多聚酶链反应技术及其在临床血液学上的应用

多聚酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)是一种在体外由引物(primers)介导的特定DNA序列的酶扩增,又称基因扩增.这种技术能在数小时内合成一百多万个特定DNA序列考贝,既敏感,又快速、方便.因此,虽然PCR于1985年底首见报道,但其应用日趋广泛.本文就PCR原理、基本过程及其在临床血液学上的应用作一综述.PCR原理PCR扩增的DNA片段的特异性基于两个寡核苷酸引物,这两个引物位于待扩增的DNA片段的两侧,并与相应的DNA链互补.该过程包括:DNA热变性使之成为单链状,然后退火,使引物连接于与引物互补的特定DNA链上,再在DNA多聚酶的作用     

定量PCR技术

聚合酶键反应（PCR）是模拟DNA体内复制过程,在体外将DNA片段加以人工扩增的技术。有许多因素都可以影响PCR的扩增效率,导致常规PCR的特异性不强,准确性不高,为此,大量学者设计了定量PCR技术,以克服各种因素对PCR扩增的干扰,从而提高PCR的特异性及准确性。本文对定量PCR技术进行了简要的综述。     

应用巢式PCR检测孕妇血浆中cffDNA RHD基因型的研究

目的建立巢式PCR技术检测RhD阴性孕妇血浆中游离胎儿DNA(cffDNA)的RHD基因型,以预测胎儿RhD血型。方法采用QIAamp DNA Blood Mini Kit提取32例RhD阴性孕妇血浆游离DNA,针对RHD外显子7和10分别设计外侧、内侧2组特异性引物,巢式PCR方法检测孕妇血浆游离胎儿DNA的RHD型,测序验证PCR产物的序列特异性。结果孕妇血浆游离DNA经巢式PCR扩增后,有27例成功扩增出RHD外显子7、10特异性条带,5例未检测到RHD基因特异性扩增,32例中有30例胎儿RHD型与出生后血型相符,检测准确率为93.1%。结论采用巢式PCR技术检测RhD阴性孕妇血浆游离胎儿DNA来判定胎儿RHD型,具有良好的准确性、敏感性和特异性,为RhD新生儿溶血病的早期诊断提供了一种新的、可靠的检测手段。     

乙肝病毒基因组序列扩增的条件优化和结果分析

目的优化乙型肝炎病毒(HBV)不同长度基因片段PCR扩增条件,为后续机制研究提供实验基础。方法运用PCR或巢式PCR(Nested PCR)方法扩增6例临床乙肝患者HBV DNA,针对特异性目的片段,通过优化Mg2+浓度、引物浓度、Taq酶用量、DMSO浓度等,获得特异性扩增条带,PCR产物直接测序并使用CHROMAS、MEGA等生物学软件进行结果分析。结果通过综合分析各种实验条件对PCR扩增结果的影响,最终确认在50μL扩增体系中,2.5 mmol/L Mg2+、200 nmol/L特异性引物、1.5 U Taq酶、56℃退火在本实验室可获得良好的扩增效果,适量二甲基亚砜(DMSO)可减少非特异性干扰,同时建议对短片段可酌量减少Taq酶使用量。生物信息学分析示6例HBV感染标本中1例为B基因型,5例为C基因型,共发现S基因21个核酸变异及9个氨基酸可改变。结论建立了适合本实验室的HBV DNA扩增体系以及后续生物信息学分析方法,明确了不同的扩增体系条件对PCR扩增效果具有重要影响。     

PCR污染的来源及预防

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)能高效扩增目的DNA片段,在数h内完成20～50个循环,就可以使目的DNA扩增效百万倍。现已广泛用于基因的结构与功能的研究,并大大地推动了分子生物学及有关学科的飞速发展。 PCR不仅可用于基因的分离、克隆和核酸序列     

套式聚合酶链式反应诊断三日疟原虫感染的临床应用

目的应用套式聚合酶链式反应(PCR)扩增小亚单位核糖体核糖核酸(SSUrRNA)基因诊断三日疟原虫感染,以减少三日疟的漏诊和误诊。 方法分别提取可疑三日疟患者抗凝血DNA和对照间日疟、恶性疟患者抗凝血DNA,以此为模板,用疟原虫属特异性引物进行第一轮扩增;然后以第一轮扩增产物为模板,用4种疟疾的种特异性引物进行第二轮扩增,比较扩增出的18 SSU rRNA基因片段的大小,并对目的片段进行测序鉴定。 结果经属特异性引物PCR扩增后,3个样本均出现大小约为1200bp的条带。经种特异性引物PCR扩增后,间日疟及恶性疟确诊样本均扩增出相应的120bp和205bp特异性条带;可疑患者样本仅在用三日疟原虫种特异性作引物时扩增出144bp特异条带,与理论值相符,与Genbank标准序列对比显示,扩增片段大小及测序结果均完全正确。证实患者感染三日疟原虫。 结论利用小亚单位核糖体核糖核酸基因片段三日疟种特异引物进行扩增可以用于诊断三日疟原虫感染。     

巢式聚合酶链式反应检测布鲁氏菌核酸DNA方法的建立

目的建立一种具有灵敏性高,特异性强的巢式聚合酶链式反应(PCR)方法检测血液标本中布鲁氏菌核酸DNA。方法使用细菌基因组提取试剂盒提取纯菌核酸DNA;使用血液等组织基因组核酸DNA提取试剂盒提取血液标本核酸DNA,对提取的核酸DNA先行常规PCR预扩增,以扩增的PCR产物为模板进行荧光定量PCR第二次扩增(即巢式PCR)。对纯菌提取的核酸DNA进行灵敏度和和特异性测试,构建巢式PCR的Ct值与核酸DNA拷贝数之关系曲线;检测临床血液标本核酸DNA,同时比较常规两种PCR方法检测结果。结果常规PCR检测的灵敏度为512个核酸DNA拷贝数;巢氏PCR检测有效范围为921.6 ng/μl^6.8 fg/μl,对应的Ct值为12.04~37.50,其指数关系为:y=(e-0.695x)×1012;R2=0.9986,巢式PCR扩增效率为2.28×109倍,检测限为2个布鲁氏核酸DNA拷贝数。巢式PCR的灵敏度为91.67%,特异度为93.10%,阳性预测值为91.67%,阴性预测值为93.10%。对一起羊养殖场采集的25份血液标本应用巢式PCR方法检测,结果阳性率为92.00%(23/25);27份健康人群血液标本没有检测出(无Ct值)。结论巢式PCR具有较好的灵敏性和特异性,特别适合于血液标本布鲁氏菌核酸DNA的检测。     

人血浆DNA双重实时荧光定量PCR检测法的建立

目的 建立带有内参照的双重实时荧光定量PCR方法检测血浆DNA含量.方法 构建重组质粒DNA作为内参照物,采用共用下游引物的双重实时荧光定量PCR技术同步扩增人看家基因β-actin和重组质粒载体中人工合成DNA序列,定量检测健康成年人血浆DNA含量.结果 本法能在同一个反应管中对目的基因和内参照进行同步扩增,两者的扩增无相互干扰,特异性好;重组质粒DNA的平均扩增效率达90%,β-actin基因的平均扩增效率接近100%;本法批内变异系数（CV）11%,批间CV17%.结论 成功建立含有内参照的双重实时荧光定量PCR方法,可对血浆DNA进行定量检测.     

检测MBL EXON Ⅰ 52位密码子突变PCR-SSP方法的建立

目的　建立甘露糖结合凝集素 (MBL) 5 2位密码子基因突变的序列特异性引物聚合酶链反应 (PCR SSP)检测方法。方法　收集静脉血标本 ,提取染色体DNA ,根据MBL基因序列设计引物 ,PCR扩增。结果　扩增产物进行序列分析 ,与预期目的基因序列相同 ,检测灵敏度为 0 .8μg/ml。结论　该方法是一种特异性好、较为灵敏的检测方法。     

LSSP-PCR筛选基因突变的简易方法

Pend等报告了一种简便易行、检出率又很高的新型基因突变检测技术，称为低严格特异性单链引物PCR（LSSP—PCR）．这种PCR方法可以将目的基因的DNA片段（Ikb以上亦可）扩增并经电泳分离，形成一独特的多带型“基因标签”．在模板DNA中，即使只有单个流基突变，也可使所形成的“基因标签”明显改变．换句话说，可以根据LSSP－PCR所形成的特异性“基因标签”的差异，判断目的若因是否有突变．在常规PCR中，一个基本要求是尽可能减少非特异性扩增，为此，在进行PCR时，模板用量，引物浓度均不宜太高，同时尽可能提高退火温度，既…     

竞争PCR及其产物酶联杂交定量检测HBV DNA

目的 研究竞争性PCR及其产物酶联杂交定量检测法价值。方法 竞争性PCR对HBV基因进行扩增，并引入微反应板酶联杂交技术对扩增产物定量分析。结果 检测HBV DNA灵敏度、特异性及定量分析精确度均十分理想。结论 该法值得推广应用。     

三种食源性致病菌多重PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立快速检测沙门菌、变形杆菌和金黄色葡萄球菌的多重聚合酶链反应(PCR)方法。方法本研究依据沙门菌侵袭基因正调节蛋白(hilA)基因、变形杆菌溶血素(hpmA)基因和金黄色葡萄球菌特异性pSa-442序列,运用Primer Premier 5.0分别设计3对特异性引物,预计PCR扩增的目的基因片段分别为为580bp、401 bp、256 bp。通过对单管多重PCR扩增的特异性、敏感性分析以及建立L16(43)正交试验对单管多重PCR扩增条件如引物浓度、dNTP浓度和Tm值等的优化,建立了快速同时检测3种食源性致病菌的单管多重PCR方法。结果该方法检测的灵敏度分别为:94.07 pg沙门菌DNA,140.85 ng变形杆菌DNA,1.41 ng金黄色葡萄球菌DNA。模拟检测食品中的混合3种菌,4 h培养后样品的最低检测限度分别为:沙门菌100菌落形成单位(CFU)/mL、变形杆菌101CFU/mL、金黄色葡萄球菌100CFU/mL。结论该方法特异性和灵敏度高,检验周期短,可用于对食品中多种致病菌的快速诊检和监控。     

双重PCR快速检测百日咳杆菌

目的:以百日咳毒素S1亚基启动子ptxA-Pr基因和插入序列IS481为目的基因,建立敏感、特异的双重PCR快速检测百日咳杆菌方法.方法:运用百日咳杆菌ptxA-Pr和IS481基因序列特异性引物,采用双重PCR技术同时扩增百日咳杆茵的特异性基因ptxA-Pr和IS481.通过构建目的质粒获得阳性对照,测序并与GenBank比对序列验证扩增产物.百日咳标准茵株DNA 10倍系列稀释为模板.采用此方法扩增双基因,检测此方法敏感性.扩增肺炎克雷伯茵、肺炎链球茵、铜绿假单胞茵、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及阳性样本DNA,检测此方法特异性.结果:百日咳杆菌标准株和阳性样本均能同时扩增ptxA-Pr和IS481目标序列,分别为191、145 bp.构建质粒后测序结果与GenBank对比一致.每个反应体系能检测到的标准菌株核酸最小量为1.65×10<'-2>ng.其他菌株检测未出现非特异性扩增.结论:双重PCR扩增百日咳杆菌ptxA-Pr和IS481基因的方法可用采特异快速的检测百日咳杆菌.     

多重PCR快速鉴定19种致病真菌

摘要:目的：建立快速鉴定致病真菌的多重PCR体系。 方法：选取19种致病真菌的rDNA内部转录间隔区（ITS）序列设计引物,建立两个多重PCR体系,扩增临床与环境分离真菌菌株、人类细胞及9种常见细菌DNA,检测体系的特异性;以浓度梯度的DNA模板检测体系的灵敏度。 结果：对氟康唑天然耐药的克柔念珠菌、光滑念珠菌以及对两性霉素B耐药的土曲霉、镰刀菌、尖端赛多孢、根霉在该体系中可扩增出特异性条带,其他真菌可同时进行种属鉴定。74株被测真菌菌株的鉴定结果与常规鉴定的符合率为95.9%。两个多重PCR体系对人类基因组及9种常见细菌DNA的扩增结果均为阴性;扩增阳性的最低模板浓度均为10 fg/μL。 结论：建立的两个多重PCR体系可对致病真菌进行检测和种属鉴定。     

改进的PCR在抑癌基因启动子CpG岛甲基化检测中的应用

目的改进聚合酶链反应(PCR),并检验改进后的方法在甲基化检测中的可行性。方法培养人乳腺癌细胞株MCF-7,提取基因组DNA,利用亚硫酸氢盐测序法,用常规、降落及改进PCR分别扩增,比较扩增效果,PCR产物纯化回收后,TA克隆入载体pGEM-T,转化大肠杆菌(E.coliDH5α),筛选阳性克隆,经PCR扩增鉴定后获得阳性重组质粒,测序比对。结果改进后PCR与常规、降落PCR相比,扩增效率增高,二聚体及非特异性扩增减少;测序结果显示,MCF-7细胞基因组DNA中,RASSF lA基因启动子CpG岛是高甲基化的,E-cadherin基因启动子CpG岛未呈现高甲基化状态。结论改进后方法提高了以PCR为基础的甲基化分析的可行性,更适用于基因甲基化状态的检测,并为扩增富含CG的基因启动子区域提供参考。     

控制聚合酶链反应的污染问题

聚合酶链反应(Polymerase Chain Rea-ction,PCR)能高效扩增目的DNA 片段,在数小时内完成20～50个循环就可以使目的DNA 扩增数百万倍。现已广泛用于基因的结构与功能的研究,并大大地推动了分子生物学及有关学科的飞速发展。PCR 不仅可用于基因的分离、克隆和核酸序列分析、以及在突变体和重组体的构建,基因表达调控的研究,基因的多态性分析,肿瘤机制探讨等中显示强大的生命力;而且在传染病和遗传病的诊断、法医鉴定等中具有先进性和实用性。因此,PCR 无论是     

EGFR外显子19、21突变等位基因特异性PCR检测方法的建立

目的 建立一种人表皮生成因子受体(EGFR)外显子19、21突变等位基因特异性聚合酶链反应(PCR)检测方法.方法 根据EGFR外显子19、21野生型和突变型设计特异性引物,提取健康人和非小细胞肺癌患者血中有核细胞的基因组DNA作为模板,采用等位基因特异性聚合酶链式反应扩增EGFR外显子19、21突变基因.结果 特异性引物可以扩增EGFR外显子19缺失突变的2种类型和外显子21的错义突变.结论 等位基因特异性PCR法可以用于检测人EGFR外显子19、21突变.     

实时荧光定量PCR快速检测百日咳鲍特菌方法学建立及评价

目的 建立实时荧光定量PCR检测百日咳鲍特菌的方法。 方法 以百日咳鲍特菌的重复插入序列IS481为目的基因,设计探针和引物, 以克隆的IS481基因片段为DNA模板,在荧光定量PCR仪上建立实时荧光定量PCR检测方法和标准曲线,并进行灵敏度、重复性、特异性实验。 结果 建立的定量标准曲线阈值循环数（Ct）与模板拷贝数呈良好线性关系(r=0.998);最低检测浓度为10^{2 copies/μl;批内及批间变异系数均小于4%;对临床其他常见呼吸道病原体不出现特异性扩增曲线。 结论 实时荧光定量PCR法检测IS481基因可用于百日咳鲍特菌的快速检测,具有较好的灵敏度、特异性及重复性。}     

血液细菌16S rRNA基因检测的诊断价值

目的探索快速可靠的检测细菌感染的新方法。方法用PCR技术扩增实验室保留株10株的16SrRNA基因,以乙型肝炎病毒-DNA、白假丝酵母菌和人类基因组DNA为对照,检测该方法的特异性;采用10倍比稀释法进行该方法的灵敏度检测。结果对所测细菌株均获得475bp扩增产物,而与乙型肝炎病毒-DNA、白假丝酵母菌和人基因组DNA无交叉反应;PCR最低能检测1.5×104/L大肠埃希氏菌。结论16SrRN基因PCR检测细菌感染的方法具有特异性、快速性和敏感性高等特点。     

细胞壁缺陷型伤寒沙门菌染色体的PCR-SSCP分析

目的　了解伤寒沙门菌细胞壁缺陷突变株 (CWDMs)的染色体特点 ,探讨伤寒沙门菌CWDMs变异的分子机制。方法　对伤寒沙门菌CWDMs染色体DNA进行特异性PCR扩增及SSCP分析。结果　PCR SSCP显示伤寒沙门菌CWDMs具有与亲代细菌型相同的双链DNA和一条单链DNA ,但缺少了一条单链DNA。结论　伤寒沙门菌CWDMs仍保留了与其亲代细菌型一致的特异性染色体基因 ,但也发生了染色体基因的突变。