大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

背景：骨髓间充质干细胞在骨髓中含量极低,体外培养难度较大。体外分离培养纯度高、活力强、生物特性均一的间充质干细胞,对组织工程及细胞的体内、体外实验显得至关重要。目的：建立大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化方法,并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测。方法：通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,绘制生长曲线,细胞周期分析,流式细胞仪检测细胞表面标记物,分别向成骨、成脂方向诱导分化。结果与结论：大鼠骨髓间充质干细胞生长以梭形细胞为主,呈放射状排列的细胞集落,细胞生长旺盛,可连续稳定传代10代以上。生长曲线及细胞周期显示骨髓间充质干细胞符合正常细胞生长特征且生长活跃。第3代骨髓间充质干细胞CD44,CD90,CD105均呈阳性表达,而CD34,CD45呈阴性表达。成脂、成骨诱导后,油红O染色、碱性磷酸酶染色、von Kossa法染色和茜素红染色均呈阳性。全骨髓贴壁培养法操作简单,可大量分离、纯化、扩增骨髓间充质干细胞,所获细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性,经诱导培养后具有多向分化潜能。实验所用的全骨髓贴壁法法为组织工程提供充足的种子细胞来源具有重要的现实意义。     

大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

背景:骨髓间充质干细胞在骨髓中含量极低,体外培养难度较大.体外分离培养纯度高、活力强、生物特性均一的间充质干细胞,对组织工程及细胞的体内、体外实验显得至关重要.目的:建立大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化方法,并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测.方法:通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,绘制生长曲线,细胞周期分析,流式细胞仪检测细胞表面标记物,分别向成骨、成脂方向诱导分化.结果与结论:大鼠骨髓间充质干细胞生长以梭形细胞为主,呈放射状排列的细胞集落,细胞生长旺盛,可连续稳定传代10代以上.生长曲线及细胞周期显示骨髓间充质干细胞符合正常细胞生长特征且生长活跃.第3代骨髓间充质干细胞CD44,CD90,CD105均呈阳性表达,而CD34,CD45呈阴性表达.成脂、成骨诱导后,油红O染色、碱性磷酸酶染色、von Kossa法染色和茜素红染色均呈阳性.全骨髓贴壁培养法操作简单,可大量分离、纯化、扩增骨髓间充质干细胞,所获细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性,经诱导培养后具有多向分化潜能.实验所用的全骨髓贴壁法法为组织工程提供充足的种子细胞来源具有重要的现实意义.     

大鼠骨髓间充质干细胞体外增殖与多向分化的能力

背景:生理条件下机体内多数骨髓间充质干细胞增殖并不明显,然而在一定刺激下可表现出旺盛的有丝分裂活动,具有很强的增殖倍增能力,且体外实验表明其具有多向分化潜能.目的:进一步验证体外分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞生长增殖与多向分化潜能.方法:全骨髓法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,贴壁筛选法进行纯化,倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长特征,MTT法绘制细胞生长曲线,免疫组化法对细胞表面干细胞标志CD44进行鉴定.取传至第4代细胞,分别用成骨、成软骨、成脂肪和成神经诱导剂予以培养,通过碱性磷酸酶染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色、油红O染色、NeuN抗体免疫组化染色进行分化能力鉴定.结果与结论:分离培养的细胞呈长梭形或多边形,细胞生长曲线呈S形,群体倍增时间约为31 h,免疫细胞化学染色后CD44呈阳性表达,CD34呈阴性.第4代骨髓间充质干细胞成骨诱导2周后出现钙盐沉积,成软骨诱导培养2周后Ⅱ型胶原检测呈阳性,成脂肪诱导培养2周后在细胞的胞浆内充满大量红色脂肪滴,成神经诱导6 h后细胞出现突起,类似神经元的轴突和树突纤维,NeuN免疫组化染色呈阳性.表明体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞生长增殖能力旺盛,可向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经元样细胞方向分化.     

建立大鼠骨髓间充质干细胞稳定分离培养体系与鉴定

背景:骨髓间充质干细胞作为种子细胞存组织工程等领域应用广泛,建立稳定的分离培养体系和统一鉴定标准尤为重要.目的:以不同方法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测.设计、时间及地点:细胞学体外对比观察,于2005-08/12在暨南大学完成.材料:SPF级3月龄SD雌性大鼠5只,由中山大学实验动物中心提供.方法:无菌条件下分离大鼠双下肢,低糖DMEM培养液冲出骨髓,分别运用全骨髓贴壁法和密度梯度离心法体外分离骨髓间充质干细胞.利用差速贴肇原理对细胞进行纯化扩增.取生长状态良好的第3代骨髓间充质干细胞,分别加入成骨、成脂、成软骨诱导培养基,培养14d.主要观察指标:倒置相差显微镜下观察骨髓间充质干细胞的生长状态,流式细胞仪检测细胞表面标志物的表达,采用碱性磷酸酶染色鉴定成骨能力,以油红○染色鉴定成脂能力,以甲苯胺蓝染色鉴定成软骨能力.结果:与密度梯度离心法相比,全骨髓贴肇法分离获得的骨髓间充质干细胞贴壁时间短,增殖快,经传代后能够纯化.第3代骨髓间充质干细胞形态单一均匀,呈典型的极性漩涡状生长,不表达造血前体细胞标志抗原CD34和白细胞标志抗原CD45,表达整合索家族成员CD29和黏附分子CD44,经诱导后碱性磷酸酶染色、油红○染色和甲苯胺蓝染色均呈阳性.结论:采用全骨髓贴壁法可稳定获得均质性良好的大鼠骨髓间充质干细胞,效果优于密度梯度离心法.经全骨髓贴壁法体外分离培养的细胞在形态学、细胞表面标志物表达和多向分化能力方面具有干细胞生物学特性,经鉴定为大鼠骨髓间充质干细胞.     

大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导分化的超微结构变化

背景：目前对骨髓间充质干细胞成骨诱导分化的超微结构观察的报道甚少。目的：采用全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,成骨诱导并染色鉴定,利用电镜观察诱导前后细胞超微结构变化特点。方法：全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表面标记物,成骨染色鉴定向成骨方向诱导分化,扫描电镜及透射电镜观察成骨诱导前后细胞超微结构变化。结果与结论：培养的第3代骨髓间充质干细胞纯度高、活力强,成骨诱导后的碱性磷酸酶活性染色、钙化结节染色均呈阳性扫描电镜及透射电镜观察显示,经向成骨细胞诱导分化后,细胞形态铺展,不规则,其线粒体、粗面内质网、空泡明显增多表明细胞功能活跃。     

大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导分化的超微结构变化

背景:目前对骨髓间充质干细胞成骨诱导分化的超微结构观察的报道甚少.目的:采用全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,成骨诱导并染色鉴定,利用电镜观察诱导前后细胞超微结构变化特点.方法:全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表面标记物,成骨染色鉴定向成骨方向诱导分化,扫描电镜及透射电镜观察成骨诱导前后细胞超微结构变化.结果与结论:培养的第3代骨髓间充质干细胞纯度高、活力强,成骨诱导后的碱性磷酸酶活性染色、钙化结节染色均呈阳性.扫描电镜及透射电镜观察显示,经向成骨细胞诱导分化后,细胞形态铺展,不规则,其线粒体、粗面内质网、空泡明显增多,表明细胞功能活跃.     

全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性及优势

背景：骨髓来源的间充质干细胞含量极低,体外纯化、扩增活性好、分化潜能高的骨髓间充质干细胞,对进一步研究至关重要。目的：进一步验证全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化骨髓间充质干细胞的生物学特性、表型及多向分化潜能。方法：通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,流式细胞仪检测细胞标记物表达,分别进行成骨、成脂诱导分化。结果与结论：成功纯化、扩增了高细胞活性、高分化潜能的骨髓问充质干细胞。所得细胞呈成纤维细胞样;表达CD29、CD90,不表达CD45;成骨、成脂诱导分化后,茜素红染色、油红O染色阳性。证实全骨髓贴壁法操作简单、对细胞活性损伤小,可以得到高纯度、高活性、高分化潜能、生物学形态和特征稳定的骨髓间充质干细胞。     

骨髓间充质干细胞增殖分化能力可随鼠龄增长而下降

背景：骨髓间充质干细胞是理想的组织工程种子细胞来源,但是不同年龄的骨髓间充质干细胞体外增殖、分化特点有很大差异,有关年龄与骨髓间充质干细数量的关系目前尚缺少系统研究。目的：观察不同鼠龄大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化活性的差异。方法：通过全骨髓贴壁培养法,体外分离、纯化、扩增 SD 大鼠骨髓间充质干细胞,倒置相差显微镜观察形态学特点,流式细胞仪检测细胞表面标记,体外诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞、成软骨细胞分化并鉴定。取第3代2,4,6,8,12周龄和10,12月龄大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导1,2,3周,采用酶联免疫法检测骨钙素含量。结果与结论：体外培养的骨髓间充质干细胞为贴壁生长,长梭形成纤维细胞样细胞,可增殖形成克隆;流式细胞仪分析骨髓间充质干细胞CD29、CD90表达阳性,CD45表达阴性,CD44部分表达;经成骨分化诱导,细胞碱性磷酸酶染色阳性,茜素红染色阳性;经成软骨分化诱导,阿利辛蓝染色阳性,可见通过全骨髓贴壁法可成功地从大鼠骨髓中分离出骨髓间充质干细胞。通过不同鼠龄骨髓间充质干细胞诱导成骨分化后骨钙素含量测定得出骨髓间充质干细胞增殖分化能力随鼠龄的增长而下降。     

全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其生物学特性

背景：培养出生长状态良好、数量足够多的大鼠骨髓间充质干细胞是其作为种子细胞在组织工程等领域广泛应用的重要前提。目的：寻求快捷有效的大鼠骨髓间充质干细胞体外培养条件,观察培养的间充质干细胞生物学特性。方法：全骨髓法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,贴壁筛选法进行纯化,倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长特征,免疫荧光分析细胞骨架,MTT法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测其表面标记。结果与结论：分离培养的细胞呈长梭形或多边形;细胞生长曲线呈S形;微丝免疫荧光染色结果显示,培养的骨髓间充质干细胞具有良好的细胞骨架系统。第3代骨髓间充质干细胞CD29、CD44、CD71、CD90均呈阳性表达,而CD13、CD34、CD45、CD133呈阴性。提示,经全骨髓贴壁法体外分离培养的细胞在形态学和细胞表面标志物表达方面具有干细胞生物学特性,经鉴定为骨髓间充质干细胞,其第3代活性最佳,可用于后续实验。     

全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其生物学特性

背景:培养出生长状态良好、数量足够多的大鼠骨髓间充质干细胞是其作为种子细胞在组织工程等领域广泛应用的重要前提.目的:寻求快捷有效的大鼠骨髓间充质干细胞体外培养条件,观察培养的间充质干细胞生物学特性.方法:全骨髓法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,贴壁筛选法进行纯化,倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长特征,免疫荧光分析细胞骨架,MTT法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测其表面标记.结果与结论:分离培养的细胞呈长梭形或多边形;细胞生长曲线呈S形;微丝免疫荧光染色结果显示,培养的骨髓间充质干细胞具有良好的细胞骨架系统.第3代骨髓间充质干细胞CD29、CD44、CD71、CD90均呈阳性表达,而CD13、CD34、CD45、CD133呈阴性.提示,经全骨髓贴壁法体外分离培养的细胞在形态学和细胞表面标志物表达方面具有干细胞生物学特性,经鉴定为骨髓间充质干细胞,其第3代活性最佳,可用于后续实验.     

全骨髓细胞贴壁法分离与培养大鼠骨髓间充质干细胞的多向分化能力

背景：分离培养纯度较高的骨髓间充质干细胞是对其进行深入研究的前提。目的：观察全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特征。方法：选取体质量为80-100g雄性SD大鼠,采用全骨髓细胞贴壁培养法获取骨髓间充质干细胞。在取材过程中需严格掌握大鼠处死至将细胞悬液放入培养箱内的时间,一般控制在40min以内。使用基础培养基冲洗骨髓腔时力度适中且在骨髓腔内旋转数次,可使骨髓细胞充分脱落,保证骨髓细胞的获得量。结果与结论：原代骨髓间充质干细胞为贴壁生长的成纤维样细胞,传代后的细胞形态均一,呈漩涡状排列;第3代骨髓间充质干细胞的生长曲线呈S形,经历3个生长时期：潜伏期、对数生长期和停滞期;流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面抗原结果示：CD29＋99.45%、CD34＋1.45%、CD44＋99.52%、CD45＋1.41%;成骨、成脂诱导分化后,矿化结节被茜素红染成橘红色,脂滴被油红O染成红色。说明骨髓间充质干细胞能向成骨、成脂分化,具有多向分化潜能,符合国际细胞治疗学会间充质及组织干细胞委员会提出的鉴定动物来源骨髓间充质干细胞的最低标准。     

Ficoll密度梯度离心法分离培养纯化猪的骨髓间充质干细胞

背景：研究报道显示猪骨髓间充质干细胞体外分离方法、效率、培养条件各不相同,并且尚无统一的鉴定标准。目的：建立一种高效、经济的猪骨髓间充质干细胞分离培养及鉴定方法。方法：采集健康猪股骨骨髓,Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞,进行原代和传代培养,流式细胞仪检测细胞膜表面抗原表达情况,并观察细胞成骨、成脂及成软骨分化的能力。结果与结论：分离培养的单个核细胞活力旺盛,体外生长良好,细胞呈梭形、纺锤形和小多角形,具有稳定的增殖分裂能力;细胞膜表面抗原CD29、CD44、CD90呈阳性表达,而CD14、CD34、CD45、CD166、HLA-DR呈阴性表达;在特定诱导条件下,该细胞可分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞。说明采用Ficoll密度梯度离心法成功分离培养出纯化的猪骨髓间充质干细胞,其生长状态良好,具有多项分化潜能,可作为组织工程的种子细胞。     

骨髓间充质干细胞向软骨细胞的分化

背景：以骨髓间充质干细胞构建组织工程气管尚缺乏理想的特异性表面标志物,对其鉴定主要依赖细胞形态学、细胞表型及诱导分化的功能进行分析。目的：体外分离培养、鉴定兔骨髓间充质干细胞,观察在特定条件下向气管软骨细胞分化的潜能。方法：无菌环境取兔骨髓,经全骨髓贴壁筛选法分离培养细胞至第2代,流式细胞术鉴定第1、第2代细胞表面抗原CD44、CD45的表达。无菌环境取气管,经酶消化法分离培养气管软骨细胞,甲苯胺蓝染色鉴定软骨细胞蛋白聚糖的合成。在使用转化生长因子B1的基础上,将骨髓间充质干细胞与气管软骨细胞通过Transwell小室非接触式共培养,倒置显微镜观察细胞形态,甲苯胺蓝染色鉴定蛋白聚糖的合成,荧光实时定量PCR鉴定Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA的表达。结果与结论：分离、培养的细胞呈长梭形、不规则形聚集生长,传代后细胞生长速度明显增快,呈鱼群状聚集生长。第1代有96．97％的细胞表达CD44、13.72％的细胞表达CD45,第2代有99．11％的细胞表达CD44、8．54％的细胞表达CD45。气管软骨细胞甲苯胺蓝染色阳性。在诱导后,骨髓间充质干细胞形态逐渐由长梭形变为三角形或不规则形,表达软骨细胞特异性Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA基因,甲苯胺蓝染色示阳性。结果表明全骨髓贴壁筛选法可成功分离培养骨髓间充质干细胞,第2代纯度较高,且在特定诱导条件下具有分化为气管软骨细胞的潜能。     

骨髓贴壁细胞向破骨细胞的分化

背景：一般认为采用贴壁分离法得到的小鼠骨髓中能够贴壁的细胞为间充质干细胞,并能分化成为成骨、成脂肪及成软骨细胞,其中贴壁的细胞是否有分化为破骨细胞的潜能尚不明确。 目的：检测贴壁分离法得到的小鼠骨髓中能贴壁的细胞是否能够分化为破骨细胞。 方法：采用贴壁法得到小鼠原代间充质干细胞,以及通过贴壁1-5d后得到不同时间贴壁的骨髓细胞。原代间充质干细胞及不同时间贴壁的骨髓细胞分别用普通培养基,及含m-csf和RANKL培养基,培养9 d后进行碱性磷酸酶和抗酒石酸酸性磷酸酶染色。原代间充质干细胞传代后,第2代间充质干细胞分为4组,分别用普通培养基、含m-csf培养基、含RANKL培养基及含m-csf和RANKL的培养基培养,9 d后进行碱性磷酸酶及抗酒石酸酸性磷酸酶染色。 结果与结论：贴壁法得到较均一的间充质干细胞,原代及传代贴壁细胞的联合诱导组抗酒石酸酸性磷酸酶染色均为阳性,说明原代和传代的贴壁骨髓细胞中均有可以分化为破骨细胞的细胞。不同时间贴壁的细胞诱导后碱性磷酸酶及抗酒石酸酸性磷酸酶染色有差异,说明不同时间贴壁的细胞存在分化差异。     

全骨髓贴壁法培养兔骨髓间充质干细胞体外定向成骨诱导分化及鉴定

背景：流式细胞仪分离法和免疫磁珠分离法对细胞活性影响较大,密度梯度离心法虽然能够获得纯度高的单核细胞,但由于多次离心可造成细胞的大量流失且对细胞活性有一定的影响使其应用值得商榷。目的：采用全骨髓贴壁法分离兔骨髓间充质干细胞进行成骨诱导分化及鉴定。方法：采用全骨髓贴壁法体外分离培养兔骨髓间充质干细胞,倒置显微镜下观察细胞形态学特征。在成骨诱导剂作用下,通过碱性磷酸酶染色试剂盒行碱性磷酸酶染色,I型胶原免疫细胞化学染色,VonKossa法及茜素红进行矿化结节染色以及电镜下检测兔骨髓间充质干细胞成骨诱导后的形态结构。结果与结论：经诱导后细胞出现与成骨细胞相似的形态学特征,碱性磷酸酶染色阳性,I型胶原免疫细胞化学染色,Von-Kossa法及茜素红矿化结节染色阳性。表明经成骨诱导剂诱导后全骨髓贴壁法体外分离纯化培养的兔骨髓间充质干细胞能向成骨细胞方向分化增殖。     

快速诱导大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化的培养体系

背景：目前常用的成脂刺激剂主要由胰岛素、地塞米松、IBMX 和吲哚美辛组成,该体系涉及处理因素多、诱导周期长且对细胞毒性大,不利于脂肪形成抑制效应的研究.目的：建立快速诱导大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化的培养体系.方法：大鼠全骨髓细胞原代培养,胰酶消化传代,富集形态均质的间充质干细胞,利用过氧化物酶体增殖物活化受体γ激动剂噻唑烷二酮类药物罗格列酮和吡咯列酮体外单独诱导大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化,设立无糖、低糖和高糖 DMEM 三种基础培养体系,以经典的成脂刺激剂作为阳性对照,在诱导的不同时间点对分化细胞进行形态学观察和油红O染色.结果与结论：与经典成脂刺激剂相比,罗格列酮或吡咯列酮单独均能诱导大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化,吡咯列酮诱导48 h和罗格列酮诱导72 h均可观察到富含脂滴或脂泡以及油红O染色的阳性细胞,吡咯列酮与罗格列酮的最佳诱导浓度分别为0.125 mmol/L和10μmol/L,而高糖环境利于大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化.说明基于高糖培养环境的以吡咯列酮或罗格列酮做为成脂刺激剂的培养体系可快速诱导大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化.     

胚胎及骨髓间充质干细胞增殖活性与成脂分化能力的比较

背景：间充质干细胞最先在骨髓中发现,且骨髓间充质干细胞的相关研究也最多,但是骨髓间充质干细胞来源有限且含量极低。近年来,已经从人胚胎组织分离出间充质干细胞,其与骨髓间充质干细胞在生物学特性上有很多相似之处,但是二者的成脂诱导能力比较尚无明确报道。目的：比较人胚胎组织与骨髓来源间充质干细胞体外增殖能力及成脂诱导能力。方法：采用全骨髓法获得骨髓间充质干细胞,胶原酶消化法获得胚胎组织间充质干细胞。流式细胞术鉴定两种间充质干细胞表面分子标记。用细胞计数方法检测两种间充质干细胞增殖能力。分别向两种细胞培养体系中加入成脂诱导剂诱导14d,经油红O染色后观察并计数,计算不同来源间充质干细胞的成脂诱导分化率。结果与结论：从两种不同组织中均可获取梭形贴壁的间充质干细胞,表面标记物CD44、CD73、CD90和CDl05均呈阳性表达,CDl4、CD34和CD45均为阴性表达;胚胎组织间充质干细胞的增殖能力明显强于骨髓间充质干细胞（P〈0．01）。胚胎组织间充质干细胞和骨髓间充质干细胞经过成脂诱导液诱导14d后,油红O染色结果均为阳性,但是骨髓间充质干细胞体外成脂能力明显强于胚胎组织间充质干细胞（P〈0．01）。     

流动优化骨髓间充质干细胞的分化状况

背景：间充质干细胞在成体动物骨髓中含量极低。目的：观察成年大鼠骨髓间充质干细胞经生理范围流动切应力作用后,其体外生长规律、增殖及定向分化为成骨细胞及脂肪细胞的能力。方法：在体外取得SD大鼠骨髓原代间充质干细胞,利用平板流室系统加载1Pa切应力,对其进行培养及扩增,并分别向成骨细胞及脂肪细胞定向诱导。结果与结论：原代间充质干细胞为长梭形或多角形,集落样生长;经流动加载并传代后细胞生长速度加快,不以集落方式生长,而是均匀分布。细胞体积明显增大,多数为长梭形或多角形;生长曲线显示各代细胞有类似的生长规律;激光共聚焦显微镜显示CD44和CD90阳性,CD31及CD45阴性;向成骨细胞及脂肪细胞诱导14d后,VonKossa染色及油红O染色均为阳性,流动优化后骨髓间充质干细胞保持了体外大量增殖及多向分化潜能。     

兔骨髓间充质干细胞分离培养后的活力检测

背景：目前分离纯化骨髓间充质干细胞多采用单一的方法,对扩增培养过程中细胞活力的变化没有较为系统而全面的评估。目的：探索体外分离培养和纯化兔骨髓间充质干细胞的方法,并对细胞的活力进行检测。方法：采用密度梯度离心联合贴壁筛选的方法分离纯化兔骨髓间充质干细胞,从形态学、细胞表型和成骨成脂能力方面进行鉴定;并从细胞生长曲线、贴壁率和克隆形成率3个方面评估细胞活力。结果与结论：原代细胞多呈梭形和圆形,48h后大部分细胞贴壁,8-10d细胞融合达80%-90%,传代周期为3-5d;流式检测显示CD14、CD34和CD45表达阴性,CD29、CD44和CD90表达阳性;成骨诱导茜素红染色可见明显的钙结节,成脂诱导油红O染色可见大量脂肪细胞;细胞生长曲线、贴壁率及克隆形成率的结果表明第1代和第3代细胞的活力优于第5代细胞。结果说明密度梯度离心联合贴壁筛选的方法能够有效的分离纯化骨髓间充质干细胞,并能较好的保持其生物功能,在扩增传代过程中,细胞活力会有不同程度的下降。