聚酰胺-胺型树枝状高聚合物介导Survivin反义寡核苷酸抑制人肝癌裸鼠 移植瘤生长的作用*☆

背景：采用反义寡核苷酸等治疗方法可以抑制凋亡抑制因子Survivin 的表达,从而诱导肿瘤细胞凋亡。目前使用Survivin治疗恶性肿瘤仍存在基因载体转染效率低下、不能长期稳定表达、易被酶降解等难题。 目的：观察聚酰胺-胺型树枝状高聚合物(polyamidoamine,PAMAM)脂质体介导Survivin-反义寡核苷酸对人肝癌裸鼠移植瘤的抑制作用。 方法：以人肝癌细胞SMMC-7721裸鼠皮下注射建立人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型,将PAMAM脂质体和PAMAM分别与Survivin-反义寡核苷酸混合得到载反义基因转染复合物。测定复合物的zeta电位及包封率。将两种载基因复合物注射道裸鼠移植瘤体内,观察两组移植瘤大小,检测移植瘤组织中survivin基因的表达。 结果与结论：PAMAM脂质体-survivin-反义寡核苷酸复合物的zeta电位高于PAMAM-survivin-反义寡核苷酸复合物(P < 0.05),基因包封率两组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。PAMAM脂质体-survivin-反义寡核苷酸复合物治疗组裸鼠移植瘤质量及survivin蛋白表达低于PAMAM-survivin-反义寡核苷酸复合物组(P < 0.05)。提示PAMAM脂质体能将Survivin-反义寡核苷酸高效递送到人肝癌移植瘤细胞,降低survivin蛋白的表达,诱导移植瘤细胞凋亡。 关键词：聚酰胺-胺型树枝状高聚合物;脂质体;肝癌;反义寡核苷酸;Survivin doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.12.020      

反义survivin联合顺铂抑制裸鼠荷骨肉瘤生长

目的：探讨反义基因治疗与化疗联合应用提高骨肉瘤疗效的可行性及其机制。 方法:通过构建荷骨肉瘤裸鼠模型，采用瘤内注射和腹腔给药方式，以 survivin反义寡核苷酸（ASODN）配合顺铂（DDP）对瘤鼠进行联合干预治疗，并与各单药组进行比较，观测各组裸鼠肿瘤生长情况、评估瘤体病理形态，免疫组织化学法检测瘤组织survivin蛋白表达，DNA末端原位标记法(TUNEL法)检测肿瘤细胞凋亡水平。 结果:与各单药组相比，联合治疗组在显著下调survivin蛋白表达同时，肿瘤细胞凋亡坏死更为明显，肿瘤生长受抑效果更强。 结论:ASODN对DDP具有明显增效作用，可弥补DDP耐药缺陷，二者联合可望发挥协同抗瘤效应。     

VEGF-ASODN抑制裸鼠胃癌移植瘤微血管生长

目的 研究血管内皮细胞生长因子反义寡核苷酸（VEGF-ASODN）对裸鼠荷人胃癌移植瘤微血管的生长抑制作用。方法 人工合成硫代磷酸化VEGF-ASODN,转染胃癌细胞SGC-7901, 实时荧光定量RT-PCR检测细胞RNA起始拷贝数, ELESA法检测VEGF 蛋白含量,MTT检测细胞生存力,细胞生长曲线检测细胞生长。建立裸鼠荷胃癌移植瘤模型。实验分为4组：（1）VEGF-ASODN组,（2）错义寡核苷酸组,（3）生理盐水组,（4）无荷瘤对照组。结果 VEGF-ASODN能降低胃癌细胞VEGFmRNA的水平,显著降低胃癌细胞及培养液VEGF 蛋白含量,降低细胞生存力、抑制细胞生长。VEGF-ASODN还能显著降低荷瘤裸鼠血清VEGF蛋白水平、减小移植瘤的体积和重量、降低移植瘤微血管密度。结论 VEGF-ASODN抑制移植瘤微血管的生长。     

Survivin反义寡核苷酸联合足叶乙甙诱导K562细胞株凋亡的研究

目的探讨Survivin反义寡核苷酸及VP-16对K562细胞株凋亡的影响。方法将Survivin反义寡核苷酸通过脂质体转染K562细胞株,用免疫组化法测定转染前后K562细胞survivin基因及Caspase-3的表达差异,并加入足叶乙甙,用Tenu l及Annexin V-FITC测定各组细胞的凋亡率。结果转染后survivin基因表达下降,Caspase-3的表达升高,K562细胞生长受抑,细胞凋亡率升高;联合反义寡核苷酸与足叶乙甙,细胞凋亡率明显增加。结论Survivin反义寡核苷酸能够促进白血病细胞株K562的凋亡,能够提高K562对足叶乙甙的敏感性。     

黏着斑激酶反义寡核苷酸抑制人胃癌在裸鼠体内生长

黏着斑激酶 (ＦＡＫ)是一种相对分子质量为 12 5 0 0 0的非受体型蛋白酪氨酸激酶 ,具有独特的结构功能特征 ,在细胞内信号转导中起关键性的作用[1] ,有胞内第一信号之称。我们以ＦＡＫ基因为靶点 ,设计其两条反义寡脱氧核苷酸 ,通过直接注射瘤体的方法 ,观察其在动物实验中的抑瘤效果。一、材料与方法1.细胞培养 :ＢＧＣ 82 3胃癌细胞株引自中国科学院上海细胞生物研究所 ,在含 10 %灭活小牛血清 (杭州四季青公司 )的ＲＰＭＩ 16 40培养液 ,37℃ ,5 %ＣＯ2 饱和湿度ＣＯ2 培养箱中连续培养。 2天传代 1次。2 .人工合成反义寡脱氧核苷酸 (Ａ…     

bcr-ahl融合基因反义寡核苷酸对K562细胞生长的影响

目的：研究 ｂｃｒ－ａｂｌ融合基因硫代磷酸反义寡核苷酸（Ａｓｐｏ）对 Ｋ５６２细胞生长特性的影响,探讨其在慢性粒细胞白血病（ＣＭＬ）基因治疗中的意义。方法：倒置显微镜下细胞活体观察;Ａｓｐｏ与细胞共同培养２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ、９６ｈ及 １２０ｈ,用０．４％台盼蓝染色计各处理组死活细胞数,甲基纤维素半固体培养法观察其克隆形成率的变化,流式细胞仪测定各处理组细胞Ｐ２１０蛋白表达变化。结果：Ａｓｐｏ处理后细胞仍呈克隆状生长,当 Ａｓｐｏ浓度达５μｍｏｌ／Ｌ时,即可产生增殖抑制作用,呈一定的量效关系,其最大抑制效应时间为作用１２０ｈ,当Ａｓｐｏ达１０μｍｏｌ／Ｌ时,在一定细胞浓度范围内（１×１０４／ｍＬ－ ５× １０５／ｍＬ）,均有显著抑制作用,当Ａｓｐｏ浓度达５μｍｏｌ／Ｌ以上时,Ｋ５６２细胞 Ｐ２１０蛋白表达明显下降甚至不表达。 ｂ２ａ２型 Ａｓｐｏ对表达 ｂ３ａ２型 ｍＲＮＡ的 Ｋ５６２细胞也表现出交叉抑制作用。结论：ｂｃｒ－ａｂｌ融合基因反义寡核苷酸对Ｋ５６２细胞具有特异性增殖抑制作用,在慢性粒细胞白血病基因治疗中值得深人研究。     

bcr-abl融合基因反义寡核苷酸对K562细胞生长的影响

目的: 研究bcr-abl融合基因硫代磷酸反义寡核苷酸(Aspo)对K562细胞生长特性的影响,探讨其在慢性粒细胞白血病(CML)基因治疗中的意义。方法:倒置显微镜下细胞活体观察;Aspo与细胞共同培养24 h、48 h、72 h、96 h及120 h,用0.4％台盼蓝染色计各处理组死活细胞数,甲基纤维素半固体培养法观察其克隆形成率的变化,流式细胞仪测定各处理组细胞P210蛋白表达变化。结果:Aspo处理后细胞仍呈克隆状生长,当Aspo浓度达5μmol/L时,即可产生增殖抑制作用,呈一定的量效关系,其最大抑制效应时间为作用120 h,当Aspo达10μmol/L时,在一定细胞浓度范围内(1×10⁴ /mL~5×10⁵/mL),均有显著抑制作用,当Aspo浓度达5μmol/L以上时,K562细胞P210蛋白表达明显下降甚至不表达。b2a2型Aspo对表达b3a2型mRNA的K562细胞也表现出交叉抑制作用。结论:bcr-abl融合基因反义寡核苷酸对K562细胞具有特异性增殖抑制作用,在慢性粒细胞白血病基因治疗中值得深入研究。     

反义c-myc寡核苷酸抑制大鼠胸腺淋巴细胞增殖

目的:观察反义c-myc寡核苷酸对大鼠胸腺淋巴细胞增殖的抑制作用。方法:Ficoll密度梯度离心法分离大鼠胸腺淋巴细胞。利用Iipofectin将正义、反义及错配c-myc寡核苷酸导入大鼠胸腺淋巴细胞,-TdR掺入法及MTS法检测淋巴细胞增殖,RT-PCR检测c-mycmRNA的表达。结果:反义c-myc寡核苷酸可抑制大鼠胸腺淋巴细胞的增殖,但此抑制作用无浓度依赖性,反义c-myc寡核苷酸可降低胸腺淋巴细胞c-mycmRNA的表达。结论:反义c-myc寡核苷酸可抑制大鼠胸腺淋巴细胞的增殖。     

乳糖化多聚赖氨酸导向反义寡核苷酸抗乙型肝炎病毒的作用

目的 研究乳糖化多聚赖氨酸（Gal-PLL）导向反义寡核苷酸对乙型肝炎病毒（HBV）基因表达的特异性抑制作用。方法 根据聚合酶链反应（PCR）产物直接测序结果,在HBV U5样序列区合成了一段16聚硫代磷酸的反义寡核苷酸,并将其与肝靶向配体GaL-PLL连接,在2.2.15细胞比较,观察了它们对HBV基因表达的影响,结果 通过测序确定了2.2.15细胞中的HBV DNA属于HBV表面抗原ayw1亚型,并将此用于反义寡核苷酸的序列设计;经荧光组化分析表明,Gal-PLL对大鼠肝组织有选择性亲和力;Gal-PLL与DNA形成复合物的最佳摩尔比为2：1,在相同实验条件下,硫代磷酸反义寡核苷酸对HBsAg和HBeAg的抑制率分别为70％和58％,而Gal-PLL硫代磷酸反义寡核苷酸对HBsAg和HBeAg的抑制率分别为96％和82％,同时培养上清液和细胞中HBV DNA的含量明显下降,无关序列寡核酸无明显效果,寡核苷酸对细胞未产生毒性,结论 肝靶向配体和反义寡核酸的复合物可以通过无唾液酸糖蛋白受体靶入2.2.15细胞内,并对HBV基因表达和复制产生特异性抑制作用。     

反义寡核苷酸抑制猪内皮细胞生成内皮素的研究

目的：研究内皮素反义寡核苷酸能否抑制猪肺动脉内皮细胞生成内皮素。方法：设计并合成三段针对内皮素－１前体基因的反义寡核苷酸片段，检测其对培养的内皮细胞生成内皮素的影响。结果：两个反义寡核酸片段能明显抑制体外内皮细胞生成内皮素，而相应正义和非特异硫代寡核苷酸则无此抑制作用，说明其作用具特异性。结论：内皮素－１反义寡核苷酸有可能用于内皮素相关的疾病的治疗。     

Bcl-XL反义寡核苷酸转染对食管癌细胞增殖及裸鼠体内人食管癌移植瘤生长的抑制作用

目的探讨Bcl-XL反义寡核苷酸转染后,对食管癌细胞增殖及裸鼠体内人食管癌移植瘤生长的影响。方法采用阳离子脂质体介导的反义寡核苷酸转染、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western蛋白印迹杂交、四甲基偶氮唑盐光吸收法(MTT法)、流式细胞术及凋亡的原位末端标记(TUNEL)检测等方法观察了Bcl-XL反义寡核苷酸转染对食管癌细胞增殖、凋亡的影响及裸鼠体内人食管癌移植瘤生长的影响。结果MTT法检测显示,Bcl-XL反义寡核苷酸可显著抑制食管癌细胞的增殖(P<0.05);对Bcl-XLmRNA表达抑制率为57.3%,可显著下调Bcl-XL的蛋白表达;应用流式细胞术和TUNEL检测技术,反义寡核苷酸组的凋亡率分别为(31.1±5.8)%和35.0%,与相关对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。反义寡核苷酸组裸鼠体内人食管癌移植瘤的生长受到显著抑制(P<0.05)。Bcl-XLmRNA及蛋白表达亦受到明显抑制,并且移植瘤组织中凋亡细胞明显增加。结论Bcl-XL反义寡核苷酸可有效抑制食管癌细胞增殖及裸鼠体内人食管癌移植瘤的生长。通过反义寡核苷酸下调Bcl-XL的表达,达到治疗食管癌的目的,为食管癌的基因治疗提供实验依据。     

半乳糖受体介导的c-myc反义核酸对人肝癌细胞

目的 :探讨半乳糖 (Gal) -聚乙烯亚胺 (PEI) -c -myc反义寡核苷酸 (ASODN)交联复合物对人肝癌细胞增殖的影响。方法 :Gal-PEI-ASODN复合物作用于人肝癌Bel- 74 0 2细胞 ,台盼蓝染色法检测不同时间、不同浓度作用下细胞增殖的变化 ,倒置显微镜观察细胞形态 ,流式细胞仪分析细胞亚二倍体的百分率 ,透射电镜观察细胞超微结构的改变。结果 :在 0 - 96h的不同时间点 ,与ASODN组 (含ASODN 2 0 μmol/L)相比 ,Gal-PEI-ASODN复合物 (含ASODN 0 75 μmol/L)明显抑制Bel- 74 0 2细胞的增殖 ,Gal-PEI -ASODN复合物的起效浓度更低 ,起效时间更短 ;不同浓度的单纯ASODN与Bel- 74 0 2细胞作用 72h ,测得ASODN的IC50 为 2 0 9μmol/L ,而在半乳糖受体的介导下 ,ASODN与Bel- 74 0 2细胞作用 4 8h ,测得ASODN的IC50 为 0 2 94 μmol/L ,ASODN的抑制效果提高 70 9倍 ;Gal-PEI -ASODN复合物与Bel- 74 0 2细胞作用 4 8h ,与单纯ASODN组相比 ,细胞亚二倍体百分率更高 ,并且电镜下可见明显的细胞凋亡形态。结论 :半乳糖受体介导的投递系统可明显提高ASODN对Bel- 74 0 2细胞的增殖抑制效应     

大豆异黄酮诱导裸鼠人胃癌移植瘤凋亡（英文）

目的：探讨大豆异黄酮诱导人胃癌原代细胞裸鼠移植瘤凋亡的机制。方法： 建立人胃癌原代细胞裸鼠移植瘤模型并测定移植瘤的生长曲线；25只BALB/C裸鼠接种胃癌原代细胞悬液生成移植瘤后，不同剂量的大豆异黄酮进行瘤旁注射，透射电镜和TUNEL法检测肿瘤组织细胞凋亡情况，免疫组化法和RT-PCR法检测肿瘤组织的凋亡相关基因bcl-2和bax的表达情况。结果： 大豆异黄酮对胃癌原代细胞移植瘤有明显的抑制作用，在剂量为0.5 mg/kg、1 mg/kg、1.5 mg/kg时，其抑制率分别为10.6%、29.7%和39.1%；透射电镜发现大豆异黄酮导致移植瘤内大量细胞发生调亡；TUNEL染色法发现大豆异黄酮注射组瘤细胞的凋亡指数是随剂量递增（28.7%±1.1%、33.4%±1.4%和37.1%±1.0%）。免疫组织化学法发现大豆异黄酮注射组的Bcl-2蛋白阳性细胞率随剂量递减（11.8%±0.9%、5.7%±0.8%和4.0%±0.8%），而Bax蛋白阳性细胞率随剂量递增（20.0％±±1.2%、24.7％±0.9%和29.3%±1.6%）；RT-PCR法发现,大豆异黄酮注射组的〖STBX〗bcl-2〖STBZ〗 mRNA条带强度随剂量的增大而递减，并明显低于对照组P<0.05）；而bax mRNA条带强度递增，并明显低于对照组（P<0.05），而2对照组bcl-2，bax之间差异无统计学意义（P>0.05）。结论： 大豆异黄酮对胃癌原代细胞移植瘤有明显的抑制作用，通过下调bcl-2的表达和上调bax的表达而诱导胃癌裸鼠移植瘤细胞发生凋亡，是其抗胃癌作用的机制之一。     

荷人鼻咽癌裸鼠血内皮抑素的水平变化

目的:探讨不同病期荷人鼻咽癌裸鼠血内皮抑素水平的变化,及其与肿瘤发展的关系。方法:采用BALB/C裸小鼠复制荷人鼻咽癌裸鼠模型,通过EIA方法测定不同病期荷人鼻咽癌裸鼠血内皮抑素的浓度,称取瘤重。结果:荷瘤鼠血中内皮抑素含量在种瘤5d组[(137.61±53.41)μg/L]或10d组[(103.06±17.33)μg/L]与正常裸鼠[(113.56±21.74)μg/L]比较未见明显差异(P>0.05),而种瘤20d组、30d组、40d组[(212.80±85.91)μg/L、(293.63±62.53)μg/L、(271.57±32.45)μg/L]显著高于正常裸鼠(P<0.05)。随着荷瘤时间的延长,瘤宿主血内皮抑素含量逐渐升高,种瘤20d组明显增高,并持续维持在高水平。瘤重与血中内皮抑素含量呈正相关关系(r=0.687)。结论:提示肿瘤的发展与血内皮抑素含量的变化可能有关。     

反义PKCα对CNE-2Z细胞周期的影响

目的:观察蛋白激酶Cα亚型(PKCα)的反义寡核苷酸对鼻咽癌CNE-2Z细胞生长、细胞周期和cyclinE表达的影响。方法:脂质体法转染反义PKCα,MTT法测细胞生长,流式细胞仪检测细胞周期,免疫细胞化学及点印迹法检测cyclinE表达。结果:①随着反义PKCα的浓度增加,细胞生长指数逐渐降低(P＜0.01)。②反义PKCα使细胞G₁期百分比增高(P＜0.05)。③反义PKCα使细胞cyclinE的表达减弱,扫描定量反义PKCα组为对照组的66.5％±18.4％(P＜0.05)。结论:反义PKCα可通过抑制cyclinE表达、阻滞细胞于G₁期从而抑制CNE-2Z的生长。     

树突状细胞诱导的CIK细胞对肺癌生长的抑制作用

目的探讨树突状细胞诱导的CIK细胞对肺癌移植瘤细胞生长的抑制作用。方法建立肺癌皮下移植瘤模型;分离患者外周血单个核细胞,培养成熟的DC及CIK细胞;用反复冻融肺癌组织的方法制备肿瘤细胞裂解物并负载DC,诱导DC-CIK细胞;进行肺癌移植瘤内注射,比较两组裸鼠移植瘤体积及重量,观察其抑瘤情况。结果 DC-CIK细胞对肺癌皮下移植瘤细胞的抑制率为70.3%,抑制作用明显强于DC或CIK细胞的抑制作用(P0.05)。结论树突状细胞诱导的CIK细胞能够有效抑制肺癌移植瘤生长。     

LDL-ACM复合物对裸鼠皮下移植瘤靶向抑制作用的初步研究

目的: 通过观察比较LDL-ACM复合物和游离ACM对胃癌SGC-7901,NKM-45细胞株裸鼠皮下移植的抑制效应,从而了解LDL作为抗癌药物靶向载体的应用价值。方法: 首先采用温育交换法制备LDL-ACM复合物,然后建立人胃癌细胞株裸鼠皮下移植瘤模型,以瘤重、肿瘤体积、白细胞计数、抑瘤率、生命延长率等指标观察LDL-ACM对移植瘤的抑制作用。结果: LDL-ACM组的移植瘤生长速度明显慢于生理盐水组及游离ACM组,抑瘤率和生命延长率明显高于生理盐水组及游离ACM组,外周白细胞计数无明显变化,尤其对SGC-7901瘤更为明显。结论: LDL-ACM复合物与游离ACM相比有更强的抑癌效应。LDL-ACM复合物有可能是通过LDL受体介导起作用。