miR-124靶向调节STAT3基因对骨肉瘤细胞增殖和侵袭的影响

目的探讨miR-124及STAT3在骨肉瘤组织中的表达,以及miR-124对骨肉瘤MG-63细胞增殖和侵袭的影响。方法 Real-time PCR法检测67例患者骨肉瘤组织及对应的癌旁组织中miR-124的表达,免疫组织化学方法检测STAT3蛋白的表达。使用脂质体将miR-124抑制剂及miR-124模拟物转染至骨肉瘤MG-63细胞株,以无关序列作为阴性对照。Western blot方法检测转染后STAT3蛋白的表达变化,采用MTT方法与Transwell实验检测转染后MG-63细胞的增殖侵袭能力变化。结果 miR-124在骨肉瘤组织中的表达明显低于癌旁组织(P0.01);STAT3蛋白在骨肉瘤组织中的表达明显高于癌旁组织(P0.01);转染miR-124抑制剂的MG-63细胞增殖侵袭能力与对照组相比显著升高,细胞内STAT3蛋白表达亦明显升高;转染miR-124模拟物后则得到相反的结果(P0.01)。结论 miR-124抑制骨肉瘤MG-63细胞的增殖和侵袭可能与下调STAT3的表达相关。     

miRNA-10b靶向调控Twist促进骨肉瘤细胞增殖与侵袭的研究

目的探讨microRNA-10b对骨肉瘤细胞MG-63增殖与侵袭能力的影响及潜在作用机制。方法应用实时荧光定量PCR检测人骨肉瘤组织和癌旁正常骨组织中miR-10b的表达差异。将miR-10b mimic和Twist特异性的siRNA (Twist siRNA)分别通过脂质体转染法转染入骨肉瘤细胞系MG-63,应用RT-PCR检测细胞中miR-10b和Twist mRNA的表达,采用蛋白质印迹法(Western blot)检测Twist及内参β-actin蛋白表达水平,采用MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium]法检测miR-10b mimic及Twist siRNA对人骨肉瘤细胞系MG-63增殖能力的影响;采用Transwell侵袭实验检测miR-10b mimic及Twist siRNA对人骨肉瘤细胞系MG-63侵袭能力的影响。结果与正常癌旁骨组织相比,miR-10b在骨肉瘤组织中呈现明显高表达,差异具有极显著性统计学意义(P0.01); miR-10b mimic可使Twist mRNA和蛋白表达水平升高,差异具有统计学意义(P0.05),同时可显著增强MG-63细胞的增殖与侵袭能力(P0.05),而转染miR-10b mimic和Twist siRNA的MG-63细胞的增殖与侵袭能力较仅转染miR-10b mimic的MG-63细胞显著减弱(P0.05)。结论人骨肉瘤细胞系MG-63中miR-10b的表达上调,可能通过靶向激活Twist信号通路促进骨肉瘤细胞的异常增殖与远处侵袭。     

HIF-3α在骨肉瘤组织中的表达及低氧状态对MG-63细胞侵袭能力的影响

目的 探讨HIF-3α在骨肉瘤侵袭转移中的作用,观察低氧对骨肉瘤MG-63细胞侵袭能力的影响。方法 收集15例骨肉瘤组织和15例骨软骨瘤组织,用免疫组织化学染色方法检测骨肉瘤组织和骨软骨瘤组织中HIF-3α的表达情况;MG-63细胞低氧刺激,用定量RT-PCR和Western Blot方法检测MG-63细胞中HIF-3α的表达情况;用细胞黏附实验、细胞迁移实验及细胞侵袭实验检测MG-63细胞的黏附、迁移及侵袭能力。在MG-63细胞中,敲降HIF-3α或过表达HIF-3α后,检测低氧对细胞的黏附、迁移及侵袭能力的影响。结果 免疫组化结果显示骨肉瘤组织中HIF-3α高表达而骨软骨瘤组织中HIF-3α低表达。与常氧条件相比,低氧促进MG-63细胞中HIF-3α mRNA和HIF-3α蛋白的表达,低氧增强MG-63细胞的黏附、迁移及侵袭能力。MG-63细胞中HIF-3α的敲降减弱了MG-63细胞的黏附、迁移及侵袭能力而HIF-3α的过表达增强了MG-63细胞的黏附、迁移及侵袭能力。结论 低氧促进了MG-63细胞中的HIF-3α的表达,增强了MG-63细胞的侵袭转移能力,HIF-3α在低氧诱导的MG-63细胞侵袭转移中具有重要作用。     

白藜芦醇调控miR-34a表达对骨肉瘤MG-63细胞生长、侵袭和自噬的影响

目的:探讨白藜芦醇通过调控微小RNA-34a(miR-34a)表达对骨肉瘤MG-63细胞生长、侵袭和自噬的影响。方法:将骨肉瘤MG-63细胞分为对照组及10、20、40、60和80μmol/L白藜芦醇处理组。采用MTT法、Transwell小室和Western blot实验检测各组骨肉瘤细胞的活力、侵袭能力及自噬蛋白表达;RT-q PCR检测各组骨肉瘤细胞中miR-34a的表达。转染miR-34a模拟物(miR-34a mimic)及阴性对照(miR-34a NC)至骨肉瘤细胞,检测miR-34a mimic和miR-34a NC在白藜芦醇处理后对骨肉瘤细胞活力和侵袭能力的影响,Western blot检测自噬标志蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和beclin-1的蛋白表达。结果:与对照组相比,不同浓度的白藜芦醇可抑制肿瘤细胞的活力和侵袭能力,促进自噬(P0.05)。白藜芦醇可上调肿瘤细胞中miR-34a的表达,并具有剂量依赖性(P0.05),同时促使LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高,beclin-1蛋白表达量上调(P0.05)。miR-34a mimic可增加白藜芦醇对骨肉瘤细胞活力和侵袭能力的抑制,并进一步促进自噬。结论:白藜芦醇可能通过上调miR-34a表达抑制骨肉瘤MG-63细胞生长并促进其自噬。     

miR-124靶向Sp1对人骨肉瘤MG-63细胞增殖的调控

目的探讨miR-124是否能够通过靶向抑制Sp1基因调控人骨肉瘤MG-63细胞的增殖。方法利用荧光素酶报告基因实验验证Sp1基因是否为miR-124的靶基因,应用阳离子脂质体LipofectamineTM2000将miR-124 mimics或inhibitor转染至MG-63细胞,利用real-time PCR和Western blotting分析转染后MG-63细胞Sp1 mRNA和蛋白表达的变化,通过MTT法分析转染后MG-63细胞增殖水平变化。结果荧光素酶报告基因实验证实Sp1基因为miR-124的靶基因。与对照组相比,转染miR-124 mimics后,MG-63细胞Sp1 mRNA与蛋白的表达均显著降低,增殖能力明显下降(P<0.01);与对照组相比,转染miR-124 inhibitor后,MG-63细胞Sp1mRNA与蛋白的表达均显著升高,增殖能力明显升高(P<0.01)。结论 miR-124抑制人骨肉瘤MG-63细胞增殖可能与靶向Sp1基因相关。     

miR-21靶向FasL对人骨肉瘤MG-63细胞增殖的调控

目的探讨miR-21是否能够通过靶向抑制FasL基因调控人骨肉瘤MG-63细胞的增殖。方法利用荧光素酶报告基因实验验证FasL基因是否为miR-21的靶基因,应用阳离子脂质体Lipofectamine~(TM)2000将miR-21 mimics或inhibitor转染至MG-63细胞,利用real-time PCR和Western blotting分析转染后MG-63细胞FasL m RNA和蛋白表达的变化,通过MTT法分析转染后MG-63细胞增殖水平变化。结果荧光素酶报告基因实验证实FasL基因为miR-21的靶基因。与对照组相比,转染miR-21 mimics后,MG-63细胞FasL mRNA与蛋白的表达均显著降低,增殖能力明显升高(P0.01);与对照组相比,转染miR-21 inhibitor后,MG-63细胞FasL mRNA与蛋白的表达均显著升高,增殖能力明显降低,P0.01。结论 miR-21可能通过靶向FasL基因促进人骨肉瘤MG-63细胞增殖。     

miR-30a抑制人骨肉瘤细胞143B的迁移、侵袭和活力

目的探讨miR-30a对人骨肉瘤细胞143B侵袭、迁移和细胞活力的影响。方法过表达或抑制miR-30a分别处理人骨肉瘤细胞143B。划痕实验观察细胞划痕愈合能力;Transwell实验检测143B细胞迁移和侵袭能力;MTT实验检测细胞活力;定量PCR实验确认过表达miR-30a腺病毒有效性并且检测RUNX2 mRNA表达;Western blot检测细胞中RUNX2总蛋白表达。结果过表达miR-30a抑制了骨肉瘤细胞143B迁移和侵袭(P0.05),在72 h时,miR-30a明显抑制细胞活力(P0.01);抑制miR-30a的内源性表达后,143B细胞的迁移和侵袭能力增加(P0.05),细胞活力也表现出上升水平(P0.01);同时过表达miR-30a可以抑制RUNX2的蛋白表达,抑制内源性miR-30a后RUNX2蛋白水平表达增加(P0.05)。荧光素酶活性检测,miR-30a可以靶向于RUNX2(P0.01)。结论 miR-30a抑制骨肉瘤细胞143B的迁移、侵袭和活力,其作用可以能是通过抑制RUNX2的表达来实现。     

下调lncRNA TTTY15靶向miR-4500抑制胶质瘤细胞A172生物学特性的实验研究CSCD

目的探讨下调lncRNA TTTY15靶向miR-4500对胶质瘤细胞A172增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响及机制。方法用qRT-PCR法检测胶质瘤细胞和组织中TTTY15表达的差异。用Starbase软件预测TTTY15的靶基因, 发现其与miR-4500存在互补结合位点, 用荧光素酶报告系统鉴定二者的靶向关系。将胶质瘤细胞A172分为对照组、si-NC(转染siRNA对照组)、si-TTTY15(转染TTTY15 siRNA)、si-TTTY15+Anti-miR-NC(共转染TTTY15 siRNA、inhibitor对照组)和si-TTTY15+Anti-miR-4500组(共转染TTTY15 siRNA、miR-4500 inhibitor), 分别用CCK-8法和流式细胞术检测细胞增殖和凋亡, 用Transwell小室检测细胞的迁移和侵袭, 用Western印迹法检测Bax、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白的表达。结果胶质瘤细胞和组织的TTTY15表达均升高。TTTY15与miR-4500的表达呈负相关。TTTY15与miR-4500互为靶向关系。与对照组、si-NC组相比, si-TTTY15组胶质瘤细胞miR-4500表达升高, A172细胞存活率降低, 凋亡率升高, 细胞迁移数目和侵袭数目增多, Bax蛋白表达升高, Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白表达降低(P < 0.05)。与si-TTTY15+Anti-miR-NC组相比, si-TTTY15+Anti-miR-4500组胶质瘤细胞中miR-4500表达降低, 细胞存活率升高, 凋亡率降低, 细胞迁移和侵袭数目增加, 细胞中Bax蛋白表达降低, Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白表达升高(P < 0.05)。结论下调TTTY15靶向miR-4500可抑制胶质瘤细胞A172增殖、迁移、侵袭并诱导其凋亡。     

LncRNA MEG3在骨肉瘤组织中的表达及对MG-63细胞增殖、凋亡与侵袭的影响

目的探讨长链非编码RNA母系印记基因3(lncRNA MEG3)在骨肉瘤组织中的表达及对人骨肉瘤细胞MG-63增殖、凋亡与侵袭的影响。方法实时荧光定量PCR(qPCR)方法检测5例骨肉瘤组织及癌旁对应正常组织中lncRNA MEG3的表达水平。构建pcDNA3.1-MEG3重组质粒,MEG3过表达后,MTT方法检测MG63细胞增殖能力的变化;流式细胞术检测MG63细胞的凋亡率;Transwell实验检测MG63细胞侵袭能力的变化;Western blot方法检测MG63细胞增殖细胞核抗原(PCNA)与Racl蛋白的表达变化。结果 lncRNA MEG3在骨肉瘤组织中的表达显著低于癌旁正常组织(P0.01)。lncRNA MEG3过表达后,MG63细胞的增殖与侵袭能力显著降低,凋亡率显著上升,PCNA与Racl蛋白的表达显著降低(P0.01)。结论 lncRNA MEG3在骨肉瘤组织中低表达,过表达lncRNA MEG3能够抑制人骨肉瘤细胞MG-63的增殖与侵袭,并促进凋亡。     

miR-140在骨肉瘤组织中表达降低及其过表达可促进骨肉瘤U2细胞的凋亡

目的探讨骨肉瘤组织中miR-140的表达,以及过表达miR-140后对骨肉瘤细胞生物学行为的影响。方法用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测40例骨肉瘤患者肿瘤组织与癌旁组织中miR-140的表达。用脂质体法瞬时将人工合成的成熟miR-140片段(miR-140 mimic)转染至骨肉瘤U2细胞中;用qRT-PCR法检测细胞中miR-140的表达,CCK-8法及流式细胞仪检测细胞的增殖及凋亡,Transwell小室检测细胞的侵袭能力,Western印迹法检测miR-140靶基因组蛋白去乙酰化酶4(HDAC4)的表达。结果 72.5%(29/40)的骨肉瘤组织miR-140表达明显低于瘤旁组织(P0.05)。转染miR-140 mimic后U2细胞miR-140的表达水平明显上调(P0.05),细胞增殖能力明显降低(P0.05),凋亡率明显升高(P0.05),侵袭能力明显下降(P0.05),细胞中HDAC4蛋白的表达水平明显下降(P0.05)。结论 miR-140在骨肉瘤中低表达;过表达miR-140后可抑制骨肉瘤U2细胞的增殖和侵袭,并促进其凋亡。这一作用可能部分依赖于miR-140靶向抑制HDAC4的表达。     

MiRNA-15a inhibits proliferation,migration and invasion by targeting TNFAIP1 in human osteosarcoma cells

Recent data strongly suggest the important role of miRNAs in various cancer-related processes. Osteosarcoma is the most common type of primary malignant bone tumor and is characterized by complex genetic changes and resistance to conventional treatments. In this study, the role of miRNA-15a (miR-15a) in the progression and metastasis of osteosarcoma was investigated. The result demonstrated that the expression of miR-15a was down-regulated in osteosarcoma tissues and cell lines as compared with that in adjacent non-neoplastic bone tissues and the osteoblastic cell line. In functional assays, miR-15a inhibited cell proliferation, migration and invasion in U2OS and MG-63 cells. Meanwhile, bioinformatic analysis combined with experimental confirmation demonstrated that tumor necrosis factor; α-induced protein 1 (TNFAIP1) gene is a potential target of miR-15a and can be directly regulated by miR-15a. Down-regulation of TNFAIP1 induced effects on osteosarcoma cell lines similar to those induced by miR-15a. Taken together, these data suggest that miR-15a may act as a tumor suppressor, which is commonly down-regulated in both osteosarcoma tissues and cells. TNFAIP1 plays an important role in mediating miR-15a dependent biological functions in osteosarcoma. Reintroduction of miR-15a may be a novel therapeutic strategy by down-regulating TNFAIP1 expression.     

miRNA-363通过调控SOX4影响骨肉瘤细胞生长及凋亡

目的:探讨骨肉瘤组织中miRNA-363及SOX4的表达水平,以及miRNA-363对骨肉瘤细胞活力、细胞周期以及凋亡的影响及机制。方法:用real-time PCR法检测63例骨肉瘤患者肿瘤组织与癌旁组织中miRNA-363及SOX4的表达水平及相关性。用脂质体法将miRNA-363 mimics瞬时转染入MG-63人骨肉瘤细胞,检测细胞中miRNA-363及SOX4的表达水平;CCK-8实验检测各组细胞的活力;流式细胞术检测各组细胞的周期及凋亡率;检测转染SOX4 siRNA或质粒后miRNA-363的表达水平。结果:骨肉瘤组织miRNA-363表达明显低于瘤旁组织,SOX4的mRNA表达明显高于瘤旁组织,miRNA-363与SOX4的表达水平呈明显负相关。转染miRNA-363 mimics后MG-63细胞miRNA-363的表达水平明显上调,SOX4 mRNA及蛋白的表达水平明显下降;同时,细胞活力明显下降细胞周期阻滞在G_0/G_1期,凋亡率增高。改变SOX4表达后,miRNA-363的表达无明显变化,升高SOX4表达能够恢复miRNA-363抑制的细胞活力。结论:miRNA-363在骨肉瘤中呈低表达水平,过表达miRNA-363可能通过调控SOX4抑制骨肉瘤细胞的生长,并促进细胞凋亡。     

MicroRNA-370 directly targets FOXM1 to inhibit cell growth and metastasis in osteosarcoma cells

MicroRNAs (miRNAs) are endogenous, non-coding, small RNAs, which play a critical role in regulating varieties of the biological and pathologic processes. Several reports have indicated that miR-370 acts as a tumor suppressor in varieties of tumors. However, the roles of miR-370 in osteosarcoma have not been reported. In this study, our objective was to explore the biological functions and its molecular mechanism of miR-370 in osteosarcoma cell lines, finding a therapeutic target of osteosarcoma. Our data demonstrated that miR-370 was evidently reduced in osteosarcoma cell lines, whereas FOXM1 expression was markedly increased. Up-regulation of miR-370 suppressed proliferation, arrested cell cycle and induced apoptosis in osteosarcoma cells. Besides, invasion and EMT of osteosarcoma cells was also inhibited by introduction of miR-370. Next, we found that FOXM1 expression was significantly reduced by up-regulation of miR-370. Bioinformatics analysis predicted that the FOXM1 was a potential target gene of miR-370. Luciferase reporter assay further confirmed that miR-370 could directly target the 3’ UTR of FOXM1. Overexpression of FOXM1 in osteosarcoma cells transfected with miR-370 mimic partially reversed the effects of miR-370. In conclusion, miR-370 inhibited cell growth and metastasis in osteosarcoma cells by down-regulation of FOXM1.     

miR-335靶向Sp1对人骨肉瘤MG-63细胞增殖的调控

 目的：探讨 miR-335对人骨肉瘤MG-63细胞增殖的调控是否通过靶向抑制Sp1基因的表达实现。方法：利用萤光素酶报告基因实验验证 miR-335能否靶向作用于Sp1基因的3’-非翻译区(untranslated region, UTR);利用real-time PCR和Western blotting分析Sp1 mRNA和蛋白表达的变化;通过 MTT法分析MG-63细胞增殖水平。结果：萤光素酶报告基因实验结果显示,miR-335可特异性结合于Sp1基因的3’-UTR。Real-time PCR和Western blotting结果显示,转染miR-335可减少Sp1蛋白的表达,但对mRNA表达无显著影响;转染Sp1表达质粒可上调Sp1 mRNA和蛋白表达。MTT结果显示,miR-335可抑制MG-63细胞增殖,转染Sp1表达质粒可部分逆转miR-335对MG-63细胞增殖的抑制作用。结论: miR-335可能通过靶向Sp1基因抑制人骨肉瘤MG-63细胞增殖。     

miR-654-3p靶向GMFB抑制骨肉瘤细胞增殖的作用及机制研究

目的 探究miR-654-3p对骨肉瘤细胞增殖的影响，预测其靶基因并评估靶基因对骨肉瘤患者生存预后的干预情况。方法 选择GEO数据库中GSE70367数据集进行差异分析，筛选骨肉瘤细胞中异常表达的miRNA，通过RT-qPCR检测miR-654-3p在骨肉瘤细胞系143B、MG-63、SAOS2和HOS中的表达情况。通过TargetScan和miRmap数据库预测miR-654-3p的靶基因，采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-654-3p与GMFB基因的结合。用CCK8实验和CFU实验分析miR-654-3p和GMFB对骨肉瘤细胞MG-63和HOS增殖的影响。下载TCGA数据库中肉瘤患者的GMFB表达数据和临床信息，通过R软件包绘制GMFB对生存预后影响的KM曲线以及预测肉瘤患者1年、3年和5年生存率的列线图。结果 与人正常成骨细胞hFOB1.19相比，骨肉瘤细胞系143B、MG-63、SAOS2和HOS中miR-654-3p的表达均明显降低（P＜0.05）。miR-654-3p与GMFB基因结合，并负调控GMFB的表达。miR-654-3p模拟物在体外明显抑制骨肉瘤细胞的增殖，而GMFB转染能够逆转抑制作用（P＜0.05）。GMFB高表达的骨肉瘤患者的总体生存率明显低于低表达患者（P＜0.05），且通过列线图能够预测患者的1年、3年和5年生存率。结论 miR-654-3p通过靶向负调控GMFB基因表达，抑制骨肉瘤细胞的增殖，且GMFB高表达与骨肉瘤患者的预后呈负相关。     

CD44对骨肉瘤细胞增殖、黏附和侵袭性的影响

目的研究细胞表面黏附分子CD44对骨肉瘤细胞增殖、黏附和侵袭特性的影响,探讨骨肉瘤细胞生长侵袭的机制。方法流式细胞术和Westernblot检测3株骨肉瘤细胞系MG63、HOS和U2-OS中CD44的阳性表达率和相对蛋白含量;逆转录聚合酶链反应(RTPCR)法研究3株细胞系之间CD44mRNA的表达差异;同时应用MTT法、美蓝硼酸盐法和微孔迁移技术研究阻断CD44的作用前后3株细胞的增殖、黏附和侵袭能力的变化。结果HOS和U2-OS中CD44的阳性百分率均高于99%,但HOS中CD44的平均荧光强度显著高于U2-OS(P<0.01);而MG63中CD44阳性百分率仅为(2.10±0.46)%;Westernblot亦证明HOS中CD44的蛋白含量显著高于U2-OS(P<0.05),而MG-63中CD44表达为阴性;CD44mRNA在HOS和U2OS中的表达也显著高于MG-63(P值均<0.05)。HOS的侵袭性显著高于MG63和U2-OS(P值均<0.01);HOS与MG63的增殖速率和黏附性差异无统计学意义,但均显著高于U2OS(P值均<0.01)。应用中和抗体阻断CD44的作用之后,HOS和MG-63的黏附性均显著降低(P值均为0.03),U2-OS的黏附性无明显变化(P=0.93);HOS和U2-OS的侵袭力显著降低(P值均<0.01),而MG-63的侵袭力无明显改变(P=0.18);3株细胞的增殖速率均无显著变化(P值均>0.05)。结论CD44能促进骨肉瘤细胞系HOS的黏附和侵袭,并参与U2-OS的侵袭和MG-63的黏附过程,但是不影响骨肉瘤细胞的增殖速率。     

MicroRNA-17 promotes osteosarcoma cells proliferation and migration and inhibits apoptosis by regulating SASH1 expression

MicroRNAs (miRNAs) are abnormally expressed in numerous diseases, which are intimately associated with cell proliferation, migration and invasion. Recent study indicated that miR-17 may be involved in regulating osteosarcoma (OS) occurrence and development, but its function and mechanism have not been reported. In this study, quantitative real-time PCR (qRT-PCR) was used to measure the expression of miR-17, and Western blotting assay was performed to measure the expressions of SAM and SH3 domain containing 1 (SASH1), phosphoinoinositide-3 kinase (PI3K), protein kinase B (AKT), Caspase3, Bcl-2 gene family (Bcl-2, Bax) and matrix metalloprotein (MMP-2, MMP-9) in MG-63 cells. Luciferase reporter assay was conducted to confirm the target of SASH1 by miR-17. Cell proliferation, migration, invasion and apoptosis assay was performed to investigate the role of miR-17 in OS cells. We found that the expression of miR-17 was significantly up-regulated in OS cell lines. MiR-17 inhibitor inhibited the proliferation ability, and induced apoptosis of OS cells. Besides, miR-17 inhibitor prevented the migration and invasion of OS cells. Further, we identified that SASH1 was a target gene of miR-17. In addition, knockdown of miR-17 increased the protein expression of SASH1, and regulate related genes of cell proliferation, invasion and anti-apoptosis in the downstream of OS cells. These findings indicated that miR-17 was over-expressed and promoted cell proliferation, migration and inhibited cell apoptosis by targeting SASH1 in OS cells.