脐血来源树突状细胞的体外扩增、鉴定及冻存

目的研究脐血来源树突状细胞（DCs）的体外扩增、鉴定和冻存。方法用Ficoll分离获得脐血单个核细胞，以重组hGM—CSF、hIL-4及hTNF-α体外诱导培养14d。在DCs发育过程中，在光镜和电镜下观察其生长情况，应用流式细胞仪检测DCs表型。采用台盼蓝拒染法测定DCs增殖水平，MTT法检测DCs活化的T细胞对肿瘤细胞的杀伤性。同时用二甲亚砜作为保护剂，DCs经过-20℃和-80℃降温，在-196℃液氮保存，然后40℃水浴复苏。结果第6天体外培养的DCs由贴壁状态变为悬浮毛刺状细胞，随着培养时间的延长，此类细胞数量增多，第14天为形态不规则的毛刺状，为典型树突状细胞形态。流式细胞仪检测表明，成熟DCs高水平地表达HLA—DR、CD80、CD83、CD1a、CD11c。被激活的T细胞对2种来源于不同组织的肿瘤细胞均产生了明显的杀伤性。冻存DCs和新鲜DCs的生物活性无明显差异。结论脐血单个核细胞细胞经hGM—CSF＋hIL-4＋hTNF—α体外培养，能诱导出DCs，为进一步开展DCs的实验研究与临床应用奠定了基础。     

脐血与恶性胸腔积液来源树突状细胞的培养及特性的比较研究

目的拟用体外培养的方法，从人脐血及恶性胸腔积液中诱导出功能健全的树突状细胞（DCs）。并探讨DCs的体外培养、增生情况。方法从脐血及恶性胸腔积液中分离出DCs前体细胞，加入IL-4，GM-CSF，TNF-α诱导出DCs。用倒置显微镜观察培养的DCs及用流式细胞仪检测DCs的表面分子。做混合淋巴细胞反应（MLR），了解DCs对T细胞的激活作用。结果两种来源的DCs在形态及细胞表型差异无统计学意义，但两种来源的DCs成熟的时间有差异。两种来源的DCs均可使T细胞扩增．但激发T细胞增生的能力有差异。结诊人脐血及恶性胸腔积液中可诱导出功能饽今的DCs．     

CIK的体外增殖及体内外杀瘤活性的实验研究

目的:从人骨髓造血前体细胞体外培养扩增树突状细胞(dendritic cells,DCs),测定其表型及T细胞刺激活性.方法:采用Mini-MACS分离技术,从正常人骨髓、脐血分离CD34~ 造血干细胞,体外以重组hGM-CSF,hTNF-α,hIL-3诱导培养2周,流式细胞术检测扩增细胞的表面表型及细胞内IL-12的表达,体外同种混合淋巴细胞反应检测扩增DCs的T细胞刺激活性.结果:从正常人骨髓、脐血分离得到高纯度(>90%)的CD34~ 造血干细胞,经重组hGM-CSF,hTNF-α的共同诱导培养,扩增得到大量DCs,加人hIL-3可以进一步增加DCs产量;FACS检测表明,扩增的DCs表达HLA-DR,CD40,CD54,CD80,CD86分子,细胞内有hIL-12的P35,P40亚基的表达;与外周血单核细胞培养生成的DCs相比,由CD34~ 干细胞扩增的DCs具有更强的激发同种T细胞增殖的能力.结论:人CD34~ 干细胞体外经诱导培养,可以生成大量功能成熟的DCs,从而为进一步开展DCs的基础及临床研究打下了基础.     

肺癌肿瘤全溶物脉冲自体树突状细胞体外诱生T细胞抗肿瘤反应的研究

目的　探讨非小细胞肺癌 (NSCLC)患者全瘤溶解物 (WTL)冲击的自体树突状细胞 (DCs)瘤苗体外诱生T细胞介导的抗肿瘤反应。方法　在含重组人粒细胞 巨噬细胞 集落刺激因子 (rhGM CSF)和重组人白细胞介素 4 (rhIL 4 )的培养条件下 ,以 10例患者的贴壁外周血单核细胞 (PBMCs)衍生不成熟的树突状细胞 (imDCs) ,分别添加肿瘤坏死因子 (TNFα)、自体WTL或WTL TNFα诱导成熟 ,即分别为DCs/TNF、DCs/WTL和 DCs/WTL ,用流式细胞仪和混合淋巴细胞反应 (MLR) ,检测细胞表面分子的表达变化及其刺激异基因或同基因的T细胞增殖能力。将 DCs/WTL和自体T细胞共培养1～ 2周 ,以诱导细胞毒性T淋巴细胞 (CTL) ,用计数γ 干扰素 (IFN γ)释放的酶联免疫斑点 (ELISPOT)试验和乳酸脱氢酶 (LDH)释放的细胞毒试验 ,分别检测该CTL中识别自体肿瘤细胞释放特异性IFN γ的T细胞数和溶瘤活性。结果　以 30 μg/ml蛋白的WTL体外冲击自体 10 6imDCs,可导致上调DC表型 ,包括CD1a、CD83和CD86以及HLA DR的分子表达 ,与常规TNFα诱导成熟的DCs表型相似。虽然两者均能显著刺激异基因T细胞的增殖 ,但其刺激自体T淋巴细胞的增殖能力 ,DCs/WTL却显著高于DCs/TNF(P <0 .0 5 )。将体外与 DCs/WTL共培养的自体T细胞作为反应或效应细胞 ,再次     

人脐血树突状细胞抗神经胶质瘤的体外免疫效应研究

目的　研究肿瘤抗原致敏的树突状细胞 (DC)对神经胶质瘤细胞的免疫杀伤效应。方法　应用免疫磁珠分选脐血 CD34细胞 ,经 SCF FL3 GM- CSF IL- 4 TNF- α的联合诱导培养 DC,采用相差显微镜观察树突状细胞的形态 ;流式细胞仪作 DC的表面标志检测 ;MTT比色法测定同种异型的混合淋巴细胞反应能力和诱导CTL 毒性的检测。结果　 (1)脐血 CD34细胞在体外经细胞因子联合刺激后呈典型的 DC形态 ;(2 )流式检测 CD4 0、CD80和 CD86等成熟 DC特异性表面标志呈高表达 ,分别与诱导前比较 ,差异均有显著性 ;(3) MTT法测得脐血来源的 DC较外周血 DC刺激同种异体 T淋巴细胞增殖能力弱 ;经肿瘤抗原负载的 DC体外诱导出较强 CTL 毒性。结论　脐血 CD34细胞经体外扩增诱导的 DC具有典型的 CTL 毒性 ,为临床应用脐血来源 DC抗神经胶质瘤的生物治疗提供了理论依据     

负载腮腺腺样囊性癌抗原的树突状细胞诱导的抗肿瘤效应

目的：探讨腺样囊性癌肿瘤抗原负载的树突状细胞通过淋巴细胞介导的免疫反应,体外杀伤腺样囊性癌细胞的细胞毒性效应。方法：外周血单核细胞在GM—CSF＋IL-4的诱导下体外培养,用肿瘤细胞抗原冲击后,流式细胞仪检测树突状细胞抗原负载前后CD1a、CD83表达量的变化。MTT比色法检测同种异体的混合淋巴细胞反应和诱导细胞毒淋巴细胞CTL杀伤肿瘤细胞。结果：凋亡肿瘤抗原刺激后,CD83表达增加（P〈0．01）,而CD1a表达量下调（P〈0．05）。负荷肿瘤抗原树突状细胞体外诱导出明显的细胞不良反应,并刺激同种T淋巴细胞增殖。结论：GM—CSF＋IL-4诱导的单核细胞来源的树突状细胞,能在体外摄取肿瘤抗原而进一步成熟,通过激活淋巴细胞杀伤癌细胞。     

淫羊藿苷促进脐血来源树突状细胞的分化与成熟

目的：研究淫羊藿苷（icariin,ICA）体外对脐血单个核细胞来源树突状细胞的分化、成熟及免疫活性的影响。方法：无菌条件下采集脐血,密度梯度离心法分离脐血单个核细胞,用GMCSF、IL4诱导树突状细胞（dendritic cells, DCs）,第5天后将DCs分为3组（ICA组、TNFα组和阴性对照组）并作相应处理。倒置显微镜和透射电镜下观察DCs形态,流式细胞术检测DCs表面分子CD1a、CD80、CD83和CD86的表达情况,ELISA法检测DCs培养上清中IL12和IFNγ的水平,MTT法检测DCs刺激T细胞增殖的能力。结果：ICA刺激后,脐血单个核细胞来源DCs呈现典型的成熟DCs形态学特征。ICA组DCs表面CD1a、CD80、CD83和CD86表达水平较对照组均明显上调（P<0.05）,且CD86的表达水平显著高于TNFα组（P<0.05）。ICA组DCs上清中IL12、IFNγ的水平及诱导T细胞增殖的能力较对照组DCs明显增高（P<0.05）,但与TNFα组DCs无显著差异。结论：ICA可刺激脐血单个核细胞来源DCs的分化和成熟,增强DCs的免疫学活性。     

钙载体A_(23187)快速诱导人外周血单核细胞成树突状细胞

 目的　探讨钙载体 (calciumionophore ,CI)A2 3 187对正常人外周血单核细胞来源的树突状细胞(Dendriticcell,DC)形态、表面分子表达及免疫功能的影响。方法　分离健康献血者外周血单核细胞 ,分别加入 :重组人粒 /单集落刺激因子 (rhGM CSF) 10 0ng/ml、rhGM CSF 10 0ng/ml +IL 4 5 0ng/ml、rhGM CSF +A2 3 187(钙载体 ,CI)各 10 0ng/ml。体外培养 4 0h后 ,于光镜及电镜下观察细胞的形态、流式细胞仪检测细胞的表面标志、MTT比色法检测上述细胞对同种异体T细胞的刺激增殖作用。结果　外周血单核细胞在GM CSF +A2 3 187各 10 0ng/ml的条件下培养 4 0h ,就可看到典型的DC形态 ,其表面单核细胞的特征性标志CD14分子表达减少 ,HLA DR、CD80、CD86及CD83分子的表达均明显增高 ,且具有明显刺激同种异体T细胞增殖的能力。结论　外周血单核细胞在钙载体A2 3 187及GM CSF的共同作用下 ,4 0h就能获得成熟的DC     

人肺癌组织总RNA转染树突状细胞诱导特异性抗肿瘤免疫的研究

目的:探讨以人肺癌组织总RNA体外转染树突状细胞(dendritic cells,DCs)诱导细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymptocyte,CTL)发挥特异性抗肿瘤免疫的作用.方法:10例肿瘤组织经免疫组化测定为CEA、MUC1双阳性.一步法提取肿瘤组织总RNA和10例正常肺组织RNA.采集患者外周血单个核细胞体外诱导未成熟DCs,电穿孔法转染肿瘤和肺组织RNA,刺激DCs成熟后,部分行流式细胞仪检测,部分用于体外诱导CTL.以原代培养的肿瘤细胞和肺上皮细胞作为靶细胞,定量乳酸脱氢酶法测定杀伤率.结果:体外培养的DCs形态典型,高表达CD86、CD80、CD40、HLA-DR和CD83.转染肿瘤组织RNA DCs的CEA和MUC1表达量为(20.53±3.64)%和(65.39±9.33)%,明显高于转染肺组织RNA的DCs[(0.78±0.39)%和(18.32±4.24)%],P＜0.01.肿瘤组织RNA转染DCs诱导的CTL可产生针对肿瘤细胞的特异性杀伤;且用自身肿瘤组织RNA转染DCs诱导的CTL对自身肿瘤细胞杀伤活性最大.结论: 以人肺癌总RNA体外转染DCs诱导CTL可以产生特异性抗肿瘤免疫,此方法构建肺癌疫苗是可行的.     

紫杉醇联合顺铂诱导的凋亡卵巢癌细胞的免疫原性

目的: 探讨紫杉醇联合顺铂诱导凋亡的卵巢癌细胞被DCs交叉提呈后能否促进免疫应答。方法：常规贴壁法刺激正常人外周血单核细胞分化诱导为DCs,6 d后将DCs和紫杉醇联合顺铂体外诱导的凋亡人卵巢癌细胞HO8910共同培养（凋亡组）,并以冻融细胞共培养DCs组(冻融组)或单独DCs组(空白组)作对照,以激光共聚焦扫描和流式细胞仪检测不同培养组DCs的分化和成熟程度。分别将各组成熟DCs与同一来源的磁珠分选的CD8+T细胞共培养, 3HTdR掺入法检测其增殖能力;LDH释放反应检测CTL对肿瘤细胞的杀伤能力;同时应用ELISPOT图像分析仪检测致敏后CD8+T细胞INFγ的分泌能力。结果：(1)紫杉醇联合顺铂诱导的凋亡卵巢癌细胞可被DCs有效吞噬,并促进DCs的成熟及其抗原提呈作用;(2) 3HTdR检测显示凋亡肿瘤细胞能诱导CD8+T细胞增殖（P<0.05）;(3)LDH释放实验与ELISPOT图像分析均证明凋亡肿瘤细胞诱导的CTL杀伤活性显著强于冻融组和空白组细胞（P<0.01）。结论：紫杉醇联合顺铂诱导的凋亡卵巢癌细胞具有较强的免疫原性,可促进DCs分化和成熟,进一步促进CD8+T细胞增殖、分泌与杀伤功能。