东北三省部分地区人群几种蜱媒传染病抗体的调查

为了解东北三省部分地区蜱媒传染病空间分布，采用间接免疫荧光技术进行血清流行病学调查。结果表明，斑点热抗体阳性率平均为11．4％；森林脑炎抗体阳性率平均为2．7％；Q热抗体阳性率平均为9.1％；莱姆病抗体阳性率平均为7．4％，其中1份血清查菲埃立克体抗体阳性。结论：东北三省部分地区存在着斑点热群西伯利亚和黑龙江立克次体感染、Q热感染、森林脑炎感染、莱姆病感染。     

东北三省部分地区人群几种蜱媒传染病的抗体调查

蜱类是重要的医学节肢动物,作为媒介通过刺吸人、畜等动物而传播多种传染病。为了解东北地区蜱媒传染病存在的种类和分布,保证我区驻军官兵的身体健康,我们采集了东北三省部分地区正常人血清,检测斑点热立克次体、贝氏柯克斯体、查菲埃立克体、莱姆病伯氏疏螺旋体及森林脑炎病毒等抗体,以查明上述蜱媒传染病的分布与感染情况,为今后防治工作提供依据。现将结果报告如下。1材料与方法1·1血清来源血清来自黑龙江省10个市县、吉林省2个市县及辽宁省2个县的健康人群(包括林业工人、农民及战士),共1007份。用毛细吸管取耳垂血,离心分离血清,封口…     

16S rRNA基因文库方法在感染标本菌群分析中的应用

目的探讨16S rRNA基因文库方法对感染标本菌群的鉴定效果。方法采集70例创伤患者的感染伤口脓液或渗出液标本,使用通用引物扩增标本中所有细菌的16S rRNA基因片段,构建16S rRNA基因文库,挑取阳性克隆测序,分析感染细菌的数量与种类。结果从150个克隆子中检测7种不同酶切类型的克隆,鉴定出7类微生物,其中屎肠球菌种类最多,占88%,坚强肠球菌比例占2%,另5类序列与非可培养细菌类群的16S rRNA基因序列相似性较高,均占2%。结论感染标本中屎肠球菌含量丰富,应用16S rRNA基因文库的方法可有效分离到感染标本中的非可培养菌。     

PCR-RFLP分析16s-23srDNA间区序列鉴定分枝杆菌菌种

目的探讨16S～23srDNA间区序列DNAPCR扩增和限制性酶切分析在分枝杆菌分类鉴定中的价值。方法对19种分枝杆菌标准株的16S～23SrDNA间区序列DNA进行PCR扩增并对扩增产物进行限制性内切酶HaeⅢ、MSP1消化反应，分析不同菌种扩增片段及其限制性片段长度多态性的差异。结果，PCR扩增结果显示：分枝杆菌一般扩增出1～2条带，缓慢生长分枝杆菌扩增片段在340～480bP，快速生长分枝杆菌扩增片段集中在470～575bP，单从扩增产物的琼脂糖凝胶电泳只能鉴定33．3％的受试菌种，酶切结果显示：分枝杆菌的酶切图谱彼此不同。结论16S～23SrDNA间区序列DNAPCR扩增和RFLP分析是分枝杆菌分类鉴定的一种快速、有效的方法。     

多重PCR技术检测沙门菌两种四环素耐药基因

应用两对特异性引物同时检测四环素耐药基因tetB和tetC通过对35株沙门菌分离株的四环素耐药性检测，表明所有沙门菌分离株均含tetC基因，与药敏试验结果阳性符合率65．7％，8株同时含有tetB基因，与药敏试验结果阳性符合率100％，tetB基因和tetC基因双阳性的菌株与药敏试验结果阳性符合率也为100％。取其中部分菌株扩增出tetB和tetC基因片段进行序列分析，5株菌的tetB基因扩增产物序列完全相同，与质粒pRT11相应序列同源性达99．7％；14株菌的tetC基因扩增产物与质粒pBR322中的相应序列同源性为100％。证实沙门菌耐药基因普遍存在，且同时含有tetB和tetC基因的菌株表现耐药。多重PCR技术同时检测两种四环素耐药基因，适合大量样本的检测，对开展沙门菌四环素多种耐药基因的分子流行病学监测提供了有效途径。     

中国钩端螺旋体疫苗生产用菌种罗株分子遗传特性分析

目的:分析研究中国钩端螺旋体疫苗生产用菌种罗株的分子遗传特性,为钩体疫苗生产用菌种分子遗传质量控制方法的研究奠定基础。方法:通过对罗株16S rRNA基因片段进行PCR扩增、测序,并运用脉冲场凝胶电泳(PFGE)和多位点序列分析(MLST)等方法,对其进行分子分型。结果:16S rRNA基因序列比对结果显示钩体疫苗生产用菌种罗株基因种为致病性问号型;PFGE分析结果表明该疫苗株全基因组在酶切后共有100~1 000 kb大小不等的片段11个,与我国其他不同血清群代表株酶切片段的数量、大小和分布特征方面明显不同;多位点序列分析得出该罗株序列型为140。结论:本文对钩体疫苗生产用菌种罗株的分子遗传信息分析结果,可为后续的钩体疫苗生产用菌种分子遗传质量控制方法的研究提供参考。     

金葡菌多重耐药基因norA的原核表达及其抗体制备

按金葡菌多重耐药转运蛋白NorA的编码序列设计引物，以金葡菌基因组DNA为模板．扩增出基因norA中约1155bp的cDNA片段，将所得片段与pMD18-T载体连接，转化到感受态大肠埃希菌JM109中．成功地筛选到阳性克隆，其质粒测序结果与文献报道一致。从阳性克隆中提取质粒．经NdeⅠ和XhoⅠ酶切，回收1155bp的目的片段．定向克隆到pET-28a（＋）表达载体中，转化至感受态大肠埃希菌DH5a中，提取质粒，再次转化到BL21（DE3）中，成功筛选到阳性克隆。经IPTG诱导阳性菌，通过SDS—PAGE检测出norA部分基因的表达。利用得到的纯化蛋白免疫家兔，并通过间接ELISA法检测抗体效价．证明得到相应抗体。     

黄瓜花叶病毒2b蛋白在大肠杆菌中的表达及抗血清制备

从黄瓜花叶病毒（CMV）中提取总RNA，通过反转录-PCR（RTPCR）扩增得到其运动蛋白2b基因，将扩增产物克隆到pMD-18T载体上。DNA序列分析表明，所得到2b基因全长为303bp与已发表CMV序列相同。将目的片段亚克隆到表达载体pET30a上，并在大肠杆菌JM109诱导表达，诱导9h后。融合蛋白表达量最大。经SDS-PAGE检测，融合蛋白以可溶形式存在。制备的抗血清，效价为1：4000。     

大鼠脑源性神经营养因子基因克隆及其真核表达载体的构建

目的 克隆大鼠脑源性神经营养因子(BDNF)基因的表达序列,构建大鼠BDNF基因真核表达载体.方法 以RT-PCR从大鼠脑组织总RNA中扩增BDNF cDNA,将其克隆到真核表达载体pcDNA3中构建重组质粒pcDNA3-BN,以限制酶酶切鉴定和DNA序列分析鉴定重组质粒.结果 RT-PCR产物为783bp特异片段,重组质粒酶切后产生783bp和5.2 kb的片段,DNA测序证实783bp片段的碱基序列与大鼠BDNF基因序列完全一致.结论 成功克隆大鼠BDNF基因表达序列并构建了BDNF基因真核表达栽体pcDNA3-BN.     

关节液中细菌16s rRNA与23s rRNA诊断膝关节置换术后感染的价值

目的 探讨利用关节液中细菌16s rRNA与23s rRNA诊断全膝关节置换术后感染的效率及两种基因诊断方法的差异.方法 对33例无菌性松动及19例假体周围感染行人工膝关节翻修的患者,通过RT-PCR检测关节液中细菌16s rRNA、23s rRNA保守基因片段诊断假体周围感染.比较两种诊断策略的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值及准确性.结果 以国外关于假体周围感染诊断方法的文献判定假体周围感染,利用16s rRNA进行诊断的敏感性78.8％,特异性93.9％,阳性预测值88.2％,阴性预测值为88.6％,准确性为88.5％;而采用23s rRNA扩增方法诊断的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值及准确性分别为68.4％、78.8％、65.0％、81.2％和75.0％.两种基因诊断的各指标比较差异均无统计学意义(P>0.05).结论 通过检测关节液中细菌16s rRNA或23s rRNA诊断人工膝关节置换术后感染,具有较高的诊断效率,且两者差异无统计学意义.     

鼠肺组织直接用于汉坦病毒S基因序列分析

目的：应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、核苷酸序列分析等技术，尝试建立一种可直接从鼠肺标本中进行汉坦病毒基因分析的方法。方法：提取经免疫荧光法检测汉坦病毒抗原阳性的鼠肺细胞总RNA，经逆转录获取病毒cDNA．纯化，克隆于pMD-18T载体，测定S基因片段核苷酸序列。结果：采用RT—PCRT／A克隆技术成功地从鼠肺组织中扩增出汉坦病毒S基因全序列，序列长为1701nt。只有一个编码N蛋白的开放读码框架（ORF），起始密码子为第37nt，终止于1326nt，推导其编码的蛋白长为429个氨基酸。与该标本分离株（简称TJJ16毒株）S基因的全序列相一致。结论：该方法可对汉坦病毒抗原检测阳性而病毒分离阴性的鼠肺标本进行分子生物学特征性分析，从而建立一种对汉坦病毒在宿主间的流行情况分析的方法。     

人源热休克蛋白HSC70与HPV16型E7融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化和活性检测

目的 克隆人热休克蛋白HSC70的N端具有ATPase活性的结构域(简称为A基因)与HPV 16型E7的融合基因,在大肠杆菌中表达,并纯化获得有生物活性的AE7融合蛋白.方法 利用PCR方法扩增获得A基因片段,插入原核表达载体pET29b中,再通过PCR方法扩增HPV 16型E7基因片段,插入A基因的3′端,构建原核表达质粒pET29b-AE7,并转化大肠杆菌BL21(DE3),表达产物经离子交换层析和金属螯合层析纯化后,在一定的剂量下皮下免疫小鼠,检测对HPV-16的E7基因感染的预防及治疗作用.结果 重组质粒pET29b-AE7经DNA序列测定确认.SDS-PAGE检测,表达产物分子量为66kD,大部分为包涵体.纯化后产物经SDS-PAGE电泳分析纯度>90%.纯化产物AE7在一定的剂量下皮下免疫小鼠,对HPV-16的E7基因的感染有预防及治疗作用.结论 AE7融合蛋白的获得为进一步临床研究奠定基础.     

人IL－18cDNA的RT－PCR扩增及重组质粒的构建

为构建人白细胞介素18（IL－18）的重组质粒，用RT－PCR技术从健康人外周血单核细胞中扩增出编码人IL－18的cDNA ,并将此基因定向克隆入表达载体pBV220中，通过对转化子的筛选得到带有IL－18插入片段的阳性克隆。经酶切分析及核苷酸测表明，克隆到基因与献报道完全一致。表达的重组IL－18占菌体总蛋白质的20％，表达的蛋白分子量约为18．3kD。表达产物主要以包涵体的形式存在。     

慢性无症状乙型肝炎病毒携带者的基因型研究

目的：采用多对型特异性引物，通过巢式PCR检测慢性HBV无症状携带者中的HBV基因型分布情况。方法：根据从前S1基因到S基因中的保守序列设计出10条内外引物，并将其中8条内引物分成2组，分别扩增A，B，C和D，E，F型，根据PCR产物大小判定HBV基因型。用此方法检测北京地区HBV慢性无症状HBV携带者血清。结果：265例慢性无症状HBV携带者中，HBV DNA阳性113例，阳性率42．6％。检测到B，C基因型分别为B基因型29例（25．7％），C基因型80例（70．8％），B基因型和C基因型混合感染4例（3．5％）。不同基因型在不同性别构成比例和HBeAg阳性率的差别无统计学意义。结论：北京地区慢性无症状HBV携带者HBV DNA阳性患者中以B，C型为主，C型占优势，存在少量B和C基因型混合感染。     

DNA芯片技术用于贝母的基因分型和种类鉴别

目的通过对贝母几个种遗传多态性的研究来开发在分子水平上用于鉴别贝母基因型及不同种类的DNA芯片技术。方法用PCR扩增法和DNA直接测序法确定核苷酸多态性,用DNA芯片进行基因检测。结果首先提取来自多种贝母根茎的基因组DNA,对26S rDNA基因D2与D3区的多态性片段进行扩增和测序,然后将不同种属多态性片段的特异性寡核苷探针点置于经多聚赖氨酸处理包被的芯片。用来自不同种贝母的荧光素标记的PCR产物与DNA芯片进行杂交,可在芯片特定位置检测到不同种贝母的荧光信号。结论本研究显示DNA芯片技术可为植物种属的验证与质量控制提供一种快速、高通量的检测工具。     

2a型丙型肝炎病毒非结构基因5区(NS5)全长克隆的构建

目的 构建2a型丙型肝炎病毒(HCV)非结构基因(NS)5区全长克隆质粒。方法 用聚合酶链反应(PCR)从HCV NS5A和NS5B质粒中扩增出NS5A和NS5BPCR片段，再采用融合PCR技术扩增出全长NS5的cDNA片段，克隆后RFLP和序列分析鉴定重组子。结果 融合PCR获得约2．8kb全长NS5序列，同源性分析表明：与HC-J6的核苷酸同源性为91．2％，推导的氨基酸同源性为95．5％。结论 利用融合PCR技术简单方便，利用该技术获得了2a型HCV NS5全长序列，构建了全长基因克隆质粒。     

同时产CTX-M-22及TEM-1型β-内酰胺酶的阴沟肠杆菌耐药性分析

目的 了解临床分离阴沟肠杆菌株EC003产β-内酰胺酶的耐药特征和基因型。方法采用琼脂二倍稀释法对阴沟肠杆菌EC003进行MIC检测，酶提取物三维实验检测AmpC酶，双纸片法筛选及确证实验检测超广谱β-内酰胺酶（ESBLs），等电聚焦（IEF）电泳测定其等电点。以耐药质粒为模板进行PCR扩增，将β-内酰胺酶全编码基因克隆、表达，并对其扩增产物进行DNA序列测定和同源性分析。结果阴沟肠杆菌株EC003对所试多数β-内酰胺类抗生素耐药，表型检测AmpC酶为阴性。ESBLs阳性，IEF显示该菌产两种p1分别为8．7及5．4的β-内酰胺酶。PCR扩增产物DNA测序证实为CTX-M-22、TEM-1型β-内酰胺酶全编码基因，产TEM-1的克隆菌株仅对青霉素类耐药，产CTX—M-22的克隆菌株对所试多数β-内酰胺类抗生素耐药。对头孢噻肟的水解程度明显强于头孢他啶。结论临床分离阴沟肠杆菌株EC003同时产CTX—M-22和TEM-1型两种β-内酰胺酶，可导致对多数β-内酰胺类抗生素耐药。     

UP-PCR结合RFLP快速检测体液标本中病原菌的初步研究和应用

目的 建立通用引物聚合酶链反应(UP-PCR)结合限制性酶切片段长度多态性(RFLP)酶切图谱的方法,快速检测临床体液标本中常见病原菌。方法 根据体液标本中常见病原菌16S rRNA基因保守区设计的通用引物进行UP-PCR扩增,确定标本是否有细菌感染,然后对阳性标本的扩增产物进行RFLP分析,进一步鉴定细菌。利用该方法对204例体液标本进行了检测,并与常规细菌培养鉴定法进行比较。结果UP-PCR所有细菌均产生1032bp,扩增产物经RFLP法可将细菌进行鉴别。204份体液标本的检测中,与培养法相比,其灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值分别为95.7％、88.6％、88.0％和99.4％。结论 该方法具有敏感、特异的特点,可广泛应用于临床体液标本中病原菌的快速检测。     

Chinese 1基因型弓形虫棒状体蛋白 ROP16的基因克隆表达及生物信息学分析

目的：构建弓形虫Chinese 1基因型TgCtWh3（以后均简称Wh3）株棒状体蛋白（ rhoptry protein ,ROPs）16的原核和真核重组表达质粒及其3D结构。方法参照ROP16序列分别设计引物,采用PCR从弓形虫Chinese 1基因型Wh3株基因组DNA中扩增出编码ROP16的基因片段,克隆至pMD18-T载体;经PCR及测序分析鉴定;阳性克隆的质粒分别亚克隆至原核表达载体pET-28a和真核表达载体pEGFP-C2,分别转化大肠杆菌BL21和DH5α,PCR和酶切鉴定转化菌落插入的序列;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析融合蛋白的表达;将构建的真核重组质粒经脂质体转染293T细胞,观察其在细胞中表达;采用生物信息学方法分析构建了蛋白的3 D结构。结果各组均PCR扩增出约2．1 kb ROP16基因的特异片段,序列检测结果均正确;分别亚克隆到原核表达载体pET-28a和真核表达载体pEGFP-C2中,成功构建了Chinese 1基因型弓形虫棒状体蛋白ROP16的原核表达质粒和真核表达质粒;原核表达质粒在大肠杆菌中表达了ROP16的融合蛋白;真核表达质粒在293T细胞中成功表达,成功构建出ROP16基因的3D结构图。结论以pET-28a和pEGFP-C2为载体,分别成功构建并表达了ROP16的原核和真核重组质粒,并构建出其3D结构图。     

多重聚合酶链反应快速鉴别葡萄球菌及mecA基因检测

目的：建立快速鉴定葡萄球菌及检测mecA基因的多重聚合酶链反应（PCR）诊断方法。方法：以葡萄球菌16SrRNA、金黄色葡萄球菌的nuc基因以及耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）的mecA基因合成3对引物，采用多重PCR扩增法，快速鉴定葡萄球菌，同时判断MRS菌株。结果：107株葡萄球菌的16SrRNA基因扩增片段全部为阳性．与常规鉴定结果符合率为100％；nuc基因阳性48株。阴性59株，与金黄色葡萄球菌核酸酶试验一致；以PBP2a乳胶凝集试验结果为金标准，苯唑西林（含2％NaClMHA）及头孢西丁纸片扩散法的敏感性为98．7％和100％，特异性分别为75．0％和82．1％：PCR扩增法的敏感性和特异性均为100％。结论：多重PCR法能快速准确地从临床分离菌株中鉴别葡萄球菌，并可同步对mecA基因进行准确检测。