干细胞Stro-1检测阳性,牙髓细胞中干细胞附性率约为10%.矿化诱导后细胞Stro-1阴性、ALP阳性表达.结论 采用免疫磁珠分选系统分离出人牙髓干细胞,初步验证干细胞分化潜能,为其后续生物学特性研究提供实验基础.