骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的实验研究

目的通过体外诱导研究大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化,为心衰的干细胞移植治疗提供实验依据。方法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,采用5-氮杂胞苷定向诱导,通过形态学、免疫细胞化学及磷钨酸苏木素染色(PTAH)鉴定。结果诱导后细胞以梭形、柱状为主;部分细胞有分支,核一个、卵圆形、居中,类似心肌细胞形态;诱导24h后培养2周,Sarcomeric Actin和Connexin-43表达较弱,以后表达逐渐增强;诱导细胞PTAH阳性。结论骨髓间充质干细胞能在体外被诱导分化为心肌样细胞,有望成为心衰时干细胞移植治疗的理想细胞材料。     

骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的研究

目的目的研究大鼠骨髓间充质干细胞经5-氮杂胞苷诱导在体外转化为心肌样细胞的情况,为心衰的干细胞移植治疗提供基础。方法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,用不同浓度5-氮杂胞苷诱导不同时间,通过形态学、PAS反应、免疫细胞化学等鉴定。结果诱导细胞以梭形、柱状为主,部分细胞有分支,核一个、卵圆形、居中,类似心肌细胞形态;PAS反应阳性;诱导后培养2周,Sarcomeric Actin和Connexin-43表达较弱,以后逐渐增强。以10×10-6mol/L5-氮杂胞苷诱导24h效果最佳。结论骨髓间充质干细胞在5-氮杂胞苷诱导下可定向分化为心肌样细胞,是自体心肌细胞的一种良好供体来源。     

聚乳酸-聚乙醇酸共聚物复合心肌样细胞体外构建工程化心肌组织

背景:研究证实,在一定的诱导条件下,骨髓间充质干细胞可能向心肌细胞等多种中胚层来源的间质细胞分化。目的:探索以聚乳酸-聚乙醇酸共聚物为支架、骨髓间充质干细胞诱导分化的心肌样细胞为种子细胞,体外构建工程化心肌组织的可行性。方法:分离SD大鼠骨髓间充质干细胞,取第3代骨髓间充质干细胞加入含5-氮胞苷的培养液进行诱导分化,培养4周。将诱导成功后的细胞制成细胞悬液,缓慢滴注于预先制备好的聚乳酸-聚乙醇酸共聚物上,培养14d。以倒置相差显微镜观察诱导前后细胞的形态学变化,免疫荧光染色法鉴定诱导后骨髓间充质干细胞中心肌特异性肌钙蛋白Ⅰ的表达,大体观察工程化心肌组织在培养期间的形态,透射电镜观察工程化心肌组织的超微结构。结果与结论:原代培养的骨髓间充质干细胞14d形成集落,传代细胞体积变大,5-氮胞苷诱导后细胞呈长梭形,呈一致性生长。免疫荧光染色结果显示诱导后骨髓间充质干细胞表达心肌特异性肌钙蛋白Ⅰ。透射电镜可见肌丝、Z线样物质。结果证实,以聚乳酸-聚乙醇酸共聚物为支架、骨髓间充质干细胞诱导分化的心肌样细胞为种子细胞,可于体外构建出类似天然心肌的工程化心肌组织。     

5-氮胞苷诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的转化

背景：利用骨髓间充质干细胞多向分化潜能及其可在体外表达多种外源目的基因的特性,将其作为种子细胞用于未来组织器官的修复和替代已成为当前研究的热点。目前,已从人和几种动物骨髓中分离出间充质干细胞,但对猪骨髓间充质干细胞的研究报道很少。目的：建立猪骨髓间充质干细胞体外培养及其转化为心肌样细胞的方法,并探讨其生物学特性。 方法：猪的骨髓间充质干细胞分离纯化后,加入5-氮胞苷诱导分化,用抗desmin、MHC、cTnI、Cx-43进行免疫细胞化学染色鉴定。结果与结论：体外培养的猪骨髓间充质干细胞经5-氮胞苷诱导后,部分间充质干细胞呈梭形,阳性表达desmin、MHC、cTnI和Cx-43。结果提示猪骨髓间充质干细胞在体外条件下经5-氮胞苷诱导后可分化为心肌样细胞。     

5-氮胞苷体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化:超顺磁性氧化铁颗粒的标记

背景:骨髓间充质干细胞体外经多种诱导剂均可成功转化为心肌样细胞,目前国内外报道中普遍采用的诱导剂为5-氮胞苷。超顺磁性氧化铁颗粒直径小,可被干细胞吞噬,加上其顺磁性可被MRI探测到信号,因而成为目前广泛应用于活体检测干细胞移植的理想示踪剂。目的:与未经标记的干细胞相比,观察超顺磁性氧化铁颗粒标记方式对干细胞体外经5-氮胞苷诱导向心肌样细胞分化效应的影响。方法:分离培养猪骨髓间充质干细胞,实验组采用P3代细胞经超顺磁性氧化铁颗粒标记,标记后细胞经5-氮胞苷体外诱导24h后继续培养,对照组直接经5-氮胞苷诱导。2周后用抗结蛋白、肌球蛋白重链、心肌特异性肌钙蛋白I、连接蛋白43进行免疫细胞化学染色鉴定,经普鲁士蓝染色观察细胞内铁颗粒。结果与结论:5-氮胞苷诱导分化后细胞表达抗结蛋白、肌球蛋白重链、心肌特异性肌钙蛋白I和连接蛋白43,且超顺磁性氧化铁颗粒标记诱导细胞内普鲁士蓝染色呈阳性。提示超顺磁性氧化铁颗粒标记骨髓间充质干细胞经5-氮胞苷体外诱导后可以分化为心肌样细胞。     

骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的体外诱导实验

目的:研究大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)经5-氮杂胞苷诱导在体外分化为心肌样细胞的情况,为心衰的干细胞移植治疗提供实验依据。方法:分离培养大鼠MSCs,用不同浓度5-氮杂胞苷诱导不同时间,用形态学、PAS反应、免疫细胞化学等鉴定。结果:诱导细胞以梭形、柱状为主,部分细胞有分支,单核,核卵圆形、居中,类似心肌细胞形态;PAS反应阳性;诱导培养2周,Sarcomeric actin和Connexin-43表达较弱,以后逐渐增强。以10-5mol/L5-氮杂胞苷诱导24h效果最佳。结论:MSCs在5-氮杂胞苷诱导下可定向分化为心肌样细胞,可望成为自体心肌细胞的一种良好供体来源。     

兔骨髓间充质干细胞体外向心肌样细胞诱导分化:缝隙连接蛋白43的表达变化

背景:骨髓间充质干细胞经过诱导因素刺激后,能够分化为心肌细胞,同时表达缝隙连接蛋白43,移植后可改善心功能或修复受损的心脏起搏传导系统。而缝隙连接蛋白43在维持心脏正常功能中发挥着重要作用。目的:观察兔骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌样细胞过程中缝隙连接蛋白43的表达变化,及诱导后骨髓间充质干细胞间隙连接通讯功能的改变。方法:采用Percoll非密度梯度离心法与贴壁法分离培养兔骨髓间充质干细胞,正常组不进行任何干预,诱导组加入5-氮胞苷向心肌样细胞诱导,免疫荧光及流式细胞仪检验细胞诱导前后缝隙连接蛋白43的表达。将原代培养1d的乳鼠心肌细胞分别接种于上述两组细胞爬片上,免疫荧光观察兔骨髓间充质干细胞与心肌细胞形成间隙连接的情况。划痕试验设立正常组、诱导组以及添加甘草次酸的阻滞剂组,观察兔骨髓间充质干细胞诱导前后细胞间隙连接的功能变化。结果与结论:正常组骨髓间充质干细胞缝隙连接蛋白43呈弱表达,5-氮胞苷诱导2,4周后缝隙连接蛋白43的表达均显著增加(P0.01),细胞间隙连接通讯功能明显增强(P0.001),且随诱导时间的延长呈依赖性增强(P0.05)。骨髓间充质干细胞与心肌细胞共培养后,诱导组缝隙连接蛋白43明显呈线状表达在两个相邻细胞的接触面。与诱导4周时比较,阻滞剂组细胞间隙连接通讯功能明显受到抑制(P0.001)。提示骨髓间充质干细胞能够自发表达缝隙连接蛋白43,在移植后早期能与心肌细胞形成间隙连接,从而有利于移植后心肌电传导,并发挥骨髓间充质干细胞的旁分泌效应。     

H9C2细胞培养液诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化

背景:文献报道间充质干细胞经体外化学药物诱导或自体移植体内诱导或模拟心肌样微环境体外诱导等方法可不同程度的诱导心肌细胞分化,但这些方法诱导率低、操作复杂、毒副作用大。目的:验证心肌细胞株H9C2细胞培养液对骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的诱导作用。方法:运用全骨髓贴壁筛选法分离培养大鼠间充质干细胞,制备H9C2细胞培养液作为诱导培养液,将间充质干细胞诱导培养1,3,5,7 d;以单独10%F12-DMEM培养液培养的H9C2细胞为阳性对照组;单独10%F12-DMEM培养液培养的间充质干细胞为阴性对照组。用免疫荧光法和western-blot检测其肌钙蛋白T、心肌细胞结蛋白的表达,用实时荧光定量检测其心肌细胞特征性基因α-肌球蛋白重链和β-肌球蛋白重链mRNA的表达。结果与结论:H9C2细胞培养液诱导间充质干细胞培养7 d,间充质干细胞增殖分化细胞中肌钙蛋白T阳性细胞达(16±7)%,显著高于对照组(P0.05);与阴性对照组比较,western-blot检测诱导培养间充质干细胞后分化细胞肌钙蛋白T表达明显上调(P0.05),结蛋白表达明显上调(P0.05);RT-PCR检测分化细胞α-肌球蛋白重链与β-肌球蛋白重链mRNA表达均上调(P0.05)。结果提示H9C2细胞培养液能诱导间充质干细胞向心肌样细胞分化。     

体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的实验研究

目的:采用5-氮胞苷(5-aza)诱导骨髓间充质干细胞(M SCs)为心肌样细胞,对比分析诱导细胞与正常心肌细胞表型的差异,从而分析5-aza的诱导效应。方法:分离培养大鼠骨髓M SCs,通过检测不同浓度的5-aza诱导后M SCs表面CD 45、CD 54、CD 90分子的表达并与正常心肌细胞表型进行比较,以观察5-aza对间充质干细胞体外分化诱导的影响和作用。结果:5-氮胞苷能有效地诱导间充质干细胞分化为心肌样细胞,诱导后的细胞表面均表达M H C和desm in分子。浓度为10μm ol/L的5-aza诱导组细胞表型更接近于心肌细胞。结论:M SCs在体外条件下经5-aza诱导可以分化为心肌样细胞,10μm ol/L的诱导浓度为最优浓度。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌样细胞

目的 采用骨髓间充质干细胞(MSCs)体外诱导为心肌样细胞,为干细胞移植治疗心衰提供一种新的细胞材料.方法 取SD大鼠四肢骨骨髓,分离培养MSCs,分别用终浓度为5、10、15、20 μmol/L的5-氮胞苷(5-aza)定向诱导,相差显微镜观察细胞形态学变化,应用免疫细胞化学、激光扫描共焦显微镜技术检测结蛋白(desmin),α-横纹肌肌动蛋白(α-sarcomeric actin)、心肌特异性肌钙蛋白(C-TnT)的表达,透射电镜鉴定.在诱导后7d、21 d和28 d,3个时间点以半定量RT-PCR方法检测细胞心肌早期转录因子GATA4和心肌特异性肌凝蛋白重链αMHC的表达.结果 MSCs体外经5-aza诱导后分化的细胞desmin、α-sarcomericactin、C-TnT均表达阳性,5 μmol/L组阳性表达较高,透射电镜下可见到平行排列的肌丝.RT-PCR结果显示,GATA4于诱导后7 d弱表达,21 d表达增强,28 d表达减弱.αMHC在诱导后7 d不表达,21 d弱表达,28 d表达明显.结论 骨髓间充质干细胞能够在体外被诱导分化为心肌样细胞,是自体心肌细胞一种良好的供体来源.     

体外培养诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为肌样细胞的实验研究

目的:体外培养并诱导大鼠骨髓间质干细胞(MSCs)分化为肌样细胞。方法:采用常规技术对SD鼠MSCs进行体外培养传代、鉴定、诱导分化和免疫组化、透射电镜检测分析。结果:流式细胞仪检测, 细胞表达CD29和CD44, 不表达CD11b和CD45;经一定浓度5-氮杂胞苷和两性霉素B诱导分化后细胞desmin和myoglobin染色阳性;电镜观察肌样细胞胞浆靠胞膜缘可见无细胞器的条状肌丝区带。结论:传代贴壁生长的梭形细胞为MSCs。MSCs可能具有表达肌细胞的特异性启动或分化调控基因;5-氮胞苷等化合物可使DNA的胞嘧啶去甲基化, 从而诱导MSCs向肌源性细胞分化。临床有运用MSCs治疗肌萎缩性疾病的前景。     

骨髓间质干细胞体外转分化为肌细胞的实验研究

研究骨髓间充质干细胞在体外诱导分化为肌源性细胞的可行性。由新西兰大白兔胸骨获取骨髓间充质干细胞，纯化培养后用不同浓度的5氮杂胞苷(5-azacytidine)诱导，用透射电镜、免疫组化、动作电位、cTnI(肌钙蛋白)检测、Ach(乙酰胆碱)刺激后的反应等鉴定诱导后细胞。结果显示经5-氮杂胞苷诱导后的骨髓间充质干细胞在透射电镜下可以观察到细胞内有明显的肌丝，免疫组化可见细胞被抗肌红蛋白抗体着染显色，电生理检查表明诱导后细胞是可兴奋细胞，可检测到cTnI，Ach刺激后细胞表现为舒张反应。我们认为骨髓间充质干细胞可在体外经5-氮杂胞苷诱导后转分化为肌源性细胞。     

大鼠骨髓间质干细胞诱导分化为心肌样细胞膜电流的研究

目的： 研究大鼠骨髓间质干细胞（MSCs）诱导分化为心肌样细胞膜电流的状态。方法： 按文献方法进行MSCs的诱导培养和鉴定。诱导后培养4周，用全细胞膜片钳技术，检测胞膜电流，并与未经诱导分化的MSCs进行比较。结果： 未经诱导分化的MSCs不表达内向电流，只表达外向钾电流。MSCs经5-aza诱导后表达心肌特异性肌钙蛋白T，记录到2种膜内向电流，分别为钠电流（I_Na）和L-型钙电流（I_Ca），以及3种外向钾电流，包括瞬间外向钾电流（I_to），超快速激活延迟整流钾电流（I_kur）及缓慢激活延迟整流钾电流（I_ks）。与未经诱导分化的MSCs相比，诱导后MSCs的钾电流以I_kur和I_ks为主。结论： 经5-aza诱导后，MSCs可分化成具有电压依赖性内向I_Na、I_Ca和外向I_to、I_kur、I_ks的心肌样细胞。     

小鼠胎肝间质干细胞体外向肌样细胞分化的研究

目的：了解小鼠胎肝间质干细胞在体外向肌样细胞分化的潜能。 方法： 无菌条件下从正常C57BL/6J胎鼠肝脏中分离出间质干细胞，体外培养传3代后用5-氮胞苷和二性霉素B诱导分化，观察胎肝间质干细胞诱导前后形态变化；用RT-PCR检测细胞诱导前后, 成肌调控基因Myf5和成肌素myogenin的表达情况；诱导后7 d和 14 d 行免疫细胞化学染色鉴定诱导后细胞结蛋白和α-肌动蛋白的表达。 结果： RT-PCR显示诱导后6 h至72 h成肌调控基因Myf5和myogenin序贯表达，而诱导前的细胞则没有检测到表达；免疫细胞化学染色提示第7 d细胞结蛋白和α-肌动蛋白表达阳性，第14 d阳性率明显升高。 结论： 胎肝中分离出的间质干细胞在体外可以定向诱导分化为肌样细胞。     

兔骨髓间充质干细胞来源的心肌(样)细胞的诱导分化研究

目的体外诱导骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)向肌源性细胞分化,探索诱导后的MSCs移植于心肌梗死区的存活和分化情况。方法提取、分离、培养兔的MSCs。经5-氮胞苷诱导后,进行免疫组化,电镜观察。4',6二乙酞基-2-苯基吲哚(DAPI)标记MSCs,建立兔心肌梗死模型。实验动物随机分两组:实验组(n=10)在心梗区域注入经诱导后的MSCs;对照组(n=10)在心梗区域注入不含MSCs的培养液。移植4周后,进行病理标本观察和免疫组化检测。结果5-氮胞苷诱导MSCs4周,部分细胞表达肌钙蛋白T(troponin T),电镜观察到肌丝形成。MSCs在体外用DAPI标记,用荧光显微镜观察细胞发蓝色荧光。移植4周后,在实验组中用荧光显微镜观察可见梗死区组织标本中可见DAPI标记带蓝色荧光的供体细胞核,移植细胞表达troponin T。结论MSCs经5-氮胞苷诱导后可向心肌细胞转化。移植细胞可在心肌存活,并向心肌细胞(样)转化。     

骨髓间质干细胞体外诱导分化为心肌样细胞的实验研究

目的：体外培养并诱导大鼠骨髓间质干细胞（MSCs）分化为心肌细胞。 方法： 采用密度梯度离心法和贴壁培养法分离、纯化大鼠骨髓MSCs，在第3代细胞以5-氮杂胞苷进行诱导，用免疫细胞化学和RT-PCR方法对诱导细胞进行鉴定。 结果： 诱导后细胞体积较诱导前增大，而且更加细长，呈长梭形。14 d后细胞之间出现连接，排列方向渐趋一致。免疫细胞化学染色显示诱导后部分细胞结蛋白(desmin)、横纹肌肌动蛋白(α-sarcomeric actin)和心肌特异性肌钙蛋白(troponin I)呈阳性反应。RT-PCR结果表明诱导细胞有心肌β肌球蛋白重链表达。 结论： 5-氮杂胞苷能在体外诱导MSCs向心肌细胞分化。     

骨髓间质干细胞诱导为肌样细胞分化相关基因的表达

目的：研究骨髓间质干细胞向肌样细胞分化前后骨骼肌特异性基因的表达。方法:体外分离成年SD大鼠骨髓干细胞，培养增殖，用5-氮杂胞苷诱导分化，RT-PCR检测分化前和分化后1 d、2 d、5 d和7 d骨骼肌特异性转录因子生肌决定因子MyoD、肌细胞生成素myogenin、MRF4以及肌肉特异性肌酸磷酸激酶MCK的表达 。结果:MyoD在诱导前后均有表达，在诱导后1 d表达显著上调（P＜0.05）；myogenin、MRF4和MCK在诱导前无表达，诱导后2 d开始出现myogenin和MRF4的表达，诱导后7 d开始出现MCK的表达。结论：骨髓间质干细胞能表达一定水平的骨骼肌细胞的分化调控基因MyoD，它向肌样细胞的分化可能与MyoD、myogenin和MRF4有关。