达英-35预防环磷酰胺对大鼠卵巢功能损伤的实验研究

目的:研究口服避孕药达英-35在雌性大鼠中减轻环磷酰胺(CTX)诱导的性腺毒性的效果。方法:随机将75只雌性Wistar大鼠分为5组:空白对照组、CTX组、达英-35组、联合治疗Ⅰ组和联合治疗Ⅱ组。用放射免疫法测定各组雌二醇(E2)和卵泡刺激素(FSH)水平,并于停药当天、第15天、30天,处死各组1/3的大鼠,比较卵巢重量、卵泡数量变化。结果:停药第30天,CTX组大鼠E2为(21.88±2.10)pg/ml,明显低于两个联合治疗组,FSH为(7.05±0.18)mIU/ml,明显高于两个联合治疗组,差异均有统计学意义(P0.05);CTX组卵巢重量和卵泡总数分别为(32.40±5.55)mg和308±32个,明显低于两个联合治疗组,差异有统计学意义(P0.05);联合治疗Ⅰ、Ⅱ组的E2、FSH、卵巢重量、卵泡数量分别比较,差异无统计学意义(P0.05)。结论:达英-35降低了CTX对大鼠卵巢功能的损伤,对卵巢功能的保护和恢复起到了一定的作用。     

顺铂诱导化疗损伤性卵巢早衰大鼠模型的探讨

目的:探讨顺铂诱导大鼠化疗损伤性卵巢功能早衰大鼠模型的可行性。方法:成熟雌性SD大鼠腹腔注射低、高剂量顺铂4.5 mg/kg(A组)、6.0 mg/kg(B组)和生理盐水(C组),每周1次,共2次,建立大鼠化疗损伤性卵巢早衰模型。检测血清FSH水平及光学显微镜下计数卵巢最大切面原始卵泡、初级卵泡、闭锁卵泡,阴道涂片观察动情周期变化。结果:A、B组大鼠动情周期均明显长于C组(P<0.05),并呈现剂量相关性改变。B组动情周期天数明显长于注射前(P<0.01);血清FSH水平A组与C组相比无统计学意义(P>0.05),B组明显高于A组和C组(P<0.05)。各顺铂组血清FSH水平注射后均较注射前明显升高(P<0.05)。腹腔注射顺铂后,A组、B组大鼠卵巢最大切面原始卵泡数和初级卵泡数均明显降低(P>0.05),而闭锁卵泡数均明显增加(P<0.05),并呈现剂量相关性改变。结论:顺铂可诱导化疗损伤性卵巢早衰。此化疗损伤性卵巢早衰大鼠模型血FSH明显升高,卵巢组织学衰退性改变与人类化疗损伤性卵巢早衰病变过程相似。     

骨髓间充质干细胞对顺铂所致的大鼠窦前卵泡损伤的保护作用

目的:观察大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)对顺铂(DDP)所致的体外培养大鼠窦前卵泡损伤的保护作用。方法:实验分为3组,每组为30个窦前卵泡。实验组:取第3代MSCs,贴壁生长后,将大鼠窦前卵泡移入培养板内共培养24小时后换液,加入1μg/ml DDP,作用24小时后换新鲜基础培养液;实验对照组:未行MSCs共培养,直接将大鼠窦前卵泡移入培养液中培养,后面方法同实验组;空白对照组:大鼠窦前卵泡移入培养液中培养,不加入DDP。光镜下观察3组窦前卵泡的形态学变化,采用化学发光法分别检测加药后第3、5、7天各组培养液中雌二醇(E2)的浓度。结果:1实验组窦前卵泡第3、5天均存活,第7天仅少数窦前卵泡变黑,但卵母细胞清晰可见;实验对照组窦前卵泡第3天出现退化现象,第7天则完全退化;空白对照组窦前卵泡第3天形态尚规整,但第7天大多数卵泡出现退化现象。2实验组中E2含量随着时间的变化逐渐升高(P0.05);空白对照组E2含量随着时间的变化逐渐下降(P0.05);实验对照组E2含量最低,变化不大,3个时间点比较,差异无统计学意义(P0.05)。3组间大鼠窦前卵泡培养液中E2含量间有主效应(P0.05),时间和组别之间存在交互效应(P0.05)。结论:MSCs对DDP引起的窦前卵泡的损伤可能有保护作用,可恢复并促进窦前卵泡的内分泌功能。     

GnRHa和避孕药保护化疗所致卵巢损伤的比较研究

目的:探讨促性腺激素释放激素激动剂(GnRHa)和口服避孕药(OC,达英-35)对注射环磷酰胺(CTX)大鼠卵巢功能的保护作用。方法:实验分为6组:空白对照组、CTX组、OC组、GnRHa组、OC保护组、GnRHa保护组,每组15只,分别接受生理盐水、CTX、达英-35、GnRHa、达英-35+CTX、GnRHa+CTX注射或灌胃。阴道涂片观察大鼠动情周期,以放射免疫法检测血清雌二醇(E2)和卵泡刺激素(FSH)浓度,每组在停药当天、15天及30天分别处死5只大鼠,观察卵巢重量、卵巢结构及各级卵泡数目。结果:停药后30天,OC保护组和GnRHa保护组的E2浓度分别为51.33±2.00pg/ml、44.38±5.98pg/ml,FSH浓度分别为3.69±0.28mIU/ml、3.35±0.22mIU/ml,两组比较及与空白对照组(51.76±2.57pg/ml、3.44±0.20mIU/ml)相比,差异均无统计学意义;与CTX组(21.78±2.11pg/ml、6.24±0.22mIU/ml)比较,差异有统计学意义。OC保护组和GnRHa保护组的卵巢重量、卵泡数量与空白对照组相比,差异无统计学意义,明显高于CTX组,两组间比较差异亦无统计学意义。结论:GnRHa和口服避孕药均能减轻化疗药物对卵巢功能的损伤,从而保护卵巢储备功能。     

miR-21调控PTEN及PDCD4基因治疗化疗性卵巢早衰

目的:探讨miR-21在化疗性卵巢早衰大鼠模型中的治疗潜能及其可能机制。方法:体外构建miR-21慢病毒载体(LV-miR-21)。将大鼠随机分为空白对照组、模型组、空载组及miR-21组,通过腹腔注射环磷酰胺(CTX)建立化疗所致卵巢早衰大鼠模型。建模后往miR-21组大鼠双侧卵巢注射LV-miR-21,注射后第1、15、30、45、60天分批处死大鼠。阴道脱落细胞涂片检测大鼠动情周期;化学发光法与免疫放射法测定性激素水平;进行卵巢称重、计数各级卵泡数;TUNEL法测定卵巢组织颗粒细胞凋亡率;qRT-PCR、Western blot法检测miR-21靶基因PTEN、PDCD的mRNA及蛋白水平。结果:体外成功构建miR-21慢病毒载体。实验结束时,miR-21组有64%(16/25)大鼠恢复规律动情周期。注射后第15、30、45、60天,miR-21组的E_2水平、卵巢颗粒细胞凋亡率均高于模型组和空载组(P=0.000),FSH水平以及PTEN、PDCD4的mRNA、蛋白表达较相应时间点的模型组和空载组显著下降(P=0.000)。注射后第30、45、60天,miR-21组的卵巢重量显著高于模型组和空载组,但仍低于空白对照组;注射后第45、60天,miR-21组各级卵泡数均多于模型组和空载组(P=0.000);结论:miR-21在化疗诱导卵巢早衰大鼠模型中具有治疗潜能,其具体作用机制可能与下调靶基因PTEN、PDCD4有关。     

人胎盘间充质干细胞移植通过降低超氧化物歧化酶1和解耦联蛋白-2的表达提高卵巢功能

目的探讨人胎盘间充质干细胞(h PMSC)移植治疗对环磷酰胺所致卵巢早衰(POF)模型SD大鼠超氧化物歧化酶1(SOD1)和解耦联蛋白-2(UCP-2)表达的影响。方法将60只雌性SD大鼠随机分为4组(n=15):空白对照组,POF模型组,治疗对照组,h PMSC移植组。以首计量50 mg/kg、维持剂量8 mg/kg连续14 d给大鼠腹腔注射环磷酰胺溶液建立POF模型,观察大鼠动情周期变化,采用ELISA方法测定血清中雌二醇(E2)、促卵泡生成素(FSH)、抗苗勒氏管激素(AMH)、活性氧族(ROS)、8-羟基脱氧鸟苷(8-OHd G)水平;HE染色方法检测卵巢组织形态学及卵泡计数,VG染色法观察卵巢组织纤维化情况;采用免疫组织化学和Western blotting法测定SOD1和UCP-2蛋白表达。结果 ELISA结果显示:模型组血清FSH水平[(10.60±1.0)IU/L]明显高于空白对照组[(5.83±0.92)IU/L](P0.01),而E2、AMH水平[(35.52±10.27)ng/L、(2 090.6±397.5)ng/L]则明显低于空白对照组[(65.62±3.76)ng/L、(3 636.39±204.46)ng/L],差异有统计学意义(P0.01)。与空白对照组相比h PMSC移植组血清中ROS和8-OHd G升高(P0.05)。卵泡计数显示h MSC移植组闭锁卵泡数(5.36±1.11)显著低于治疗对照组(8.01±2.22)和POF模型组(11.21±1.69)(P0.05)。与治疗对照组相比,h PMSC移植组中ROS和8-OHdG显著下降(P0.05)。VG染色显示,与治疗对照组比,hP MSC移植组纤维化面积比例显著降低(P0.05)。Western blotting结果显示,与治疗对照组相比,hP MSC移植组中SOD1和UCP-2蛋白表达量显著下降(P0.05),而hP MSC移植组与对照组则差异无统计学意义(P0.05);免疫组织化学结果显示模型组中SOD1和UCP-2蛋白表达相较于治疗对照组是降低的,而hP MSC移植组相较于空白对照组则差异无统计学意义。结论 hP MSC移植改善POF模型SD大鼠氧化应激,降低SOD1及UCP-2表达,起到保护卵巢线粒体功能的作用。     

米非司酮诱导大鼠PCOS动物模型的实验研究

目的:建立抗孕激素米非司酮诱导成年雌性SD大鼠多囊卵巢综合征(P-COS)动物模型,并探讨其意义。方法:选择4～5天规律动情周期的成年雌性SD大鼠,于动情周期第一天皮下注射米非司酮并阴道涂片监测动情周期,8天后称重大鼠,取出卵巢,称重并观察大体解剖及光镜(HE)改变,测定血清LH、T、FSH、E2水平。结果:(1)用药后第4天动情周期开始失去规律性,阴道上皮呈持续角化,提示无排卵。(2)大鼠体重及卵巢单位重量明显增加(P<0.01)。(3)肉眼观察:大鼠卵巢表面的卵泡明显扩张,卵巢色泽及白膜厚度未见明显异常。镜下观察:大鼠卵巢白膜下见多个呈囊性扩张的卵泡及闭锁卵泡,颗粒细胞层减少至2～3层,卵泡内卵母细胞或放射冠消失,黄体数量明显下降并伴有不完全的黄素化。(4)血清LH、T、E2显著升高(P<0.01),FSH浓度降低,但差异无统计学意义(P=0.094)。结论:米非司酮诱导的成年雌性大鼠PCOS模型在内分泌和卵巢形态学的改变与PCOS患者相似,是较理想的PCOS模型。     

促性腺激素释放激素类似物预防化疗对大鼠卵巢损伤作用的研究

目的:探讨促性腺激素释放激素(GnRHa)在减轻化疗所致的大鼠卵巢功能损害的作用。方法:选用2-3月龄Wister雌性大鼠40只,随机分为正常对照组、环磷酰胺(CTX)组、GnRHa组、CTX+GnRHa组。用药后比较4组大鼠卵巢、子宫湿重和形态学变化,并采用放射免疫方法测定4组大鼠FSH、E2。结果:光镜下可见GnRHa能明显改善CTX对卵巢、子宫的损害;CTX组与正常对照组比较FSH升高、E2水平明显降低(P<0.01),子宫和卵巢重量减轻(P<0.01)。CTX使各期卵泡总数显著减少,GnRHa使生长卵泡数、成熟卵泡数减少,而初级卵泡数增加,且总卵泡数增加。CTX+GnRHa组保存了大部分初级卵泡,总卵泡数增加。结论:GnRHa的先期应用对预防化疗所致的大鼠卵巢损伤有一定的保护作用。     

饱和氢盐水对化疗致卵巢损伤的保护作用

目的:研究饱和氢盐水对环磷酰胺(CTX)所致大鼠卵巢损伤的影响。方法:将54只雌性SD大鼠随机分为3组:A组为正常对照组,B组为CTX组,C组为CTX+饱和氢盐水组。腹腔注射CTX复制化疗所致卵巢损伤模型,首日负荷量为50 mg/kg,后以每日8 mg/kg的维持量持续14 d。饱和氢盐水处理为首次给予CTX开始每日早晚8点2次腹腔注射饱和氢盐水10 ml/kg,持续14 d。于停药后第1日(即15 d)、第16日(即30 d)和第31日(即45 d)分批处死大鼠,留取卵巢固定,HE染色观察卵巢病理;外周血离心取血清,检测卵泡刺激素(FSH)、雌二醇(E2)、超氧化物岐化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)的变化情况。结果:血清FSH和E2的检测结果显示:B组动物血清FSH表达高于A组,E2低于A组,差异有统计学意义(P<0.05);而C组动物血清FSH显著低于B组、E2高于B组(P<0.05)。病理切片显示:B组动物卵巢内卵泡丢失、闭锁,卵巢间质严重损害,可见血管壁增厚,呈玻璃样变,局部可见纤维化;C组可见卵巢皮质、髓质结构清晰,各级卵泡丰富。血清SOD、CAT和MDA的检测结果显示:与A组相比,B组动物血清SOD、CAT水平降低,MDA升高(P<0.05);而与B组相比,C组动物血清SOD和CAT含量增加,MDA降低(P<0.05)。结论:饱和氢盐水可有效防止化疗药物诱发的卵巢损伤,可能与调节体内氧化与抗氧化平衡有关。     

3种玻璃化液对新生鼠卵巢的渗透反应及冻存效果的比较

目的:探索适宜新生鼠卵巢保存的玻璃化液和冷冻方案。方法:观察新生SD大鼠卵巢在预平衡液及3种玻璃化液中不同时间段的表面积变化,冻融后进行组织学观察和成年SD大鼠肾被膜下异体移植后在体活力分析。结果:新生鼠卵巢在预平衡液中出现渗透性脱水变化,移入EFS40(A组)、EG5.5(B组)、EG5.5/30(C组)3种玻璃化液中,再次剧烈皱缩。3min后,卵巢表面积分别为等渗液对照组表面积的63.2%、82.4%、70.8%。此脱水状态的卵巢玻璃化冻融后形态完整的卵泡百分率均与新鲜移植组(D组)无显著性差异(P>0.05);异体移植后,动情周期出现率和动情周期出现时间均与D组无显著性差异(P>0.05)。各冷冻移植组存活移植物均可见不同发育阶段的各级卵泡,但卵泡数目少于D组,移植20d时A组与D组间有显著性差异(P<0.05);移植60d时B组卵泡数少于D组,组间有差异(P<0.05);C组在各时间点上取材的卵泡数与D组均无差异(P>0.05)。结论:在预平衡液中15min、改良的EG5.5/30液中3min的二步渗透平衡法适宜新生鼠卵巢的玻璃化冷冻。     

人羊水来源干细胞治疗大鼠卵巢早衰的初步研究

目的:尾静脉注射移植人羊水干细胞(AFS),评价其治疗大鼠卵巢早衰(POF)的效果。方法:采用SD大鼠,按体重随机分为四组:A组正常组、B组模型组、C组一次移植组和D组两次移植组,除A组灌胃生理盐水外,其余各组均连续14天灌胃雷公藤多苷片;C组在第14天灌胃后移植一次AFS,D组在第1天与第7天灌胃后移植两次AFS;观察大鼠阴道涂片、血清性激素水平、大鼠卵巢及子宫组织形态学变化。结果:(1)B组动情周期较A组显著延长,C组与D组均有不同程度恢复,D组恢复状况优于C组;(2)HE染色结果显示,D组大鼠卵巢均有新生卵泡;(3)性激素检测结果显示,各组之间E2值差异均有统计学意义(P均<0.01)。结论:AFS对POF有修复作用,可能通过促进卵泡生成,调节雌激素分泌,从而改善了卵巢功能。     

hUCMSCs移植提高围绝经期大鼠血清雌激素水平的持续时间及对卵巢P450arom表达的影响

目的:探讨人脐带间充质干细胞(h UCMSCs)移植提高围绝经期大鼠血清雌激素(E2)水平的持续时间及其对卵巢细胞色素P450芳香化酶(P450arom)表达的影响。方法:阴道脱落细胞涂片法筛选出30只SPF级12~14月龄的围绝经期SD大鼠,随机分为A、B组;同时筛选出15只SPF级3~5月龄具有生育能力的青年雌性SD大鼠,作为C组。B组:尾静脉移植浓度为1×10~6cells/ml的h UCMSCs单细胞悬液1ml,隔日1次,共两次;A组:与B组在相同时间相同方式移植等量PBS液;C组:不予处理。于移植前所有大鼠经眼眶采血检测血清E2水平,并于末次移植后14d、21d、28d每组随机选取5只大鼠采血并取双侧卵巢组织,ELISA法检测血清E_2水平、免疫组化及Western blot法检测卵巢P450arom表达水平。结果:末次移植后14d、21d、28d,B组大鼠血清E_2水平、卵巢P450arom表达与移植前及A组相比均明显升高,差异有统计学意义(P0.05),B组3个时间段的E_2水平、P450arom表达无明显差异(P0.05)。结论:h UCMSCs移植提高围绝经期大鼠血清E_2水平可至少持续至移植后28d;h UCMSCs移植可促进围绝经期大鼠卵巢细胞色素P450芳香化酶表达,是其提高E_2水平的可能途径。     

人脐血单个核细胞移植治疗放射性裸鼠卵巢早衰

目的:探讨人脐血单个核细胞(HCMNCs)移植治疗卵巢早衰(POF)的可行性及疗效。方法 :雌性BALB/C裸鼠105只,随机分为空白对照组、POF对照组、POF+人脐血单个核细胞移植组。钴60γ射线照射建立POF模型,聚蔗糖(Ficoll)密度梯度离心法制备HCMNCs悬液,并以5-溴-2′-脱氧尿苷(BrdU)标记。POF造模成功后,移植组双侧卵巢内注入标记的HCMNCs悬液,POF对照组双侧卵巢内注入同等量的达尔伯克改良伊格尔氏低培养基(L-DMEM)培养液,空白对照组未行任何处理。移植后4周,酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定血清雌二醇(E2)、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成激素(LH)水平变化,并取卵巢组织行苏木素-伊红(HE)染色、BrdU组化染色,观察卵巢卵泡数目变化及移植细胞成活情况。结果:在移植组发现移植的脐血单个核细胞可在早衰的卵巢内存活并参与卵巢功能的修复;血清E2、FSH、LH与POF对照组相比,E2明显升高(P<0.05),FSH和LH明显降低(均P<0.05);卵巢切片HE染色示未闭锁卵泡数目有所增加,并可见各个发育阶段卵泡;免疫组化示移植的人脐血单个核细胞可在裸鼠卵巢内定居并存活。结论:HCMNCs可成功植入裸鼠放射性早衰卵巢内,并能改善其功能。     

TGF-β_1及CTGF在PCOS大鼠的表达及罗格列酮的干预作用

目的:探讨转化生长因子-β1(TGF-β1)及结缔组织生长因子(CTGF)在P-COS大鼠卵巢中的表达及罗格列酮的干预作用。方法:随机将60只雌性SD大鼠分为对照组、模型组和治疗组。模型组和治疗组大鼠在22日龄时用皮下注射脱氢表雄酮(DHEA)法建立PCOS动物模型,治疗组从注射DHEA时起予以罗格列酮3mg/(kg.d)灌胃。第20天处死大鼠,HE染色光镜下观察大鼠卵巢的病理结构;透射电镜观察细胞超微结构;微粒子酶免分析法测定血清激素水平的变化;用免疫组织化学法测定大鼠卵巢组织TGF-β1、CTGF蛋白表达及定位,并用病理图像分析仪分析图像。结果:大鼠血清激素水平,卵巢的病理结构变化以及细胞超微结构验证模型建立成功。模型组卵巢组织TGF-β1、CTGF蛋白表达显著高于对照组(P0.05,P0.001),罗格列酮治疗后,卵巢中CTGF、TGF-β1表达水平均较模型组显著降低(P0.05,P0.001)。模型组血清TGF-β1、CTGF表达也显著高于对照组(P0.05,P0.001),罗格列酮治疗后,血清中二者水平均较模型组显著降低(P0.05,P0.001)。结论:TGF-β1及CTGF协同参与了PCOS大鼠卵巢纤维化的发生、发展过程。罗格列酮可延缓卵巢纤维化的发生发展,其与降低PCOS大鼠的CTGF、TGF-β1的表达有关。     

Heterotopic ovarian transplantation without vascular pedicle in syngeneic Lewis rats: long-term evaluation of effects on ovarian structure and function

OBJECTIVE: To assess the long-term efficacy of intraperitoneal (IP) and subcutaneous (SC) ovarian autotransplantation in rats. DESIGN: Experimental animal study. SETTING: Unit of Experimental Research, Barcelona University School of Medicine. ANIMAL(S): Female syngeneic Lewis rats aged 14 weeks. INTERVENTION(S): Group A, control group undergoing ovariectomy (n = 15); group B, undergoing ovariectomy and IP autologous heterotopic transplant (n = 15); and group C, ovariectomized with SC autologous heterotopic transplant (n = 15). In groups B and C, five animals were killed and their ovaries removed for morphometric analysis at 30 days after transplantation; five additional animals were killed at 180 days, and the remaining five animals were killed at 360 days. MAIN OUTCOME MEASURE(S): Ovarian morphometric analysis and serial measurement of E(2) and FSH serum levels. RESULT(S); The mean number of antral follicles in the control group A was significantly higher than that observed in the ovarian grafts collected and examined 30 days after grafting in rats from groups B and C, but the mean granulosa cell area was significantly higher in both transplantation groups than in controls because of ovarian follicular hyperplasia. Histological examination of ovaries removed at 6 and 12 months after grafting in groups B and C showed increasing degrees of fibrosis, loss of primordial follicles, and the presence of epithelial cysts. In groups B and C, from day 30 after surgery onward, serum E(2) was significantly higher and FSH significantly lower, respectively, than in group A. E(2) and FSH patterns in groups B and C were similar throughout the study period. CONCLUSION(S): Heterotopic ovarian transplantation without vascular pedicle in rats is characterized by follicular hyperplasia endocrinologically functional, followed by progressive loss of follicles in heterotopic ovarian autografts.     

血管形成抑制剂TNP-470对人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤生长的影响

目的 观察血管形成抑制剂TNP－470（简称TNP）对人卵巢癌裸鼠皮上移植瘤生长的影响。方法 对30例裸鼠建立人卵巢癌皮下移植瘤模型,共分为5组：对照组（皮内及腹腔注射无菌生理盐水）,溶剂组（皮内注射1％乙醇及5％阿拉伯糖混合液）,TNP组（皮内注射TNP）,环磷酰胺（CTX）组（腹腔注射CTX）,TNP＋CTX组（皮内注射TNP,同时腹腔注射CTX）。观察各组裸鼠皮下移植瘤生长情况,裸鼠体重的变化,计算抑瘤率,并进行病理学检查。结果 溶剂组抑瘤率为7．9％,对照组为0％,两组比较,差异无显著性（P＞0．05）;TNP组抑瘤率为26．1％,CTX组为33．9％,两组比较,差异无显著性（P＞0．05）;TNP＋CTX组抑瘤率高达70．5％,有极明显的抑瘤效应,与对照组比较,差异有极显著性（P＜0．005）。TNP＋CTX组移植瘤镜下可见肿瘤细胞核浆比例明显小于对照组,核异形性明显少于对照组。结论 TNP对卵巢癌有一定的治疗作用;TNP与化学药物联合应用,抑瘤作用增强。