壳聚糖-DNA纳米粒对肿瘤细胞的转染效率

背景非病毒载体具有低毒,低免疫反应,靶向性和易于组装等优点已成为目前研究基因转染的热点.目的评价壳聚糖-DNA纳米粒对肿瘤细胞的转染效率和细胞毒性.设计观察对比实验.单位华中科技大学同济医学院环境医学研究所.材料Zeta电位/粒度分析仪;荧光分光光度计;Hoechst 33258;PLPS-3'EGFP质粒;肺癌细胞A549和人肝癌细胞HepG2.方法实验于2004-12/2005-12在华中科技大学同济医学院环境医学研究所完成.用绿色荧光蛋白基因做报告基因,复凝聚方法制备壳聚糖绿色荧光蛋白质粒纳米粒.②采用扫描电镜观察制备的纳米粒形态;Zeta电位/粒度分析仪测量纳米粒的粒径和表面电位;酶保护试验检测纳米粒的抗DNA酶降解性能.③体外转染人肝癌细胞Hep G2和肺癌细胞A549.分别在24,48和72 h后在倒置荧光显微镜下观察细胞转染情况.④纳米粒细胞毒性分析采用四甲基偶氮唑盐试验.主要观察指标①纳米粒的包封率与理化特征.②纳米粒的细胞转染效率.③纳米粒的细胞毒性.结果①纳米粒的包封率与理化特征壳聚糖纳米粒的核酸包封率为91.7%,纳米粒多呈球形,平均粒径149 nm,表面电位+20.5 mV.壳聚糖纳米粒能保护DNA不受DNA酶Ⅰ降解.②纳米粒的细胞转染效率48 h后转染率达到高峰,A549转染率为95%;而HepG2只有10%左右.③纳米粒的细胞毒性纳米粒和壳聚糖溶液均能抑制HepG2和A549生长,壳聚糖溶液对细胞生长的抑制作用强于纳米粒.结论壳聚糖质粒纳米粒能转染HepG2和A549两种肿瘤细胞,且对两种肿瘤细胞的生长有抑制作用,提示壳聚糖纳米粒能作为DNA的载体,用于肿瘤细胞的转染.     

包裹pcDNA3.1(-)/MAGE-3-HSP70壳聚糖纳米粒的制备及其特性

背景:裸质粒DNA在基因治疗中因带负电荷,易被体内核酸酶降解,故无法实现有效转染,壳聚糖是自然界存在的可降解性阳离子多聚糖,能有效防止DNA被核酸酶降解,提高转染效率.目的:采用复凝聚法制备包裹pcDNA3.1(-)/MAGE-3-HSP70壳聚糖纳米粒,观察其相关特性.设计、时间及地点:对比观察实验,于2009-02/08在国家卫生部纳米生物技术重点实验室完成.材料:pCDNA3.1(-)/MAGE-3-HSP70由国家卫生部纳米生物技术重点实验室构建,壳聚糖(批号060306,脱乙酰度>90.0%,黏度<100 mPa·s)由上海伯奧生物科技有限公司提供,B16细胞由中南大学肿瘤研究所惠赠.方法:采用复凝聚法制备包裹pcDNA3.1(-)/MAGE-3-HSP70壳聚糖纳米粒,将壳聚糖基因纳米粒转染B16细胞,利用反转录-聚合酶链反应检测体外转染效果;应用噻唑蓝评价壳聚糖基因纳米粒子的体外细胞毒性.主要观察指标:激光粒度仪测定壳聚糖基因纳米粒径、Zeta电位;紫外分光光度计检测包封率;凝胶阻滞实验观察壳聚糖和质粒DNA的聚合;DNase I的保护试验分析壳聚糖基因纳米粒抗核酸酶降解能力.结果:壳聚糖基因纳米粒的平均粒径约为223 nm,Zeta电位为16 mV;DNA包封率为92.3%,B16细胞转染实验显示其效率与Lipofectamine 2000相近,而其毒性远低于Lipofectamine 2000.结论:壳聚糖纳米粒子可高效装载质粒DNA转染B16细胞,而且对细胞基本无毒.     

转化生长因子β1基因缓释的壳聚糖纳米粒制备及体外检测

背景：壳聚糖作为一种非病毒载体,具有低毒性、低免疫原性、良好的生物相容性以及带可高正电荷密度的特性,易与带负电荷的DNA通过静电作用形成相互作用体避免核酸酶的降解。目的：构建负载重组人转化生长因子β1基因的壳聚糖纳米粒,检测其体外缓释转化生长因子β1基因及对软骨细胞基因转染等性能。方法：将壳聚糖与负载增强型绿色荧光蛋白基因和转化生长因子β1基因的质粒DNA（pDNA）以复凝聚法制成壳聚糖/pEGFP-TGF-β1纳米粒。结果与结论：制备的壳聚糖/pEGFP-TGF-β1纳米粒呈球形,粒径、表面电位与pH值相关,随着pH值升高,粒径增大,表面电位减少。纳米粒可有效保护pDNA免受核酸酶的降解。纳米粒的pDNA包封率为（87.5±2.3）%;pDNA可从纳米粒中缓慢释放。体外转染实验证实壳聚糖/pEGFP-TGF-β1纳米粒能转染软骨细胞并在细胞内表达绿色荧光蛋白。提示壳聚糖/pEGFP-TGF-β1纳米粒能有效保护pDNA免受核酸酶降解,具有良好的缓释转化生长因子β1基因的能力,并能介导基因转染软骨细胞。     

PBCA纳米粒介导hTERT反义寡核苷酸对A549细胞的转染

目的：应用聚氰基丙烯酸丁酯纳米粒介导或者寡核苷酸直接转染技术，研究聚氰基丙烯酸丁酯纳米粒介导下端粒酶逆转录酶反义寡核苷酸对A549细胞的转染，探讨聚氰基丙烯酸丁酯纳米粒对A549细胞摄入寡核苷酸的影响。方法：利用5’端FITC标记的反义寡核苷酸，以聚氰基丙烯酸丁酯纳米粒介导FASODN（FASODN—NP）或FASODN直接转染A549细胞，流式细胞仪测定细胞的胞内平均荧光强度，荧光显微镜观察细胞内荧光物质的分布。结果：转染24h后，与空白对照组和FASODN组相比，FASODN—NP组胞内荧光强度明显增加（P〈O．01）。结论：聚氰基丙烯酸丁酯纳米粒介导能有效提高A549细胞对端粒酶逆转录酶反义寡核苷酸的摄入。     

聚氰基丙烯酸正丁酯纳米颗粒的表面修饰和转染

背景:聚氰基丙烯酸烷基酯在人体内极易生物降解,且对许多组织具有生物相容性,近年来一直受到国内外医药界的广泛关注.目的:比较不同表面修饰的聚氰基丙烯酸正丁酯纳米颗粒的物理化学性质,并考察它们体外基因转染活性.设计、时间及地点:对比观察实验,于2007-09/12在中南大学卫生部纳米生物技术重点实验室完成.材料:采用乳化聚合的方法制备表面分别修饰壳聚糖、葡聚糖和氨基化的聚乙二醇的聚氰基丙烯酸正,‘酯纳米颗粒.方法:透射电镜观察粒径大小、纳米粒形态;Zetasizer Nano system电位分析仪测定Zeta电位;MTT法检测纳米粒的细胞毒性;用流式细胞仪考察纳米粒的体外转染效率.主要观察指标:纳米粒的表面电位、粒径、细胞毒性及其转染效率.结果:成功制备了粒径约200 nm左右,表面电位分别为25.53,-17.42和0.293 5 mV的壳聚糖、葡聚糖和氨基化的聚乙二醇修饰的聚氰基丙烯酸正丁酯纳米颗粒,且0.1 g/L的质量浓度对HepG2细胞无明显毒性,带正电的壳聚糖修饰的聚氰基丙烯酸正丁酯纳米颗粒的转染效率明显高于葡聚糖和氨基化的聚乙二醇修饰的纳米粒.结论:聚氰基丙烯酸正丁酯纳米颗粒经表面修饰不同物质后可以带上正电、负电及中性电荷,而壳聚糖修饰的纳米粒能有效地将基因递送到细胞内,并且报告基因能在细胞内表达.因此,可用做基因递送的载体.     

mPEG-CS纳米粒介导livinshRNA基因纳米复合物的制备及转染效率

背景：作为非病毒基因转染载体,由可降解的高聚物形成的纳米载体目前被广泛由于基因转染,因为他们具有良好的缓释性,靶向性和生物相容性。目的：制备mPEG-CS纳米粒,探讨mPEG-CS作为Livin shRNA基因转染载体的可行性。方法：通过离子交联法制备mPEG-CS纳米粒,利用聚乙二醇对壳聚糖进行改性,通过静电吸附法制备载livin shRNA的基因纳米复合物。Zeta-size分析仪和透射电镜检测空白纳米粒和载livin shRNA的基因纳米复合物的形态、粒径和zeta电位,测定基因纳米复合物的包封率,凝胶电泳阻滞实验和DNase I酶消化实验验证纳米粒对基因的保护作用。利用最佳条件下制备的基因纳米复合物,转染大肠癌HT-29细胞,考察转染效率。结果及结论：成功制备出约60nm的mPEG-CS纳米粒,当纳米粒与基因体积比为3∶1时,得到的基因纳米复合物形较规则,粒径100nm左右;其包封率为（94.32±0.35）%。凝胶电泳阻滞实验表明纳米粒能够紧密结合DNA,对基因具有良好的基因保护作用。该基因纳米复合物转染大肠癌细胞的转染效率高,持续作用时间长。mPEG-CS纳米粒作为基因转染载体,对基因具有保护作用,能够将livin shRNA重组质粒高效转染入大肠癌细胞,能够在大肠癌细胞内长时间表达,克服了RNA干扰在基因治疗肿瘤中基因作用时间较短的缺点。     

构建新型液态氟碳壳聚糖纳米超声造影微粒

目的 构建一种新型天然高分子聚合物纳米超声造影微粒,表征其理化特征、体外显像效果及其对肿瘤细胞的结合能力和毒性。 方法 采用超声乳化法制备包裹液态氟碳PFOB的壳聚糖(CTS)纳米粒和FITC标记的壳聚糖纳米粒(FITC-CTS),表征其表面形态、粒径、Zeta电位和稳定性;评价纳米粒的体外超声显像效果,以激光共聚焦观察FITC-CTS与细胞的结合作用,流式细胞仪检测FITC-CTS对细胞的黏附比例。 结果 制备的纳米粒形态圆整,CTS纳米粒平均粒径为(248.52±7.96)nm,Zeta电位为+(29.91±0.64)mV,FITC-CTS纳米粒平均粒径为(244.83±2.72)nm,Zeta电位为+(22.21±0.53)mV。纳米粒性质稳定,在体外能增强超声显影,激光共聚焦观察到纳米粒聚集在细胞膜周围,流式细胞仪测得纳米粒对细胞的黏附比例为(45.15±8.35)%。 结论 构建的CTS纳米粒性质稳定,体外能与肿瘤细胞MCF-7紧密结合,增强超声回声。     

鬼臼毒素-固体脂质纳米粒的制备及质量考察

目的:探讨鬼臼毒素-固体脂质纳米粒的制备方法及其质量。方法:实验于2005-12/2006-08在南方医科大学药学部实验室完成。在制备工艺研究上进行单因素考察和正交实验设计优化处方,以鬼臼毒素-固体脂质纳米粒粒径大小和Zeta电位、形态学、包封率、pH值作为样本质量考察指标,最终确定以改良的乳化蒸发-低温固化法制备鬼臼毒素-固体脂质纳米粒。实验评估:①用透射电镜考察纳米粒的形态。②用粒径分析仪检测纳米粒粒径大小和Zeta电位。③用高效液相色谱法测定纳米粒中鬼臼毒素的包封率。④用pH计测定鬼臼毒素-固体脂质纳米粒混悬液的pH值。结果:①鬼臼毒素-固体脂质纳米粒形态:基本呈圆形或椭圆形。②粒径大小和Zeta电位:分别为(75.3±26.2)nm,(23.2±3.1)mV。③包封率:86.4%。④pH值:4.66±0.18。结论:鬼臼毒素-固体脂质纳米粒制备工艺简单,考察制剂质量较理想。     

mPEG-CS纳米粒介导livinshRNA基因纳米复合物的制备及转染效率

背景:作为非病毒基因转染载体,由可降解的高聚物形成的纳米载体目前被广泛由于基因转染,因为他们具有良好的缓释性,靶向性和生物相容性。目的:制备mPEG-CS纳米粒,探讨mPEG-CS作为Livin shRNA基因转染载体的可行性。方法:通过离子交联法制备mPEG-CS纳米粒,利用聚乙二醇对壳聚糖进行改性,通过静电吸附法制备载livin shRNA的基因纳米复合物。Zeta-size分析仪和透射电镜检测空白纳米粒和载livin shRNA的基因纳米复合物的形态、粒径和zeta电位,测定基因纳米复合物的包封率,凝胶电泳阻滞实验和DNase I酶消化实验验证纳米粒对基因的保护作用。利用最佳条件下制备的基因纳米复合物,转染大肠癌HT-29细胞,考察转染效率。结果及结论:成功制备出约60nm的mPEG-CS纳米粒,当纳米粒与基因体积比为3∶1时,得到的基因纳米复合物形较规则,粒径100nm左右;其包封率为(94.32±0.35)%。凝胶电泳阻滞实验表明纳米粒能够紧密结合DNA,对基因具有良好的基因保护作用。该基因纳米复合物转染大肠癌细胞的转染效率高,持续作用时间长。mPEG-CS纳米粒作为基因转染载体,对基因具有保护作用,能够将livin shRNA重组质粒高效转染入大肠癌细胞,能够在大肠癌细胞内长时间表达,克服了RNA干扰在基因治疗肿瘤中基因作用时间较短的缺点。     

阿苯达唑壳聚糖纳米粒包封率的测定

背景：在纳米粒研究过程中,包封率是纳米粒质量评定的重要指标。目的：建立阿苯达唑壳聚糖纳米粒包封率的测定方法。方法：采用紫外分光光度法测定阿苯达唑的含量,反相透析法分离纳米粒和游离药物阿苯达唑,测定阿苯达唑的包封率。考察药物加样回收率、透析平衡时间和透析体积比。结果与结论：反相透析法能将纳米粒和游离药物阿苯达唑有效分离,药物加样回收率是（99.59±0.36）%,透析法平衡时间为9h,透析体积比为1∶15,阿苯达唑壳聚糖纳米粒的平均包封率为（51.73±0.18）%。提示反透析法便捷、准确,适用于阿苯达唑壳聚糖纳米粒包封率的测定。