沉默Apaf-1 基因对氧糖剥夺/ 复氧复糖PC12 细胞线粒体凋亡通路的影响

目的:探讨RNA干扰沉默Apaf-1基因对氧糖剥夺/复氧复糖PC12细胞线粒体凋亡通路的影响。方法:PC12细胞随机分为3组:正常组(Control)、模型组(Model)、Apaf-1基因沉默组(Apaf-1-siRNA)。正常组于CO2培养箱内正常培养,其余2组给予氧糖剥夺2 h、复氧复糖24 h处理,Apaf-1-siRNA组于造模前将化学合成的siRNA通过脂质体转染于PC12细胞靶向沉默Apaf-1基因。用荧光标记的siRNA检测Apaf-1转染效率,Western blot检测转染后PC12细胞Apaf-1蛋白表达,CCK-8检测细胞存活率,TUNEL染色检测细胞凋亡指数,流式细胞术检测细胞凋亡率,免疫荧光染色检测Bax/Bcl-2比值,Western blot检测线粒体凋亡通路关键蛋白Apaf-1、caspase-9、caspase-3表达。结果:Apaf-1-siRNA可有效沉默PC12细胞Apaf-1蛋白表达(P<0.05)。与Control组相比,Model组细胞存活率明显降低(P<0.05),细胞凋亡指数和凋亡率显著升高(P<0.05),Bax/Bcl-2比值升高(P<0.05),线粒体凋亡通路关键蛋白Apaf-1、caspase-9、caspase-3表达显著升高(P<0.05);与Model组相比,Apaf-1-siRNA组细胞存活率显著升高(P<0.05),细胞凋亡指数和凋亡率显著降低(P<0.05),Bax/Bcl-2比值降低(P<0.05),Apaf-1、caspase-9、caspase-3蛋白表达均明显降低(P<0.05)。结论:靶向沉默Apaf-1基因可有效降低氧糖剥夺/复氧复糖PC12细胞线粒体凋亡通路关键蛋白Apaf-1、caspase-9、caspase-3表达,抑制细胞凋亡,提高细胞存活率。     

RNA干扰沉默Bax基因对线粒体途径软骨细胞凋亡的影响

 【摘要】 目的 利用体外培养的鼠软骨细胞,研究RNA干扰沉默Bax基因表达对经线粒体途径细胞凋亡的影响。方法 体外分离培养SD大鼠软骨细胞;Bax siRNA干扰沉默Bax基因表达。RT-PCR和Western blot检测mRNA及蛋白表达水平;MTT法检测细胞活力;Annexin V-FITC/PI双标记法检测细胞凋亡率;Western blot检测Bcl-2、Cytochrome C蛋白的表达。结果 Bax siRNA干扰24h后,Bax的mRNA和蛋白的表达水平均明显降低。细胞凋亡受到明显抑制,细胞存活率增高。并且,在Bax基因沉默的细胞中,Cytochrome C蛋白表达水平降低,同时Bcl-2蛋白表达水平升高。结论 RNA干扰沉默Bax基因可抑制鼠软骨细胞凋亡并且促进其存活,其机制可能与线粒体途径相关。     

敲减NLRC3表达对人正常支气管上皮BEAS-2B细胞生长的影响

目的:探讨敲减含胱天蛋白酶募集结构域的NOD样受体家族蛋白3(NLRC3)表达对人正常支气管上皮细胞株BEAS-2B活力和凋亡的影响及机制。方法:使用Lipofectamine 2000转染试剂将NLRC3基因的小干扰RNA(siRNA)片段转染至BEAS-2B细胞;RT-qPCR筛选干扰片段;MTT法检测细胞活力;JC-1检测细胞线粒体膜电位变化;annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒检测细胞凋亡率;Western blot检测Bcl-2和Bax的表达水平。结果:NLRC3基因的干扰片段3(siNLRC3-3)干扰效果最佳(P0. 01)。在BEAS-2B细胞中敲减NLRC3可显著增强细胞活力(P0. 01)。敲减NLRC3表达可显著升高线粒体膜电位,使细胞凋亡率显著下降(P0. 05)。敲减NLRC3表达使细胞中Bcl-2蛋白表达水平显著上调,而Bax蛋白表达水平显著下调(P0. 01)。结论:敲减NLRC3基因可通过上调Bcl-2蛋白表达、下调Bax蛋白表达,增强BEAS-2B细胞活力并抑制其凋亡。     

线粒体与细胞凋亡机制

细胞凋亡是生理性的细胞死亡过程,受到多种基因的精确调节。一类被统称为caspase的半胱氨酸蛋白酶是细胞凋亡程序的执行者,它们被激活后作用于细胞内的一些蛋白质,引起细胞凋亡。线粒体中含有许多凋亡相关因子,在凋亡信号转导中起着重要作用。细胞受到凋亡刺激 后,细胞色素c、AIF、caspase-9等凋亡相关因子从线粒体中释放出来。细胞色素c通过和Apaf-1、caspase-9相互作用,激活caspase-9,caspase-9激活下游的caspase蛋白酶。Bcl-2家族成员在细胞凋亡中起着重要的调控作用。     

bcl-3基因通过cyclin D1及Bax蛋白影响人结肠癌RKO细胞的凋亡

目的:研究bcl-3基因对人结肠癌RKO细胞迁移及凋亡的影响及机制。方法:采用人bcl-3基因的RNA干扰慢病毒载体沉默人结肠癌RKO细胞bcl-3基因的表达后,划痕实验观察bcl-3基因沉默前后RKO细胞迁移能力的变化,Annexin V/PI双染色法检测bcl-3基因沉默前后RKO细胞凋亡率的变化,Western blot法检测bcl-3基因沉默前后细胞周期蛋白cyclin D1及凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的变化。结果:划痕实验显示,划痕后36 h,bcl-3基因沉默前后RKO细胞划痕愈合率分别为84.00%及40.00%,差异具有统计学意义(P0.05)。Annexin V/PI双染色法流式细胞术分析显示,bcl-3基因沉默前后的RKO细胞均经5μmol/L顺铂处理24 h后,沉默前后的RKO细胞凋亡率分别为12.89%及59.67%,差异具有统计学意义(P0.05)。Western blot法检测显示bcl-3基因沉默后cyclin D1蛋白表达显著下降(P0.05),Bax蛋白表达显著上升(P0.05),但Bcl-2表达无明显变化(P0.05)。结论:沉默bcl-3基因后,RKO细胞迁移能力下降,凋亡率增加,并伴细胞周期蛋白cyclin D1及凋亡相关蛋白Bax表达的变化。bcl-3基因可能通过改变cyclin D1及Bax蛋白的表达而影响RKO细胞的凋亡。     

沉默生物钟基因Timeless对卵巢癌SKOV3细胞凋亡和侵袭能力的影响

目的:探讨沉默生物钟基因Timeless(TIM)对人卵巢癌SKOV3细胞凋亡和侵袭能力的影响。方法:免疫组化法检测卵巢癌组织及正常卵巢组织中TIM蛋白表达,分析TIM表达与卵巢癌病理特征的相关性。选取卵巢癌SKOV3细胞,随机分为空白对照组、siRNA对照组和TIM沉默(TIM siRNA)组。采用Western blot检测TIM、Bcl-2、Bax、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9、caspase-3和caspase-9蛋白的表达,流式细胞术检测细胞凋亡,Transwell小室实验检测细胞侵袭能力。结果:TIM蛋白在正常卵巢组织中呈阴性表达,在卵巢癌组织中呈阳性表达。卵巢癌组织中TIM阳性表达率(84.0%)显著高于正常卵巢组织(10.0%;P0.01)。TIM表达与卵巢癌分化程度、浸润深度、淋巴结转移及TNM分期有关(P0.05),而与年龄和病理类型无关(P0.05)。TIM siRNA组中TIM、MMP-2、MMP-9和Bcl-2的蛋白表达显著低于空白对照组和siRNA对照组(P0.01),而Bax、caspase-3和caspase-9的蛋白表达显著高于空白对照组和siRNA对照组(P0.01);空白对照组和siRNA对照组之间TIM、MMP-2、MMP-9、Bcl-2、Bax、 caspase-3和caspase-9蛋白表达的差异无统计学显著性(P0.05)。TIMsiRNA组的细胞凋亡率显著高于空白对照组和siRNA对照组(P0.01);空白对照组和siRNA对照组之间细胞凋亡率的比较差异无统计学显著性(P0.05)。TIM siRNA组的细胞穿膜数显著低于空白对照组和siRNA对照组(P0.01);空白对照组和siRNA对照组之间细胞穿膜数的差异无统计学显著性(P0.05)。结论:利用siRNA沉默卵巢癌SKOV3细胞中TIM表达,可促进细胞凋亡,抑制细胞侵袭。     

脯氨酰异构酶1 沉默抑制缺氧/ 复氧H9c2 心肌细胞凋亡

目的:肽基脯氨酰顺反异构酶1(Pin1)在心血管疾病发病过程中发挥重要作用,本研究检测RNA 干扰沉默Pin1 对缺氧/ 复氧诱导的大鼠胚胎心肌细胞H9c2 凋亡的影响及机制。方法:体外培养大鼠H9c2 细胞,建立缺氧/ 复氧损伤模型,模拟体内缺血再灌注损伤;RT-qPCR 和Western blot 法检测Pin1 的表达;将细胞分为空白对照组、缺氧/ 复氧组、缺氧/ 复氧组+转染Pin1 siRNA 组、缺氧/ 复氧组+转染scramble siRNA 组;MTT 法测H9c2 细胞存活率;用流式细胞术Annexin V/ PI 双染法检测细胞凋亡率;用Western blot 法检测H9c2 细胞Bax 和Bcl-2 蛋白表达;生化法检测Caspase-3 的活性水平。结果:Pin1 在缺氧/ 复氧H9c2 细胞中呈现高表达;转染Pin1 siRNA 后,Pin1 的mRNA 和蛋白表达水平均显著降低(P<0.05);与缺氧/ 复氧组比较,Pin1 siRNA 组的细胞存活率增加,凋亡率降低,Bcl-2 蛋白表达升高,Bax 蛋白表达降低,Bcl-2/ Bax 升高,Caspase-3 活性降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:Pin1 下调可减少缺氧/ 复氧诱导的心肌细胞凋亡,可能是通过上调Bcl-2,下调Bax 蛋白表达,降低Caspase-3 活性而发挥作用。     

MACC1表达沉默对胶质瘤细胞U87增殖凋亡的影响

目的探讨MACC1基因表达沉默对脑胶质瘤细胞U87增殖凋亡的影响。方法应用RT-PCR和Western blot检测55例不同病理级别胶质瘤标本MACC1表达;转染MACC1siRNA到U87细胞沉默MACC1基因表达,Western blot检测MACC1,Bcl-2/Bax,caspase-3,c-Met蛋白的表达;MTT法检测细胞生长增殖能力;流式细胞术检测细胞周期及凋亡情况。结果MACC1基因在胶质瘤标本组织表达随病理级别升高而增多;MACC1表达沉默后U87生长增殖能力明显下降,细胞周期阻滞于G0/G1期,细胞凋亡显著增加,MACC1蛋白表达明显下降,Bcl-2/Bax比值降低,caspase-3表达上调,c-Met表达下降。结论下调MACC1表达可促进胶质瘤细胞凋亡,抑制肿瘤细胞增殖,MACC1可能成为胶质瘤基因治疗的新靶点。     

姜黄素对放线菌素D/TNF-α协同诱导PC12细胞凋亡的保护作用及机制研究

目的:观察中药单体姜黄素对ActD/TNF-α协同诱导PC12细胞凋亡的影响,并探讨其机制。方法:采用MTT法确定实验药物的最佳浓度;Hoechst33258荧光染色法观察PC12细胞的凋亡;JC-1荧光分子探针检测线粒体膜电位;Real Time PCR检测凋亡基因Bcl-2/Bax的表达。结果:ActD/TNF-α协同作用可导致PC12细胞的活力降低(P<0.05);出现核固缩、核碎裂现象的细胞增多,细胞凋亡率增高(P<0.05);细胞线粒体膜电位下降;细胞内抗凋亡基因Bcl-2的表达降低(P<0.05)。经姜黄素(5μmol/L)处理后,PC12细胞的活力增强(P<0.05);细胞核固缩、核碎裂现象减少,细胞凋亡率下降(P<0.05);细胞线粒体膜电位上升;细胞内抗凋亡基因Bcl-2的表达增强(P<0.05)。结论:姜黄素可拮抗ActD/TNF-α引起的PC12细胞凋亡,可能与升高线粒体膜电位,促进抗凋亡基因Bcl-2的表达有关。     

槲皮素抑制鱼藤酮诱导的PC12细胞凋亡

目的: 探讨槲皮素对鱼藤酮诱导的PC12细胞凋亡的影响及其作用机制。方法: 运用鱼藤酮诱导损伤PC12细胞,经300 μmol/L槲皮素预处理后,观察细胞形态学改变,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blotting检测Bax和Bcl-2蛋白的表达,JC-1染色检测细胞线粒体膜电位,比较各组的差异。结果: 与鱼藤酮组相比,槲皮素加鱼藤酮处理组细胞形态明显改善,凋亡率降至6.3%(P<0.01),Bcl-2表达增加(P<0.01),Bax表达降低(P<0.01),线粒体膜电位上升(P<0.01)。结论: 槲皮素对鱼藤酮诱导的PC12细胞凋亡具有抑制作用,上调Bcl-2和下调Bax蛋白的表达,维持线粒体膜电位可能是其作用的机制之一。     

Effects of IL-1 Receptor-Associated Kinase-4 Gene Silencing on Human Osteoblast-Like Cells

The aim of this study is to identify the effects of interleukin-1 receptor-associated kinase-4 (IRAK-4) gene silencing on human osteoblast-like cells. The siRNA sequences of the target gene, IRAK-4, were constructed and transferred into MG63 cells (control group = MG63 cells; SC group = MG63 cells transfected with scrambled IRAK-4 siRNA; KD group = MG63 cells transfected with 75 nM IRAK-4 siRNA). The morphological changes, cell growth, cell-cycle progression, apoptosis, and the expression of various cytokines and proteins were compared. Compared with the control and SC groups, IRAK-4 gene silencing in MG63 cells caused morphological changes, inhibited growth, altered the cell-cycle distribution, increased apoptosis (p < 0.05), decreased bone alkaline phosphatase and osteocalcin levels (p < 0.05), and decreased protein expression of Bcl-2/Bax and Bcl-2, p-JNK1/2, p-ERK1/2, and p-p38MAPK (p < 0.05). The results indicated that IRAK-4 gene silencing in MG63 cells inhibited cell proliferation and function and increase apoptosis, which may be related to the decreased Bcl-2/Bax ratio and inhibition of the protein expression of various components of the mitogen-activated protein kinase pathways. The results of this study may help improve the understanding of the relationship between IRAK-4 and osteoblast-like cells and the interactions between various cytokines in the periprosthetic inflammatory environment.     

沉默GRP94 基因对乳腺癌MCF7 细胞增殖和凋亡的影响

目的： 研究沉默葡萄糖调节蛋白GRP94 (Glucose regulated protein,GRP94)对乳腺癌MCF7细胞增殖、凋亡的影响及潜在机制。方法：设计并化学合成靶向沉默GRP94基因的小干扰RNA,通过脂质体转染入MCF7细胞中,采用qRT-PCR和Western blot分别检测GRP94、cyclinD1、Bax和Bcl-2 mRNA和蛋白的表达水平;通过流式细胞术检测细胞凋亡比例变化,Hoechst 33258染色检测凋亡细胞核变化、CCK8实验检测细胞增殖能力的变化。结果： GRP94 siRNA组GRP94基因的表达水平被有效抑制;与对照组相比,GRP94-siRNA转染组的细胞凋亡比例明显增加;凋亡细胞核形态发生变化;增殖能力明显下降;mRNA及蛋白水平cyclinD1、Bcl-2表达明显下调,Bax表达增加。结论：沉默GRP94基因可明显抑制乳腺癌MCF7细胞增殖能力,促进细胞凋亡的发生,且其可能通过下调cyclinD1、Bcl-2和上调Bax表达参与其中。     

慢病毒介导的靶向骨桥蛋白的siRNA对人脑胶质瘤细胞侵袭和凋亡的影响

目的 研究骨桥蛋白(osteopontin,OPN)下调后对胶质瘤细胞侵袭和凋亡的影响.方法 在体外以慢病毒介导的OPN小干扰RNA(small interference,siRNA)感染胶质瘤细胞系U251细胞,实时PCR和Western印迹检测OPN表达.通过Transwell实验、流式细胞仪检测,观察OPN表达下调后对胶质瘤细胞侵袭和细胞凋亡的影响.结果 慢病毒介导的OPN siRNA感染能显著降低U251细胞OPNmRNA水平及蛋白表达,有效抑制U251细胞侵袭能力,并诱导其凋亡,OPN siRNA感染组中Bcl-2、尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)、MMP-2和MMP-9明显减少,Bax显著增多.结论 慢病毒介导的OPNsiRNA可显著抑制U251细胞的侵袭,并促进其凋亡.     

Immunohistochemical study of proteins linked to apoptosis in rat fetal kidney cells following prepregnancy adriamycin administration in the mother

Adriamycin is an antibiotic of the anthracycline group. In a previous study, we showed that administration of a single dose of adriamycin (i.p. injection, 5mg/kg body weight) 4 weeks before pregnancy in female Wistar rats induced histological changes in the fetal renal cells typical of apoptosis and also over-expression of heat shock proteins (HSP70). Using a similar experimental model, we have now examined renal cells in fetuses (gestation day 20) to investigate the pathways of the transduction signal of apoptosis in these cells that is induced by prepregnancy maternal administration of adriamycin. Immunolocalization of several proteins - p53, Bax, Apaf-1 and caspase 9 - which take part in the mitochondrial pathway of apoptosis and caspase 12, which takes part in the endoplasmic reticulum pathway of apoptosis, was determined. The results showed that adriamycin administered to the mother rat before pregnancy subsequently induced changes in fetal kidneys involving both the mitochondrial pathway of apoptosis, with increased labeling of the proteins p53, Bax, Apaf-1 and caspase 9, and the endoplasmic reticulum pathway of apoptosis, with increased labeling of caspase 12. Immunolabeling of these proteins was quantified using an image analysis program.     

特异性siRNA体外抑制HDGF基因对人大肠癌细胞凋亡的影响

目的：了解HDGF基因在体外是否对大肠癌细胞凋亡具有调控作用。方法设计特异性小干扰RNA抑制HDGF基因表达,本试验分为3组：空白对照组、非特异性siRNA转染的阴性对照组及HDGF特异性siRNA干扰组。通过AnnexinV?FITC流式双染, Hoechst 33258荧光染色等方法检测转染前后细胞凋亡变化,运用免疫印迹法检测转染HDGF?siRNA前后相关凋亡蛋白的变化情况。结果与2个对照组相比, HDGF?siRNA处理组细胞早期凋亡率明显上升至（14．1±1．24）％,差异具有统计学意义（P＜0．05）,在形态学上有20％的细胞出现染色质浓染的凋亡小体,而对照组基本未见;此外与2个对照组相比, HDGF?siRNA处理组细胞中bcl?2及Survivin蛋白含量均有明显下调,而Bax明显上调、 Cyt?c从线粒体释放到胞浆、 caspase?9及caspase?3被激活。结论 HDGF?siRNA能在体外有效诱导大肠癌胞发生凋亡,线粒体凋亡途径在HDGF基因介导的凋亡调控中起重要作用,这暗示HDGF将可能成为大肠癌基因治疗的一个极佳的分子靶点。     

RNAi 结肠癌HOXB7 基因表达对癌细胞增殖及凋亡的机制研究

目的:探讨抑制HOXB7 基因表达对结肠癌细胞增殖凋亡的影响。方法:通LipofectamineTM2000 脂质体介导法将合成的阴性对照siRNA(阴性对照组)及HOXB7-siRNA(HOXB7 转染组)转染人结肠癌SW480 细胞,未经特殊处理的细胞为空白组。收集转染48 h 的细胞,RT-PCR 及Western blot 分别检测细胞中HOXB7 的mRNA 及蛋白表达;分别于转染后的24、48、72、96 h,CCK8 法检测细胞增殖;流式细胞仪检测转染后48 h 细胞的凋亡情况;Western blot 检测凋亡相关蛋白B 细胞淋巴瘤/ 白血病-2(Bc-2)、Bcl-2 相关X 蛋白(Bax)及Notch1 信号通路Notch1、Hes1 的蛋白表达。结果:HOXB7 转染组HOXB7 的mRNA 及蛋白表达均显著低于空白组(P<0.05);转染24 h 后三组细胞的OD 值间差异无统计学意义(P>0.05),48、72、96 h 后,与空白组比较,HOXB7 转染组OD 值均显著降低(P<0.05);与空白组比较,HOXB7 转染组细胞凋亡率显著升高,Bcl-2、Notch1、Hes1 蛋白显著下调表达,Bax 蛋白显著上调表达(P<0.05)。结论:RNAi 结肠癌HOXB7 基因表达可通过抑制Notch1 信号通路降低癌细胞的增殖,并诱导细胞凋亡。     

敲低膜联蛋白A7对人肝癌HepG2细胞Bcl-2和Bax表达的影响

目的 探讨敲低膜联蛋白A7表达对人肝癌细胞系HepG2细胞凋亡及凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达的影响。方法 将HepG2细胞接种于6孔板,分为3组：siRNA干扰组、阴性对照组和空白对照组,其中干扰组只转染靶向膜联蛋白A7的siRNA,阴性对照组只转染阴性对照siRNA,空白对照组只加转染试剂。通过Western blotting鉴定膜联蛋白A7在转染后48h可被最大程度的抑制,于是在转染后48h采用流式细胞术检测各组细胞凋亡率,通过免疫组织化学、Western blotting和RT PCR检测Bcl-2和Bax蛋白及mRNA的表达。 结果 与阴性对照组和空白对照组相比,siRNA干扰组细胞凋亡率显著增高（P<0.05）,Bcl-2蛋白和mRNA的表达均显著降低（P<0.05）,而Bax蛋白和mRNA均未发生显著变化（P>0.05）。结论 敲低膜联蛋白A7可促进HepG2细胞的凋亡,降低Bcl-2和Bax的比值。