恙虫病东方体Karp株56kDa与47kDa外膜蛋白基因的嵌合和嵌合基因在大肠杆菌的表达

目的　将恙虫病东方体 (Orientiatsutsugamushi,Ot)Karp株的 5 6kDa和 4 7kDa外膜蛋白基因嵌合 ,并使嵌合基因在大肠杆菌细胞内表达 ,产生双抗原融合蛋白。方法　采用PCR方法 ,从OtKarp株基因组DNA中扩增 5 6kDa蛋白基因片段 ,将该片段分别与原核表达载体pQE30及 4 7kD蛋白基因重组质粒 pQE30 / 4 7连接 ,构建 pQE30 / 5 6及pQE30 / 5 6 - 4 7重组质粒 ;用IPTG诱导转入大肠杆菌内的重组质粒的目的基因表达。结果　SDS -PAGE显示 ,pQE30 / 5 6转化的大肠杆菌产生一约 4 5kDa的融合蛋白和 pQE30 / 5 6 - 4 7转化大肠杆菌产生一约 90kDa融合蛋白 (5 6 - 4 7融合蛋白 ) ,免疫印迹分析显示两融合蛋白均与OtKarp株感染鼠血清产生特异性反应 ,5 6 - 4 7融合蛋白分别与 4 7kDa、5 6kDa重组蛋白免疫的小鼠血清产生特异性反应 ,以及 5 6 - 4 7融合蛋白免疫血清与 5 6kDa和 4 7kDa重组蛋白反应。结论　OtKarp株的 5 6kDa与 4 7kDa外膜蛋白基因嵌合后在大肠杆菌细胞内实现了表达 ,表达的融合蛋白具有 5 6kDa和 4 7kDa外膜蛋白的抗原特性。     

幽门螺杆菌47kDa微孔蛋白基因的克隆表达及特性鉴定

目的对人幽门螺杆菌(H.pylori)编码47kDa外膜微孔蛋白基因omp47克隆表达及特性鉴定,探索研制H.pylori疫苗的新途径。方法培养和收集H.pylori标准菌株NTTC11637及临床菌株,采用酚∶氯仿抽提、纯化基因组DNA。设计上下游引物,并以该基因组为模板,采用聚合酶链反应(PCR)扩增omp47基因片断。将目的基因和与克隆载体PGEM-T连接后,转化至E.coli DH5α及BL21,碱裂解提取质粒经BamHI和XhoI双酶切鉴定并进行序列分析。重组蛋白采用IPTG诱导表达后,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)鉴定、镍亲和层析纯化检测抗原活性。结果经酶切、测序分析表明,插入的基因片断为1284bp,编码427个氨基酸。与GenBank公布的H.pylori标准株26695、43504及J99序列比对,核苷酸同源性高达94%~96%,编码氨基酸同源性96%~99%。经SDS-PAGE检测,电泳图谱上显示一条相对分子量为47kda的新生蛋白带。Western blot检测表明重组蛋白有较好的抗原性。结论成功克隆了外膜微孔蛋白OMP47的编码基因,为H.pylori疫苗的研制和试剂盒的开发奠定了良好的基础。     

恙虫病东方体47kDa蛋白基因部分片段的克隆与表达

目的　表达恙虫病东方体 (Orientiatsutsugamushi,Ot) 4 7kDa保护性抗原蛋白。 方法　采用PCR方法 ,从OtKarp株基因组DNA中扩增出 4 7kDa蛋白基因片段 ,鉴定后将该片段克隆于原核表达载体 pBV2 2 0 ,构建成重组质粒pBV -4 7。用该重组质粒转化E coli,转化子在 4 2℃诱导表达并对其鉴定。结果　 (1)获得长约 14 30bp的PCR片段 ,序列分析结果与已知 4 7kDa基因序列相同 ;(2 )SDS -PAGE检测表达产物 ,在相对分子量 4 0× 10 3 处有表达带 ;(3)经薄层扫描分析 ,目的蛋白占全菌蛋白的 19% ;(4)免疫印迹实验证明其具有免疫反应性。结论　获得了 4 7kDa基因片段 ,并在大肠杆菌中实现了表达 ,表达产物具有免疫反应性。     

疱疹病毒UL47基因及其编码蛋白研究进展

疱疹病毒是一类双链DNA病毒,包括人巨细胞病毒、牛疱疹病毒Ⅰ型、伪狂犬病毒、单纯疱疹病毒、禽传染性喉气管炎病毒、马立克氏病病毒等,可感染人和多种动物。根据病毒的理化性质,疱疹病毒科可分为α、β、γ三个亚科。疱疹病毒主要由核心、衣壳、皮层、囊膜四部分组成。疱疹病毒的皮层最初被认为是病毒囊膜和衣壳之间的一个无定形区域,该区包含五种主要的结构蛋白,     

查菲埃立克体120kDa抗原蛋白基因的克隆与表达

目的 克隆查菲埃立克体120kDa膜表面免疫决定性蛋白基因,并使之在原核表达系统中表达。方法 查菲埃立克体分离株（91HE17）感染DH82细胞40天后收集DH82细胞。根据查菲埃立克体P120蛋白基因序列设计特异性引物,套式PCR扩增查菲埃立允体P120蛋白基因部分片段,将PCR扩增产物用BamHⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶双酶切后与pUC18载体连接,在获得阳性克隆子后用限制性内切酶将克隆片段切下,定向手稿原核表达载体pProEX HTb构建pProEX HTb/P120重组质粒。将重组质粒转化E.coli DH5α,并使之在IPTG的诱导下进行蛋白质表达。结果 裁短成1080bp的查菲埃立克体P120蛋白基因克隆到pUC18载体,用IPTG诱导pProEX HTb/P120重组质粒转化的E.coli DH5α,表达一分子量大小约为47kDa的融合蛋白。结论 查菲埃立克体120kDa抗原蛋白基因能在原核表达系统中表达,为诊断试剂盒的研制及其它研究工作提供了基础。     

贝氏柯克斯体27kDa外膜蛋白基因的克隆与表达

目的　克隆和表达贝氏柯克斯体 (Coxiellaburnetii) 2 7kDa外膜蛋白基因 (com1 )。方法　采用PCR方法 ,从质粒pGEM -T/com1扩增出Com1基因片段 ,经鉴定后 ,将其克隆于原核表达载体 pQE30 ,构建成重组质粒 pQE30 /com1 ,IPTG诱导表达。结果　 (1 )获得长约 760bp的PCR片段 ,序列分析结果与已知com1序列相同。 (2 )SDS -PAGE检测表达产物 ,在相对分子量 2 7kDa处有表达条带。经薄层扫描分析 ,目的蛋白条带占全菌体蛋白的 1 7 2 %。 (3)经分析 ,有较好的抗原性。 (4)表达菌体超声破碎后 ,目的蛋白主要存在于包涵体中。结论　贝氏柯克斯体com1基因在大肠杆菌中获得了高效表达 ,所表达的重组蛋白能与Q热抗体发生反应     

恙虫病东方体Gilliam株56kDa外膜蛋白基因的克隆与表达

目的　表达恙虫病东方体 (Orientiatsutsugamushi)Gilliam株 5 6kDa外膜蛋白 ,探索其作为诊断抗原的可能性。方法　采用PCR方法 ,从Ot Gilliam株菌种基因组DNA中扩增出 5 6kDa外膜蛋白基因片段 ,将目的基因片段定向插入原核表达载体pQE30 ,再用重组质粒转化大肠杆菌 ,最后用IPTG诱导转化菌 ,SDS -PAGE和Western -blotting检测重组质粒目的基因的表达。结果　 (1)获得长约 15 0 0bp的Ot Gilliam株 5 6kDa外膜蛋白基因 ,SDS -PAGE检测表达产物 ,在相对分子量5 6× 10 4处有表达带 ;(2 )DNA测序证明重组质粒 pQE30 / 5 6中插入的基因片段的序列与已报告的Ot Gilliam株 5 6kDa外膜蛋白基因序列基本一致。 (3)诱导表达菌体经超声破碎后 ,显示目的蛋白主要以包涵体形式存在 ;(4 )免疫印迹显示该重组质粒转化的大肠杆菌有一相对分子量约为 5 6× 10 4的独特蛋白带 ,该蛋白约占细菌蛋白总量的 2 9 4 %。结论　Ot Gilliam株5 6kDa外膜蛋白基因在大肠杆菌中获得了高效表达 ,表达的重组蛋白具有免疫反应性 ,与Ot Gilliam株感染的小鼠血清在免疫印迹中呈阳性反应。     

日本血吸虫26 kDa基因重组蛋白免疫小鼠抗体内血吸虫生殖的作用

目的：探讨日本血吸虫２６ｋＤａ基因重组蛋白（ｒＳｊｃ２６ＧＳＴ）抗日本血吸虫生殖作用及其免疫机制。方法：小鼠经ｒＳｊｃ２６ＧＳＴ免疫,攻击感染日本血吸虫尾蚴４０±１条,于６ｗｋ后解剖检虫体,计算虫数与肝组织和脾组织内的虫卵数,并对虫体主要生殖器官作透射电镜超微结构的观察。结果：证明ｒＳｊｃ２６ＧＳＴ具有明确的抗生殖免疫作用。与对照组相比,免疫鼠减虫率为３０．０％,肝组织和脾组织内虫卵减少率分别为５７．１％与７９．９％,透射电镜观察显示免疫鼠体内雌虫的卵黄腺及雄虫的睾丸组织均产生不同程度的抑制作用,主要表现为卵黄细胞胞质中卵黄球、卵黄滴、脂滴和睾丸组织中精细胞、支持细胞胞质中的脂滴数量均有明显减少。结论：ｒＳｊｃ２６ＧＳＴ有抗日本血吸虫生殖的作用,使虫体生殖器官受到损害     

抗旋毛虫肌肉期幼虫排泄分泌物中46-58kDa蛋白IgM和IgG抗体的研究

目的寻求简便、快速、可靠的方法,用于旋毛虫病的诊断及疗效考核。方法建立检测抗旋毛虫肌肉期幼虫排泄分泌物(TsL1-ES)中46-58kDa蛋白抗体的斑点金免疫渗滤试验(DIGFA),并对患者在治疗前和治疗后血清中特异抗体水平的动态变化进行研究。结果旋毛虫病患者治疗前血清中特异IgM和IgG抗体的检出率分别为94.83%(55/58)和91.38%(53/58);正常人血清(100份)、囊虫病(25份)、血吸虫病(20份)、肺吸虫病(20份)及蛔虫病(22份)病人血清均未检出该两类特异性抗体。52例两类抗体均阳性的旋毛虫病患者经有效药物治疗后3个月、6个月、1年、1.5年连续采血,经DIGFA检测连续观察的结果表明,IgM抗体出现较早,阴转较为明显和迅速,治疗后3月的阴转率达46.15%(24/52),1年的阴转率可达88.46%(46/52);而IgG抗体则出现较晚,阴转缓慢,治疗后1.5年的阴转率仅为23.08%(12/52)。结论DIGFA为检测抗TsL1-ES中46-58kDa蛋白抗体的有效方法,检测IgM抗体可用于诊断及疗效考核,而IgG抗体的检测不宜用来判断疗效。     

马鹿布氏杆菌25kDa外膜蛋白基因的克隆、序列分析及其表达研究

目的克隆马鹿布氏杆菌ML分离株25kDa外膜蛋白(Omp25)基因,并在大肠杆菌中表达。方法运用RT-PCR技术从马鹿布氏杆菌分离株中扩增出Omp25基因,将其克隆入pMD18-T中进行核苷酸序列测定和遗传变异分析,并将目的基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中诱导表达。结果该基因全长642bp,编码213个氨基酸;其中前23个氨基酸残基构成信号肽。在推导的氨基酸序列中,存在两个跨膜区,但没有潜在的N-联糖基化位点。与GenBank中已经登录的布氏杆菌其他11个分离株相比,马鹿布氏杆菌分离株Omp25基因变异较小,以散在的点突变为主,Omp25基因核苷酸和推导氨基酸序列的同源性分别为99.1%-99.4%和99.2%-99.5%之间。转化重组质粒pETOMP25的大肠杆菌BL21(DE3)在IPTG的诱导下,可表达出具有反应原性的目的蛋白,表达量占菌体蛋白的18.6%。结论马鹿布氏杆菌分离株与流产型布氏杆菌其它分离株Omp25基因同源性很高,可能是一个毒力较强的野毒株。     

血吸虫23kDa膜内在蛋白的研究现状

血吸虫的23kDa抗原是一种膜内在蛋白。宿主针对此抗原能产生可识别的特异性抗体;23kDa抗原可诱导宿主保护性免疫的产生,为有价值的诊断抗原及候选疫苗。本文对23kDa蛋白的合成情况、表达阶段、结构特点、免疫学及分子生物学特征等方面作一概述。     

血吸虫23kDa膜内在蛋白的研究现状

血吸虫的２３ｋＤａ抗原是一种膜内在蛋白。宿主针对此抗原能产生可识别的特异性抗体；２３ｋＤａ抗原可诱导宿主保护性免疫的产生，为有价值的诊断抗原及候选疫苗，本文对２３ｋＤａ蛋白的合成情况，表达阶段，结构特点，免疫学及分子生物学特征等方面作一概述。     

曼氏血吸虫尾蚴分泌物中47kDa蛋白酶的特征及纯化

曼氏血吸虫的尾蚴穿过易感哺乳动物的皮肤,并在皮下移行的过程与诸多溶蛋白酶有关。现已从曼氏血吸虫尾蚴纯化出两种蛋白酶,上述尾蚴酶对合成底物或天然底物的不同特异性表明存在着数种尾蚴蛋白酶而非同一酶的不同形式。本文报告尾蚴分泌物中47kDa蛋白酶的特征及纯化。     

恙虫病东方体Gilliam株56kDa蛋白部分基因的原核表达及初步鉴定

目的　对恙虫病东方体Gilliam株 5 6kDa蛋白部分基因进行原核表达 ,以获得高效表达、有生物活性目的蛋白 ,为恙虫病诊断试剂的研制打下基础。方法　根据Gilliam株东方体 5 6kDa蛋白基因序列设计特定引物 ,用PCR法扩增出编码5 6kDa抗原富含亲水区及同源性高的C端一段长约 70 0bp的DNA ,插入原核载体PGEX - 4T - 2 ,转化大肠杆菌TGI ,抽提质粒 ,酶切鉴定 ,含插入片段的重组质粒进行序列分析 ,再转化表达宿主菌大肠杆菌BL2 1(DE3) ,IPTG诱导表达 ,用SDS -PAGE及Western -blot进行分析鉴定。结果　SDS -PAGE检测表明该截短片段以融合蛋白的方式得到成功表达 ,在相对分子量 5 8kDa处有表达条带 ,经薄层扫描分析 ,目的蛋白条带占全菌蛋白的 30 5 %。Western -blot证实该融合蛋白能被恙虫病患者阳性血清识别。结论　表达产物初步鉴定具有生物活性 ,有望应用于恙虫病诊断试剂的研制     

热休克蛋白47与肺纤维化

热休克蛋白47（heat shock protein47．，HSP47）是一种胶原特异性分子伴侣，参与前胶原在内质网中的整个加工处理过程，在组织器官纤维化中起重要作用。在肺纤维化中HSP47和Ⅰ型前胶原显著表达，并且其表达量的不同可能与病因相关；TGF—B在肺纤维化中发挥着重要的作用，但其是通过诱导HSP47的表达发挥作用的；抑制HSP47的表达可以减轻肺纤维化的程度。因此HSP47有可能成为肺纤维化新的治疗靶点。     

伪旋毛虫21 kDa蛋白的分子克隆和特性

伪旋毛虫(Trichinella pseudospiralis)是广泛寄生于脊椎动物骨骼肌细胞的旋毛虫形线虫属的一种。幼虫寄生时无包囊形成,且病理损害涉及到肌细胞的全长。幼虫的排泄、分泌物(ES)是引起肌细胞变性的原因之一。目前对伪旋毛虫幼虫ES的抗原成份了解尚少,为此作者用ES免疫血清从伪旋毛虫幼虫cDNA文库中筛选出一重组蛋白,并对其免疫学特性进行了鉴定。 收集伪旋毛虫幼虫的ES并制备幼虫的     

日本血吸虫热休克蛋白40 kDa免疫学功能研究

目的探索日本血吸虫热休克蛋白40 k Da(Sj HSP40)免疫学功能。方法采用生物信息学方法分析Sj HSP40蛋白序列同源性,并预测其B细胞及T细胞表位。应用PCR技术扩增全长Sj HSP40基因,将其克隆入原核表达质粒p GEX-6P-1,再转入大肠埃希菌BL21中;以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,再经亲和柱分离纯化获得谷胱甘肽巯基转移酶(GST)-Sj HSP40融合蛋白,分别采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及Western blotting进行鉴定。以GST-Sj HSP40免疫BALB/c小鼠后,以酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠血清中抗Sj HSP40特异性Ig G抗体及其亚型Ig G1、Ig G2a抗体,采用流式检测术观察Sj HSP40对CD4+T细胞亚群分化的影响。结果 Sj HSP40含有7个潜在B细胞表位及多个T细胞表位(CTL表位和Th表位)。成功构建了原核表达重组质粒p GEX-6P-1-Sj HSP40,并通过诱导表达和蛋白纯化获得GST-Sj HSP40融合蛋白。与其他组相比,GST-Sj HSP40免疫小鼠血清中抗Sj HSP40特异性Ig G抗体及其亚型Ig G1和Ig G2a水平均显著升高,但Sj HSP40对CD4+T淋巴细胞分化无显著影响。结论 Sj HSP40可诱导小鼠产生特异性体液免疫应答,但不影响小鼠体内各类Th免疫反应平衡,可作为潜在疫苗候选分子。