人TNFα基因转染的人肝癌细胞稳定高表达细胞克隆SMMC7721-TNF的建立及其部分生物学特性的初步观察

用重组逆转录病毒载体L-tnfSN的包装病毒颗粒感染人肝癌细胞SMMC7721，G418筛选后，随机挑选10个细胞克隆，扩大培养，检测细胞培养液上清中TNFα的水平，将其中表达TNF最高细胞克隆命名为SMMC7721-TNF。观察SMMC7721-TNF的分子生物学特性。Southern Blot证明TNFα基因完整地整合在细胞基因组中，     

RNA干扰抑制BMP-2基因表达对人肝癌SMMC7721细胞增殖和凋亡的影响

目的：设计并化学合成针对骨形态发生蛋白2（BMP-2）的siRNA分子片段,转染人肝癌SMMC7721细胞,观察其对SMMC7721细胞增殖和凋亡的影响。方法：阳离子脂质体法瞬间转染SMMC7721细胞,半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法和Western印迹法检测转染BMP-2-siRNA后细胞BMP-2 mRNA水平和蛋白水平的变化,MTT法和流式细胞术检测转染BMP-2-siRNA后SMMC7721细胞增殖、细胞周期和凋亡的变化。结果：3对特异性BMP-2-siRNA均有效地抑制了BMP-2基因的表达,以siRNA-B抑制效果最好。转染BMP-2-siRNA后SMMC7721细胞的增殖能力明显受到抑制( P <0.05)且明显促进了SMMC7721细胞的凋亡。结论：靶向BMP-2基因的siRNA分子片段可以有效地抑制人肝癌SMMC7721细胞的增殖并促进其凋亡     

白细胞介素1β转换酶基因转导人肝癌细胞株的建立及其生物学特性研究

应用基因重组技术构建了人细胞凋亡基因白介素iβ转换酶(ICE)重组逆转录病毒载体pLXSN-hICE,采用电穿孔法将其与空载体pLXSN导入包装细胞系PA317,筛选G418抗性克隆,并将其病毒上清转入人肝癌细胞株SMMC7721,经G418筛选分别获得阳性克隆SMMC7721-hICE及SMMC7721-neo.RT-PCR分析证实目的基因已整合在SMMC7721-hICE细胞基因组中.细胞生长曲线测定及裸鼠致瘤性分析表明SMMC7721-hICE体外生长速度明显低于对照细胞SMMC7721及SMMC7721-neo,而且在裸鼠体内成瘤性降低(前者3/6,后者6/6),肿瘤发生延缓,肿瘤重量明显减轻.以上结果表明,逆转录病毒介导的人ICE基因转染使肝癌细胞恶性增殖明显受抑,为开展人ICE基因治疗提供了实验基础.     

重组人生长激素在体外对人肝癌细胞系SMMC7721的作用

[目的]研究重组人生长激素（recombinant human growth hormone，rhGH）在体外对人肝癌细胞系SMMC7721生长的影响[方法]实验分为对照组、rhGH组、rhGH＋阿霉素fAdriamycin，ADM）组及ADM组；通过体外细胞培养、四甲基俏氯唑蓝（MTT）比色技术及流式细胞术等手段．测定不同浓度的rhGH及其与ADM合用时对人肝癌细胞系SMMC7721的生长曲线、细胞抑制率、细胞周期及增殖指数（PI）的影响.[结果]与对照组相比，不同浓度的rhGH在体外对人肝癌细胞系SMMC7721的分裂增殖无明显影响（P〉0．05），生长曲线不随rhGH浓度的增加而升高；rhGH＋ADM组与ADM组比较细胞抑制率和生存率差异均无湿著性（P〉0．05），生长曲线无明显差异；与对照组及rhGH组相比较，单用ADM或rhGH＋ADM对该细胞的抑制率增加、PI明显减少（P〈0．01），而在单用ADM和rhGH＋ADM组间差异均无统计学意义（P〉0．05）：[结论]rhGH在体外对人肝癌细胞系SMMC7721的分裂增殖无明显促进作用．对ADM的抗癌作用无明湿影响。     

ICE基因转染联合化疗药物杀伤肝癌细胞的研究

目的：研究人ICE基因转染联合化疗药物诱导体外杀伤肝癌细胞的作用。方法：应用电穿孔法将构建成功含有目的基因的逆转录病毒载体pLXSN-hICE导入包装细胞系PA317，筛选G418抗性克隆，并将其病毒上清转入肝癌细胞株HepG2，DNA提取、电泳观察；采用^3H-TDR掺入法观察、分析化疗药物卡铂对肝癌细胞株SMMC7721及转入相应目的基因后的SMMC7721-ICE，SMMC7721-反义hICE，SMMC7721-neo细胞株体外增殖的影响。结果：ICE基因转染可诱导HepG2形成具有凋亡特征的梯状DNA；在卡铂低浓度诱导下，与对照细胞相比SMMC7721-hICE细胞株体外增殖明显受抑。结论：人ICE基因转染可直接诱导肝癌细胞株HepG2凋亡，明显提高肝癌细胞SMMC7721对化疗药物卡铂杀伤的敏感性，ICE基因转染联合化疗药物诱导极大增强了对肝癌细胞的杀伤作用，可能是治疗肝癌一个有前途的方案。     

TNF—α对人肝癌细胞E—钙粘蛋白、α5β1整合蛋白及粘着斑激酶蛋白表达的影响

目的：研究应用肿瘤坏死因子（TNF-α）单独处理SMMC－7721肝癌细胞不能引起肝癌细胞凋亡的原因。方法：采用免疫组化ABC法，结合图像分析仪及流式细胞术和Western印迹方法测定SMMC－7721细胞表面E－钙粘蛋白（E－cadherin)、α5β1整合蛋白（α5β1intergrin)、粘着斑激酶（FAK）表达及粘着斑激酶磷酸化的程度。结果：在肿瘤坏死因子的作用下，E－钙粘蛋白的表达略有下降，但无明显差异。整合蛋白α5亚基的表达明显下降，而整合蛋白β1亚基表达基本无变化。粘着斑激酶的蛋白表达随着肿瘤坏死因子浓度的增加略有下降，但变化不明显，粘着斑激酶的磷酸化程度无明显的变化。结论：单独用肿瘤坏死因子处理SMMC－7721肝癌细胞后，并没有阻断由整合蛋白，α5β1亚基及E－钙粘蛋白介导的2条信号通路，且由胱冬肽酶（caspases)介导的凋亡也没有被完全启动，不足以引起细胞的凋亡。     

STAT3基因RNAi诱导肝癌细胞凋亡及对STAT3信号转导相关基因表达的影响

背景与目的:探讨STAT3基因RNAi对人肝癌细胞SMMC7721凋亡的影响,及对STAT3信号转导相关基因表达的影响,为STAT3信号通路的肿瘤靶向治疗提供理论依据.材料与方法:采用RNAi技术特异性沉默SMMC7721细胞中STAT3的表达,通过Westem blot技术检测经RNAi作用后SMMC7721细胞STAT3蛋白表达水平的变化.采用透射电镜和流式细胞术检测经RNAi沉默SMMC7721细胞中STAT3的表达后,对细胞凋亡的影响.通过半定量RT-PCR法检测细胞凋亡相关因子bcl-2和survivin基因表达的变化. 结果:STAT3基因RNAi可有效沉默SMMC7721细胞中STAT3的表达(P<0.05).STAT3的表达被RNAi沉默后,SMMC7721细胞凋亡率较对照组明显增加(P<0.01).且SMMC7721细胞bel-2和survivin mRNA的表达水平均受到明显抑制,与对照组间的差异均具有统计学意义(P<0.01). 结论:STAT3基因RNAi可有效沉默SMMC7721细胞中STAT3的表达,诱导SMMC7721细胞凋亡,下调SMMC7721细胞bcl-2、survivin mRNA的表达.     

肝癌细胞中血管内皮生长因子的自分泌及其意义

目的 研究人肝癌细胞中血管内皮生长因子(VEGF)的自分泌及其意义。方法：反转录PCR(RTPCR)检测体外培养的人肝细胞肝癌细胞系SMMC7721、HHCC和HepG2中VEGF受体的表达。采用人工合成的反义寡核苷酸(ODN)抑制肝癌细胞VEGF的表达后，分别检测肝癌细胞增殖活性和超微结构的变化，流式细胞仪分析肝癌细胞周期以及VEGF’受体蛋白表达的变化。结果：VEGF受体1(Flt-1)在SMMC7721细胞中有表达，而HHCC和HepG2细胞则表达VEGF受体2(KDR)。反义ODN对HHCC细胞的增殖有抑制作用，且与ODN的作用浓度呈线性关系，浓度为2．5μmol／L、5 μmol／L和10μmol/L时细胞增殖抑制率分别为26％、41％和50％。反义ODN对SMMC7721细胞则无此作用，而正义ODN对上述2种细胞均无作用。反义ODN作用后，HHCC细胞出现S期比率下降，并且在细胞周期曲线中出现凋亡前期峰，而SMMC7721细胞无上述变化。反义0DN能降低HHCC细胞膜表面KDR的表达(阳性率分别为：反义组19.2％，正义组29.8％，对照组31.2％)，对于SMMC7721细胞Flt-1的膜表面表达则无明显影响。结论：人肝癌细胞中存在VEGF的自分泌途径，其机制可能为通过诱导肝癌细胞膜表面KDR的表达及其信号转导作用，从而调节肝癌细胞的分裂增殖。     

靶向IGF1R的siRNA抑制人肝癌细胞SMMC7721裸鼠移植瘤的实验研究

背景与目的:利用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制哺乳动物基因表达已成为研究基因功能的一种有效方法.本研究探讨人胰岛素样生长因子1类受体(insulin-like growth factor 1 receptor,IGF1R)的短发夹环RNA对人肝癌细胞株SMMC7721裸鼠移植瘤的抑制作用.方法:设计并合成特异性靶向IGFIR的siRNA片段,构建SMMC7721-IGFlR-siRNA表达质粒,将其转入SMMC7721细胞.通过G418筛选出稳定株,移植裸鼠成瘤.同时设立对照组.根据体积的均数值绘制肿瘤生长曲线,以HE染色法观察质粒处理后瘤组织的病理改变,Western blot检测肿瘤组织中IGF1R的表达变化,免疫组化SP法检测检测瘤组织内微血管密度,原位末端标记法(TUNEL法)检测肿瘤细胞的凋亡情况.结果:SMMC7721-IGF1R-siRNA组肿瘤体积与SMMC7721-IGF1R-mutation组、SMMC7721组相比差异有统计学意义(P＜0.05).病理学检查及TUNEL检测发现,SMMC7721-IGF1R-siRNA组肿瘤生长受到抑制,细胞凋亡指数[(50.2±6.4)%]明显高于SMMC7721.IGF1R-mutation 组[(5.4±1.0)%]和SMMC7721组[(6.0±2.1)%](P＜0.05).SMMC7721-IGF1R-siRNA组与SMMC7721-IGF1R-mutation 组、SMMC7721相比,瘤内IGFIR蛋白表达明显下调.SMMC7721-IGF1R-siRNA组微血管密度(11.3±4.4)与SMMC7721-IGF1R-mutation组(36.7±7.6)、SMMC7721组(28.4±6.5)相比明显下降(P＜0.05).结论:构建的SMMC7721-IGF1R-siRNA具有RNA干扰作用,能抑制SMMC7721细胞裸鼠移植瘤的生长.     

miR－338对人肝癌细胞增殖及迁移的影响

目的：观察过表达miR－338对人肝癌细胞SMMC－7721增殖及迁移能力的影响。方法：化学合成miR－338寡聚核苷酸,并行测序确认。利用pcDNA6．2－GW／Em－GFP－miR 质粒构建miR－338真核表达载体。pcDNA6．2－GW／Em－GFP－miR－338质粒载体瞬时转染SMMC－7721细胞,实时荧光定量PCR检测miR－338的mRNA表达水平。高表达miR－338后,CCK－8法和划痕实验分别检测SMMC－7721细胞增殖能力及迁移能力的变化。结果：设计的miR－338序列与寡核苷酸测序结果比对,匹配程度达100％。pcD-NA6．2－GW／Em－GFP－miR－338质粒瞬转后人肝癌SMMC－7721细胞 miR －338的表达量与对照组相比显著增加（P＜0．05）。miR－338过表达SMMC－7721细胞的增殖能力与各对照组相比均有显著下降（P＜0．05）;miR－338过表达细胞迁移速度降低。结论：上调的miR－338可抑制人肝癌SMMC－7721细胞的增殖及迁移能力。     

人剪切修复基因XPD转染对人肝癌细胞SMMC-7721的生物学影响

目的 将人剪切修复基因XPD稳定转染人SMMC-7721肝癌细胞,观察转染后细胞内野生型p53、XPD、周期素依赖性蛋白激酶(CDK)7、c-myc等基因表达的变化以及对细胞生长的影响,探讨野生型XPD基因与p53、CDK7、c-myc的相互作用及细胞凋亡机制.方法 将表达绿色荧光蛋白并含有人类全长野生型XPD的pEGFP-N2-XPD重组体质粒稳定转染人SMMC-7721肝癌细胞中,选择培养基筛选单克隆稳定转染重组质粒的人SMMC-7721肝癌细胞(SMMC-7721-pEGFP-N2-XPD)和稳定转染空载质粒的人SMMC-7721肝癌细胞(SMMC.7721-pEGFP-N2),并将人SMMC-7721肝癌细胞作为空白对照,利用荧光显微镜观测绿色荧光蛋白表达,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Westem blot法检测转染XPD基因后细胞内XPD、p53、CDK7、c-myc的表达量变化,并用细胞增殖力检测(MTT)法及流式细胞仪分别检测细胞增殖及凋亡和细胞周期变化.结果 ①免疫荧光显微镜下,SMMC.7721.pEGFP.N2.XPD和SMMC-7721-pEGFP-N2细胞中观察到绿色荧光蛋白表达,说明pEGFP-N2-XPD重组质粒和pEGFP-N2空载质粒成功转染.②RT-PCR检测:SMMC-7721-pEGFP-N2-XPD中p53 mRNA、XPD mR-NA表达量与SMMC-7721-pEGFP-N2和SMMC-7721相比均明显增高(P<0.01),CDK7 mRNA、c-myc mRNA在SMMC-7721-pEGFP-N2-XPD的表达量比两对照组明显降低(P<0.01),而两对照组各个基因的表达没有明显差异(P>0.05).③Western blot检测:SMMC-7721-pEGFP-N2-XPD细胞的p53、XPD蛋白表达最较两对照组升高(P<0.01),CDK7、c-myc的蛋白相对表达量比两对照组降低(P<0.01),两对照组差异没有统计学意义(P>0.05).④M1Tr检测:SMMC-7721-pEGFP-N2-XPD的细胞增殖力较对照组减弱(P<0.05),两对照组筹异没有统计学意义(P>0.05).⑤流式细胞仪检测:SMMC-7721-pEGFP-N2-XPD细胞进入s期出现障碍,停滞在G1期的细胞增多.结论 将XPD成功稳定转染到人SMMC-7721肝癌细胞中,XPD、p53在转录和蛋白水平的表达明显升高,CDK7、c-myc表达明显降低,野生型XPD基因的过表达可能抑制CDK7、c-myc表达,改变细胞周期,并促进p53抑制肝癌细胞增长,促进细胞凋亡.     

重组人P53腺病毒增强肝癌细胞放疗的敏感性

摘 要 目的: 探讨重组人P53腺病毒(recombinant human adenovirus P53，rAdP53)对不同P53状态肝癌细胞生长的抑制和放射增敏作用。 方法: 以重组人P53腺病毒分别感染突变型P53肝癌细胞PLC/PRF/5和野生型P53肝癌细胞SMMC7721， Western blotting检测肝癌细胞P53蛋白表达，MTT法检测细胞存活率，台酚蓝染色绘制细胞生长曲线。肝癌细胞感染rAdP53 48 h后照射不同剂量的X射线，克隆形成法检测放射增敏比，TUNEL法检测细胞凋亡。 结果: 50 MOI rAd-P53转染PLC/PRF/5和SMMC7721细胞后转染效率分别为89.37%和87.53%，转染48 h可见P53蛋白高表达，MTT法显示细胞存活率分别为341%和35.44%，细胞生长曲线显示感染后第5天两种细胞生长抑制率分别为41.91%和17.03% (P<0.01)，PLC/PRF/5细胞的凋亡率\[(8.8±1.4)%\]显著高于SMMC7721 [(4.1±1.1)%] (P<0.01)。应用20 MOI的rAd-P53转染细胞48 h后加X射线(4 Gy)照射，PLC/PRF/5细胞的凋亡率为(26.9±5.6)%，显著高于SMMC7721细胞凋亡率(16.4±29)% (P<0.01)；20 MOI的rAdP53转染后加照射PLC/PRF/5和SMMC7721，细胞的放射增敏比SER(Dq)值分别为1.30和1.16；SER(D0)值分别为1.57和1.25。 结论: rAdP53能显著抑制人肝癌细胞生长、诱导细胞凋亡并提高细胞的放射敏感性，其对PLC/PRF/5细胞作用显著强于SMMC7721细胞；表明不同内源性P53状态的肝癌细胞对rAdP53治疗及其协同的放疗敏感性可能不同。     

体外培养人肝癌细胞对阿霉素耐药机理及电镜形态研究

目的应用人肝癌细胞株SMMC-7721,研究多药耐药（MDR）的产生机理。方法通过不断提高培养液中阿霉素（ADM）的浓度,长期筛选培养,得到人肝癌多药耐药株SMMC-7721／ADM。用MTT法检测常用6种化疗药物对肝癌细胞敏感株SMMC-7721／S和耐药株SMMC-7721／ADM的毒性;用流式细胞技术检测肝癌细胞MDRI基因产物—P—精蛋白（P-gp）的表达以及细胞内柔红霉素（DNR）浓度。结果SMMC-7721／ADM细胞对阿霉素的敏感性下降了59.33倍,同时对表阿霉素（EPi）、柔红霉素（DNR）、丝裂霉素（MMC）也具有显著的交叉抗药性,对顾铂（CDDP）、氯甲喋吟（MTX）无抗药性。耐药株P-gp较敏感株有非常明显升高,耐药细胞内柔红霉素相对该区明显少于其敏感细胞。结论SMMC-7721／ADM对结构和作用不同的亲脂类化疗药物都表现出交叉抗药性。P-gp过度表达引起的细胞内药物浓度减少是SMMC—7721／ADM细胞抗药性的主要原因。     

Tsα1诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡和抑制bcl-2基因的表达

目的:研究胸腺肽α1(Tsα1)在诱导肿瘤细胞凋亡中的作用。方法:应用MTT比色分析法研究Tsα1对人肝癌SMMC7721细胞株的细胞毒作用。流式细胞仪检测法分析Tsα1作用后处于G1期SMMC7721细胞的比率和对凋亡抑制基因bcl2蛋白的抑制率。结果:Tsα1(4000μg/mL)体外培养24、48和72h,对SMMC7721肿瘤细胞抑制率分别是(1.92±0.02)%、(3.27±0.03)%和(7.69±0.03)%,P<0.005;凋亡率分别是(2.5±0.1)%、(18.3±0.2)%和(11.6±0.1)%,P<0.001;bcl2蛋白的抑制率为(1.35±0.1)%、(2.2±0.01)%和(5.53±0.01)%,P<0.005,并呈现细胞凋亡的形态学改变,具有剂量和时间依赖性。结论:Tsα1可直接抑制人肝癌SMMC7721细胞株增殖,抑制bcl2基因表达和诱导肿瘤细胞凋亡。     

索拉非尼及PI3K、mTOR抑制剂对肝胆肿瘤细胞增殖及Ghrelin基因表达的影响

目的 探讨索拉非尼及磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抑制剂对肝胆肿瘤细胞增殖及Ghrelin（GHRL）基因表达的影响。方法 收集体外常规培养的肝癌SMMC7721细胞和胆管癌QBC939细胞,经不同浓度（0、50、100、200 μmol/L）索拉非尼、LY294002（PI3K抑制剂）及Rapamycin（mTOR抑制剂）处理48 h后,采用MTS细胞活性检测试剂盒检测SMMC7721、QBC939细胞的增殖率,实时定量PCR（qPCR）检测SMMC7721、QBC939细胞中GHRL 基因的mRNA水平。结果与对照组相比,LY294002、索拉非尼和Rapamycin处理后的SMMC7721、QBC939细胞的增殖率均降低,差异有统计学意义（P＜0.05）,且随着药物浓度的增加,两种细胞的增殖率均降低（P＜0.05）。qPCR结果显示,经LY294002和索拉非尼处理48 h后的SMMC7721细胞中GHRL mRNA水平与对照组的差异无统计学意义（P＞0.05）;与对照组相比,随着Rapamycin作用浓度的升高,实验组SMMC7721细胞的GHRL mRNA水平升高,差异有统计学意义（P＜0.05）;经LY294002、索拉非尼和Rapamycin处理的QBC939细胞中GHRL mRNA水平高于对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 三种药物均可以抑制肝癌和胆管癌细胞的增殖并促进QBC939细胞的GHRL表达,但仅Rapamycin能上调SMMC7721肝癌细胞的GHRL基因表达。GHRL基因表达与肝癌和胆管癌的发生可能有密切关系。     

黏着斑激酶对肝癌细胞生物学行为的影响

目的：探讨降低黏着斑激酶（FAK）的表达对FAK高表达的人肝癌细胞株SMMC－7721恶性生物学行为影响。方法用Western杂交法比较不同肝癌细胞株FAK含量的差别,构建FAK反义质粒,转染至FAK高表达的细胞株,研究其多种细胞生物学行为的变化。结果SMMC－7721FAK含量比正常人肝细胞L02明显增高,转染FAK反义质粒后、SMMC－7721细胞生长受到抑制,软琼脂培养克隆形成率下降;细胞周期分析,S期细胞下降15％;黏附能力下降;细胞表面整连蛋白含量不变。结论在SMMC－7721中存在FAK过表达,降低FAK表达能部分逆转该肝癌细胞株的恶性表型。     

人肝癌SMMC-7721细胞中POLD1基因CDS突变的检测

目的检测人肝癌细胞株SMMC-7721中POLDl基因CDS的突变情况,以期从DNA复制最关键酶的编码基因POLDl的突变为干预细胞恶性增殖提供新的思路。方法设计人POLDl基因CDS特异性引物,以人肝癌细胞株SMMC．7721总RNA为模板进行RT—PCR扩增,将扩增产物纯化后加入“腺嘌呤”并与T载体连接,将连接产物进行测序,与数据库中的序列进行比对。结果成功扩增了人肝癌细胞中POLDl基因的CDS片段。SMMC．7721细胞中POLDl基因的CDS存在11个碱基替换,1个碱基缺失。结论人肝癌细胞SMMC-7721中POLDl基因的CDS发生了突变,进而导致其编码的氨基酸序列发生改变。     

Pokemon基因在肝癌细胞中的表达及意义

目的探讨Pokemon在肝癌细胞中的表达及意义,进一步阐明肝细胞癌发生发展过程中的分子机制。方法选择肝癌细胞HepG2、SMMC7721和人胚胎肝细胞LO2细胞株,应用Western blot法检测Pokemon在不同细胞中的表达;应用基因沉默方法抑制Pokemon在肝癌细胞中的表达,应用流式细胞仪观察肝癌细胞的凋亡情况。结果Pokemon在肝癌细胞HepG2、SMMC7721中的表达明显高于人胚胎肝细胞LO2;siRNA抑制Pokemon的表达后,肝癌细胞凋亡明显增加。结论原癌基因Pokemon在肝癌细胞中表达明显增高,Pokemon可能在肝癌的发生、发展过程中起重要作用。     

含人TNF-α基因的重组逆转录病毒载体的构建、包装及对人肝癌细胞的感染

利用逆转录病毒载体LN系列的三种载体LXSN,LNCX和LNSX构建了插入TNF_α基因的重组逆转录病毒载体L-tnfSN,LNC-tnf和LNS-tnf。重组载体用磷酸钙沉淀法引入病毒包装细胞PA317,经G418筛选后,用NIH3T3细胞测定病毒滴度,结果表明L-tnfSN产生的病毒滴度最高(1×10~5CFU/ml),LNS-tnf次之(5×10~4CFU/ml),LNC-tnf最低(3×10~4CFU/ml)。应用上述三种重组病毒培养液上清,分别感染人肝癌细胞SMMC7721,经G418筛选获得数株抗性克隆。对每种病毒感染的细胞随机挑取6个克隆扩大培养,测定培养液上清中TNFα的分泌量,结果显示L-tnfSN介导感染的克隆中TNFα分泌量最高(382U/10~6细胞/24h),LNC-tnf次之(221u/10~6细胞/24h),LNS-tnF最低(124u/10~6细胞/24h)。反映不同启动子元件有不同的表达强度。     

艰难梭菌A毒素诱导SMMC7721细胞和Vero细胞凋亡的比较研究

背景与目的:艰难梭菌是假膜性大肠炎及抗生素诱发性腹泻的主要致病菌之一,它产生的毒素具有不同的生物学活性.本实验拟研究艰难梭菌 A毒素诱导人肝癌细胞株( SMMC7721)和非洲绿猴肾细胞( Vero细胞)凋亡的作用. 方法:由脑心浸液对艰难梭菌 VPI 10463菌株培养产毒 , 经甲状腺球蛋白亲合层析和 Q Sephrose层析提纯得到精制 A毒素.对 SMMC7721细胞的研究以 Vero细胞为对照.抑制细胞增殖的检测采用 MTT法;用荧光显微镜、电子显微镜、流式细胞仪观察细胞形态和细胞周期的改变;采用琼脂糖凝胶电泳法观测 DNA碎片.结果:不同浓度 A毒素 (0.293～ 4.690 mg@ L- 1)明显抑制了 SMMC7721及 Vero细胞的增殖,并且呈时间和浓度依赖性;两种细胞与 A毒素共同培养 48 h,荧光显微镜和透射电镜都观察到典型的凋亡形态变化; SMMC7721细胞与 A毒素共同培养 48 h后,琼脂糖凝胶电泳显示梯形条带.结论: A毒素明显诱导了两种细胞的凋亡 ; A毒素对 SMMC7721细胞具有更强的诱导凋亡作用.