抗CNE_2细胞单克隆抗体的制备

以CNE_2细胞为免疫原,利用单克隆抗体技术,获得3株杂交瘤细胞株。其相应分泌的A_3,B_5,A_5单克隆抗体均属小鼠IgG_1亚类。它们与CNE_2细胞呈阳性反应,与人ABO红细胞及混合淋巴细胞显示阴性反应;与9株不同来源的细胞系有交叉反应。其中A_3抗体的交叉较广(8/9)其次是A_5(6/9),B_5     

分泌独特型免疫球蛋白BALB/c小鼠B细胞淋巴瘤模型的建立

目的： 构建分泌独特型免疫球蛋白(idiotype, Id) 的BALB/c小鼠B细胞淋巴瘤细胞株，建立动物模型，为进一步开展Id树突状细胞(dendritic cell, DC)疫苗的免疫治疗提供物质基础。 方法： 采用降植烷和不完全弗氏佐剂间隔致敏6～8周龄BALB/c小鼠，继而采用细胞融合技术、ELISA法、免疫荧光标记和流式细胞术(flow cytometry, FCM) 筛选获得分泌Id的阳性克隆；体内诱生腹水和体外无血清培养法制备Id，优球蛋白沉淀法结合凝胶Suphecray200过滤纯化Id；建立荷瘤模型，从荷瘤小鼠骨髓前体细胞诱导DC。 结果：获得2株稳定分泌Id的BALB/c小鼠B细胞淋巴瘤细胞SB4和SB5，Id均为IgM/κ；成瘤率均为100%，荷瘤小鼠平均生存期为（30±4） d。 结论： SB4和SB5能持续稳定分泌非自身反应性Id，具有良好的成瘤性和高转移率。     

Th17细胞过继免疫治疗对荷弥漫大B细胞淋巴瘤小鼠肿瘤生长的影响

目的 探讨Th17细胞过继免疫治疗对荷弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)小鼠肿瘤生长的影响.方法 采用Mini MACS免疫磁珠分离纯化BALB/c小鼠脾来源的CD4+ CD62L+初始T细胞,采用"转化生长因子(TGF-β)、白细胞介素6(IL-6)、干扰素γ抗体(anti-IFN-γ)、白细胞介素4抗体(anti-IL-4)、白细胞介素23(IL-23)"因子组合体外诱导小鼠Th17细胞分化,采用ELISA法测定Th17细胞产生IL-17水平;采用DLBCL细胞株SUDHL-4接种SCID小鼠建立DLBCL荷瘤小鼠模型;选择0、8、18d(3组,5只小鼠/每组)对荷瘤小鼠进行Th17细胞过继免疫治疗,计算肿瘤体积,观察荷瘤小鼠生存期.结果 小鼠在接种SUDHL-4细胞8d左右均形成瘤结节,成瘤率为100％.与对照组小鼠相比,3个过继免疫治疗组小鼠肿瘤体积均明显缩小(P＜0.05),荷瘤小鼠生存期均显著延长(P＜0.05).结论 Th17细胞过继免疫治疗对DLBCL荷瘤小鼠具有抗肿瘤作用.     

白细胞介素2基因转染肿瘤细胞体外生物学特性的研究

将人IL-13基因导入肿瘤细胞观察其对小鼠体内肿瘤生长的抑制作用.P815是强致癌性的DBA/2小鼠肥大细胞瘤,将含人IL-13cDNA的质粒载体以磷酸钙共沉淀法导入P815K系,择出一分泌IL-13能力为40ng(每10~6细胞/每24小时)的亚克隆,同法制备分泌鼠IL-2能力为2.2ng的p815 IL-2细胞,及人IL-13分泌量为700ng的CHO IL-13细胞.p815 IL-13细胞一侧肋腹皮下接种同系DBA/2小鼠(每鼠5×10~5细胞),观察到肿瘤的短暂生长,其后出现完全性肿瘤排斥,第25～32天时,绝大多数小鼠肿瘤完全消失;p815 IL-2细胞接种小鼠出现相似过程,而亲本p815细胞接种后肿瘤持续生长至巨大肿瘤.60～70天后给     

IL-3基因转染的黑色素瘤细胞株的建立及其体外生长性质的观察

为了探讨不同细胞因子基因修饰的肿瘤细胞制备的瘤苗对膀胱癌的治疗作用,作者构建了表达不同细胞因子的逆转录病毒载体N_2/IL-2、N_2/CMV/GM-CSF、DC/TK/IL-1α、N_2/CMV/IL-1β、DC/SV/R/IFN-γ,将其分别转染包装细胞GP env AM12,获得含病毒的细胞上清,再将其分别感染小鼠膀胱癌细胞MBT-2,经筛选获得不同的高分泌株。将这些高分泌株分别接种C3H小鼠后发现分泌IFN、IL-1α、IL-1β或GM-CSF的MBT-2细胞在体内的生长较野生型MBT-2细胞缓慢。而分泌IL-2的MBT细胞在体内的生长受到完全的抑制。在裸鼠体内,仅分泌IL-2的MBT-2细胞的生长受到抑制。免疫组化分析表明,在这些细胞接种处出现CD4~ 及CD8~ T细胞的浸润,在     

细胞因子和低氧对胰腺癌细胞表达血管内皮生长因子A、C的调节

目的:探讨细胞因子白细胞介素(IL)-1α、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)α、SNAP(S-nitroso-nacetyl-penicillamine)(在培养细胞中可释放NO,使细胞处于低氧状态)对胰腺癌细胞产生和分泌血管内皮生长因子(VEGF)-A、C的调节。方法:用northernblot和westernblot法分别分析人胰腺癌细胞株中VEGF-A、VEGF-C基因和蛋白的表达;以IL-1α(10μg/L)、IL-6(100μg/L)、TNFα(50μg/L)或SNAP(25mg/L)刺激细胞株后用逆转录-聚合酶链式反应技术(RT-PCR)分析其VEGF-A、VEGF-C基因的表达。结果:Northernblot法显示6种胰腺癌细胞株均有4.1kbVEGF-A基因和2.4kbVEGF-C基因的表达;Westernblot法显示这6种胰腺癌细胞株均有相对分子质量为43×103的VEGF-A蛋白和相对分子质量为55×103的VEGF-C蛋白表达。RT-PCR分析法显示:IL-1α使细胞株COLO-357产生VEGF-A、VEGF-CmRNA分别增加1~2倍、1倍;IL-6刺激细胞株CAPAN-1产生VEGF-A、VEGF-CmRNA分别增加2~5倍、1倍;TNF-α使细胞株COLO-357产生VEGF-A、VEGF-CmRNA分别减少1~2.5倍、1~2倍,使细胞株CAPAN-1产生VEGF-A、VEGF-CmRNA分别减少1倍、1.6~2.5倍;而SNAP刺激细胞株COLO-357产生VEGF-AmRNA增加5倍,刺激细胞株CAPAN-1产生VEGF-AmRNA增加4倍。结论:细胞因子IL-1α、IL-6、TNFα和SNAP通过调节血管内皮生长因子A、C的表达而影响胰腺癌细胞的生物学特性。     

IL-6基因转染的白血病细胞不同条件下体内外分泌IL-6水平的研究

我们将IL-6基因转染至FBL-3红白血病细胞,建立了高分泌IL-6的FBL-3-IL-6~ 细胞克隆株,并观察了不同照射剂量下其体外生长情况,IL-6分泌水平及不同途径接种人体内后血清和注射局部细胞培养上清中IL-6含量。将IL-6基因转染的FBL-3-IL-6~ 细胞调成1×10~5/ml浓度,分放于瓶中,置钴~(60)下分别照射不同剂量后,置5％CO_2中培养,观察其生长情况和半数死亡时间和全部死亡时间,并每日收集上清冻存待测IL-6。另外将高分泌IL-6的FBL-3-IL-6~ 细胞以2×10~5浓度分别通过腹腔和左股部皮下注入小鼠体内,并于不同时间取小鼠血清测IL-6含量(同时没对照组)。结果表明,当体外照射剂量<500Rad时,不能有效地控制白血病细胞的增殖能力,且于半个月中能保持较高水平的IL-6分泌量。所以当制备灭活的瘤苗时,以选用800Rad的钴~(60)照     

结肠癌细胞转染IL-21基因抑瘤效应的实验研究

目的：初步探讨转染IL-21的结肠癌细胞抑制肿瘤生长的效应。方法：以逆转录病毒为载体将IL-21基因导入结肠癌细胞，筛选建立高表达细胞株，测定其生物学性状指标和抑制肿瘤生长的效果。结果：与原株相比，所建立的Colon26／IL-21细胞株可高质量的表达IL-21，在体内可刺激分泌大量的IFNγ，致使结肠肿瘤明显回缩、结论：IL-21是一种高效的抗肿瘤细胞因子，有望成为结肠癌基因治疗的的候选基因。     

GM-CSF基因修饰肺癌细胞疫苗的抗肿瘤活性及其与化疗的协同作用

目的评价粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因修饰肿瘤疫苗的抗肿瘤活性,探讨其与化疗联合应用的抗肿瘤效果。方法以小鼠肺癌Lewis细胞系接种C57BL/6小鼠建立动物模型。利用含GM-CSF基因的重组质粒GM-CSF-pIRES2-EGFP,转染小鼠肺癌细胞系Lewis和LA795细胞,分别制备自体(Lewis细胞)和同种异体(LA795细胞)肿瘤疫苗。小鼠皮下接种Lewis细胞(1×107个)后5 d,采用GM-CSF分泌性肿瘤疫苗接种3次,同时设PBS组和单纯疫苗组作为对照,检测疫苗治疗前后脾细胞对Lewis细胞杀伤活性的变化,以及血清白介素4(IL-4)和γ干扰素(IFN-γ)的水平。观察GM-CSF分泌性肿瘤疫苗接种及联合化疗对小鼠生存期的影响。结果GM- CSF分泌性自体或同种异体肿瘤疫苗,均可诱导小鼠脾细胞对Lewis细胞杀伤活性增高,第3次接种后分别为(42.0±2.5)%和(39.6±7.3)%;同时血清中Th1类细胞因子IFN-γ的水平升高,而Th2类因子IL-4的水平无显著变化。GM-CSF分泌性肿瘤疫苗治疗组小鼠生存期与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05);而化疗联合疫苗组小鼠生存期较单独治疗组及对照组明显延长(P<0.05)。结论GM-CSF基因修饰的肿瘤疫苗可刺激机体产生特异性免疫反应;化疗的联合应用有助于提高肿瘤疫苗的治疗效果。     

抗人肝癌细胞相关抗原的单克隆抗体

 用人体肝癌培养细胞株SMMC—7721免疫Balb/c小鼠,融合得到六株抗人肝癌细胞单克隆抗体的杂交瘤,选其中一株（B1）连续克隆化培养5次。用间接免疫荧光测定并鉴定抗体,此株杂交瘤能在体外稳定分泌抗体,腹水效价（ELISA）为10^-8。所染色的肝癌以外的组织细胞无明确的反应,仅部分胚胎组织有交叉,说明该单克隆抗体有较好的肝癌细胞相关性。抗体亚型为小鼠IgM型。染色体核型分析,其数量是亲本细胞之和,计2n=80～106,有1～2条中部着丝点标记染色体。该杂交瘤命名为FP-4。     

胃癌单克隆抗体的制备及其免疫组化研究

以低分化胃癌细胞株MKN-46-9免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,获得分泌抗胃癌单克隆抗体的杂交瘤株MG-5,-7,-9及-11。该杂交瘤株可稳定地分泌高效价抗体,能直接用于常规福马林固定,石腊包埋的切片的染色。ABC免疫酶染色表明,对应抗原在各种人体组织的分布有一定的限定性。MG-7及MG-9两种单抗对     

肿瘤靶向DNA载体--转铁蛋白-多聚乙烯亚胺体外介导小鼠IL-12基因转染小鼠骨肉瘤细胞的实验研究

目的 评价转铁蛋白-多聚乙烯亚胺(Transferrin-polyethylenimine，Tf-PEI)靶向性转染小鼠骨肉瘤细胞的可行性。以Tf-PEI为载体，将小鼠IL-12基因导入小鼠骨肉瘤细胞。方法 以Tf-PEI为载体，将荧光素酶基因和小鼠IL-12基因分别导入小鼠骨肉瘤细胞，并检测其转染效率。以游离转铁蛋白竞争性拮抗Tf-PEI，并观察其对转染效率的影响。结果 Tf-PEI可以高效的、靶向性的转染小鼠骨肉瘤细胞。当N/P比值为5时，Tf-PEI的转染效率最高。游离转铁蛋白能够显著的拮抗Tf-PEI的转染。Tf-PEI还可以成功地将小鼠IL-12基因导入小鼠骨肉瘤细胞。结论 Tf-PEI是一种高效、低毒、肿瘤靶向性的基因转染载体，它能成功地将mlL-12基因导入骨肉瘤细胞，广泛应用于体内外恶性肿瘤基因治疗的实验。     

白细胞介素17调节弥漫大B细胞淋巴瘤小鼠主要组织相容性复合体Ⅱ的表达及其与肿瘤进展关系的研究

目的 通过体外培养的Th17细胞过继免疫治疗弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)小鼠,分析白细胞介素17(IL-17)水平与主要组织相容性复合体Ⅱ(MHCⅡ)表达的相关性及其与肿瘤发生发展的关系.方法 免疫磁珠法分离纯化BALB/c小鼠脾来源的CD4+CD62L+T细胞,加入抗CD3抗体、抗CD28抗体、转化生长因子β(TGF-β)、IL-6体外培养Th17细胞,人生发中心B细胞样(GCB)DLBCL细胞株SUDHL-4传代培养后接种到严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠,建立DLBCL小鼠模型.将荷瘤小鼠分为Th17细胞实验组(30只)和对照组(20只),实验组荷瘤小鼠接种Th17细胞,对照组注射0.9％NaCl溶液.分别于预实验得到的小鼠肿瘤中位发病时间和小鼠中位生存时间处死半数小鼠.酶联免疫吸附法(ELISA)检测小鼠肿瘤组织IL-17表达,免疫组织化学法检测MHCⅡ的表达.结果 DLBCL小鼠肿瘤中位发病时间为8d,中位生存期为28d.Th17细胞接种后IL-17表达水平[(11.93±0.56)pg/ml]较对照组[(9.82±0.26)pg/ml]升高(P＜ 0.000 1),随着肿瘤病程进展,IL-17表达水平降低[(9.53±0.18)pg/ml](P＜ 0.000 1);Th17细胞接种后MHCⅡ阳性细胞比例[(69.13±0.36)％]较对照组[(42.59±0.12)％]升高(P＜ 0.000 1),随着肿瘤病程进展,MHCⅡ阳性细胞比例降低[(54.63±0.45)％](P＜ 0.000 1).IL-17与MHCⅡ之间存在正相关性(r=0.89,P=0.000).结论 IL-17可上调DLBCL小鼠肿瘤组织MHCⅡ表达,且随着肿瘤病程进展,MHCⅡ表达下降.MHCⅡ表达水平可作为DLBCL疾病状态的判断指标,而其正向调控因子IL-17表达水平的上调会影响DLBCL的疾病进程,联合检测IL-17和MHCⅡ表达水平对判断DLBCL疾病状态及进程可能更有参考价值.     

IL-24对CIK细胞体内杀伤肿瘤细胞活性的影响

目的 研究IL-24对细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)体内杀伤肿瘤细胞活性的影响。方法 (1)从健康人外周血中提取单个核细胞,第一天加入IFN-γ(1 000 IU/mL),第二天加入IL-1(100 IU/mL)、CD3mAb(50 ng/mL)、IL-2(300 IU/mL)诱导CIK细胞,另一组与IL-1、CD3mAb、IL-2同时加入IL-24(1 000 IU/mL);(2)建立HepG₂肿瘤细胞株荷瘤小鼠皮下移植瘤模型,分为五组,每三天分别测量肿瘤大小。结果 IL-24诱导CIK细胞治疗组荷瘤小鼠实体瘤体积小于其它组(P＜0.05)。结论 在CIK细胞诱导过程中加入IL-24能明显增强其体内的抗肿瘤活性,对临床上把CIK细胞用于生物治疗有一定的指导意义。     

抗人单核细胞单克隆抗体细胞株Liu M的建立

自一献血员外周血分离培养建成一单核细胞株。以此种细胞免疫BALB/c系小鼠,每取后者的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合后,利用免疫组织化学检测系统,已筛选出分泌抗单核细胞膜抗原单克隆细胞株,共七株(Liu M系列)。本文采用ABC法,     

IL-23基因转染小鼠乳腺癌细胞的体内外促凋亡作用研究

目的:将小鼠IL-23基因转染小鼠乳腺癌细胞MA-891,检测该细胞在体内外的凋亡变化,探讨IL-23抗肿瘤作用机制.方法:应用逆转录病毒载体(LXSN)将含 IL-23 基因质粒经ψ2(亲嗜性)和PA317(双嗜性) 2种细胞包装,G418筛选获得携带 IL-23 基因的病毒,后者转染MA-891细胞,经G418筛选后获得IL-23/MA-891阳性克隆.用ELISA法检测IL 23/MA-891细胞分泌IL-23的能力,用MTT比色法检测细胞体外增殖能力.小鼠皮下接种转染IL-23/MA-891细胞,观察其体内致瘤性变化;用流式细胞术及TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡情况;用RT-PCR和Western 印迹法检测肿瘤组织Fas和survivin的表达.结果: IL-23 基因成功转染MA-891细胞,获得了IL-23高表达细胞IL-23/MA-891.转染 IL-23 基因不影响MA-891细胞的体外生长和细胞凋亡,但体内 IL-23 基因转染组肿瘤生长明显受到抑制,肿瘤组织细胞凋亡率增高( P <0.01),细胞表面Fas的表达水平明显增加( P <0.01),survivin表达水平明显降低( P <0.01).结论:转染小鼠 IL-23 基因后对小鼠乳腺癌细胞MA-891的体外凋亡无影响,但在体内 IL-23 可能通过降低survivin表达和上调Fas表达,诱导细胞凋亡而产生抗肿瘤作用.     

pSecTag2B-mIL-18真核分泌表达载体的构建及其抗肿瘤作用研究

目的:探索小鼠IL-18基因治疗肿瘤的方法和疗效。方法:构建pSecTag2B-mIL-18真核分泌表达载体,并用其转染HT-29细胞,RT-PCR和ELISA检测IL-18表达情况;将转染pSecTag2B-mIL-18质粒的HT-29培养上清,加入到小鼠T淋巴细胞培养液,ELISA、RT-PCR检测T淋巴细胞分泌IFN-γ;脂质体包被的pSecTag2B-mIL-18裸质粒,采用肌肉注射法转入Balb/c小鼠,检测IL-18蛋白表达情况;在Balb/c小鼠接种小鼠co-lon-26肿瘤细胞的同时,将表达载体pSecTag2B-mIL-18转入,观察抑制肿瘤生长的情况。结果:1)经酶切和测序鉴定,pSecTag2B-mIL-18真核分泌表达载体所表达的基因序列经比对完全正确。2)pSecTag2B-mIL-18转染HT-29细胞后,IL-18在mRNA和蛋白水平高表达。3)转染后的HT-29培养上清可刺激小鼠T淋巴细胞高水平分泌IFN-γ。4)用裸质粒肌肉注射法将pSecTag2B-mIL-18转入Balb/c小鼠,证明质粒均能够在小鼠肌肉中表达,且表达的蛋白均能分泌到外周血液循环中。5)接种co-lon26细胞的Balb/c小鼠,将pSecTag2B-mIL-18转入小鼠,结果表明IL-18单独应用能明显抑制肿瘤的生长。结论:pSecTag2B-mIL-18裸质粒肌肉注射具有显著的抗肿瘤作用。     

沉默Cbl-b基因对增强T淋巴细胞杀伤小鼠乳腺癌细胞能力的影响

目的 :利用特异性针对Cbl-b(casitas B cell lymphoma-b)基因的小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA)沉默小鼠T淋巴细胞中Cbl-b的表达,并观察沉默Cbl-b表达后T淋巴细胞对小鼠乳腺癌TM40D细胞体外免疫杀伤作用的影响。方法 :筛选高效特异性沉默Cbl-b基因的si RNA序列,转染BALB/c小鼠脾脏T淋巴细胞;转染72 h后,利用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测T淋巴细胞上清液中白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)和转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TNF-β)等T淋巴细胞因子分泌的情况;CCK-8(cell counting kit-8)法检测Cbl-b基因沉默的T淋巴细胞对小鼠乳腺癌TM40D细胞的杀伤率。结果 :从小鼠脾脏中分离获得的T淋巴细胞的纯度为94.77%。蛋白质印迹法检测结果显示,Cbl-b-siR NA-1抑制Cbl-b蛋白表达的能力最佳;Cbl-bsiR NA-1转染T淋巴细胞72 h后,转染组、阴性对照组和空白对照组T淋巴细胞培养上清液中IL-2的分泌水平分别为(1 678.96±126.91)pg/mL、(1 141.69±83.67)pg/mL和(1 054.03±85.14)pg/mL,转染组中IL-2的分泌水平明显高于阴性对照组和空白对照组(P值均<0.001);TNF-β的分泌水平分别为(769.33±65.46)pg/mL、(573.33±58.67)pg/mL和(581.72±51.72)pg/mL,转染组中TNF-β的分泌水平明显高于阴性对照组和空白对照组(P值均<0.05)。在体外实验中,与空白对照组及阴性对照组相比,转染组T淋巴细胞能更高效地杀伤TM40D细胞,对肿瘤细胞的杀伤率最高为(59.18±3.82)%。结论 :特异性沉默Cbl-b基因的表达能够促进T淋巴细胞分泌细胞因子IL-2和TNF-β的能力,并增强T淋巴细胞对小鼠乳腺癌TM40D细胞的免疫杀伤作用。