胰腺癌肿瘤干细胞的悬浮培养法

目的 建立无血清悬浮培养分离人胰腺癌细胞系PANC1干细胞球的方法.方法 采用无血清悬浮法培养PANC1细胞,显微镜下观察干细胞球形成率;流式细胞仪检测细胞CD133表达和细胞周期;以含10%FBS培养基诱导干细胞球细胞分化,荧光显微镜下观察细胞形态及CK18的表达;干细胞球细胞接种NOD/SCID小鼠皮下,观察其成瘤能力.结果 在无血清悬浮培养条件下存活的PANC1细胞形成干细胞球,体外连续传代培养20代始终保持4%0～5%0的干细胞球形成率.干细胞球细胞CD133表达率(5.91±0.7)%,G0/G1期细胞占(80.99±2.60)%,与原代PANC1细胞的(1.44±0.52)%和(69.01±5.03)%相差显著(P＜0.05).将于细胞球细胞置含血清培养基中培养.细胞逐渐恢复原代细胞形态,并表达上皮标志蛋白CK18,2×103的干细胞即在NOD/SCID小鼠皮下成瘤.结论 无血清悬浮法培养PANC1细胞可分离出肿瘤干细胞,其具有自我更新、多向分化和成瘤能力.     

MEK通路抑制剂对人胰腺癌细胞生长及细胞周期相关抑癌基因表达的影响

目的 观察细胞外信号调节激酶信号通路(MEK)抑制剂对人胰腺癌细胞生长及细胞周期相关的抑癌基因表达的影响。方法 培养人胰腺癌细胞系CFPAC1、PANC1和MiaPaCa2,应用50μmol/L的MEK抑制剂PD98059处理细胞24h,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖,流式细胞仪分析细胞周期,实时定量PCR法检测p16INK4a、p21 WAF1和p27KIP1 mRNA的表达,蛋白质印迹法检测DNA甲基化酶(Dnmt)1、3a和3b表达,甲基化特异性PCR(MSP)分析p16INK4a基因启动子甲基化状况。结果 PD98059处理24h后,CFPAC1、PANC1和MiaPaCa2细胞的增殖抑制率分别为69％、78％和45％;G0/G1期细胞比例分别从(68.21±0.73)％、(56.54±0.68)％、(54.89±0.79)％增加到(80.37±0.65)％、(72.05±0.52)％、(79.21±0.93)％(P值均＜0.05);S期和G2/M期细胞比例相应减少。PD98059处理后,CFPAC1、PANC1细胞p27KIP1、p21WAF1和p16INK4a mRNA表达增加,Dnmt1和Dnmt3b蛋白表达减少;p16INK4a启动子甲基化状态被去除。而MiaPaCa2细胞仅p27KIP1 mRNA表达增加;p21WAF1、p16INK4a mRNA和Dnmt表达均无明显变化。结论 MEK通路抑制剂可能通过下调DNA甲基化酶、上调细胞周期相关抑癌基因表达而抑制胰腺癌细胞周期进展和细胞增殖。     

Hedgehog通路抑制剂逆转人胰腺癌SW1990细胞获得性耐药的实验研究

目的 探讨人胰腺癌SW1990耐药细胞株中Hedgehog通路成员(Shh、SMO、Gli1、ABCB1、ABCG2)表达的变化及应用Hedgehog信号通路抑制剂对其耐药性的影响.方法 建立人胰腺癌SW1990耐吉西他滨细胞株(SW1990/GZ).采用Hedgehog信号通路抑制剂环巴明作用耐药细胞,应用实时PCR、蛋白质印迹法检测用药前后细胞Shh、SMO、Gli1、ABCB1、ABCG2 mRNA和蛋白的表达及CD44+ CD24+、CD133+细胞亚群比例.以100 μmol/L吉西他滨作用环巴明处理后的SW1990/GZ细胞,应用Annexin V加PI双染法检测细胞凋亡率.结果 SW1990/GZ细胞中CD44+ CD24+细胞比例从亲代的(29.45±1.99)％增加到(93.16±2.46)％、CD133+细胞比例从(59.37±1.69)％增加到(95.88±1.47)％(P＜0.01);ABCB1、ABCG2、Shh、Gli1 mRNA的表达分别增加(274.90±31.44)、(3.48±0.33)、(12.07±1.71)、(4.15±0.42)倍(P＜0.01),并检测出SMO mRNA表达.蛋白表达结果与mRNA表达一致.2μmol/L环巴明作用SW1990/GZ细胞1周后,CD44+CD24+比例下降到(36.68±2.44)％、CD133+细胞比例下降到(62.76±1.28)％(P＜0.05).2、5μmol/L环巴明处理SW1990/GZ细胞后再用100 μmol/L吉西他滨处理细胞,细胞的凋亡加死亡率分别为(53.68±5.24)％和(69.99±3.16)％,显著高于对照组的(4.55±0.87)％(P＜0.01).结论 人胰腺癌SW1990耐药细胞株中高富集肿瘤干细胞,高表达Hedgehog信号通路成员SMO及Gli1.抑制耐药株的Hedgehog通路,可以降低其肿瘤干细胞比例,下调SMO及Gli1表达,部分恢复对吉西他滨的敏感性.     

miR-21抑制物对A549细胞球增殖的影响及机制

目的研究miR-21抑制物在A549细胞球增殖的作用及其相关机制。方法在无血清培养基中培养A549细胞球,形成细胞球后进行CD133+CD44+表达检测。实验分为A549细胞球组:未经处理;IHN组:miR-21抑制物转染A549细胞球组;IHN-NC组:miR-21抑制物阴性对照物转染A549细胞球组。Western印迹检测A549细胞和A549细胞球中DKK2、β-catenin蛋白以及QPCR检测miR-21在两种细胞中的表达;合成miR-21抑制物和阴性对照,分别转染A549细胞球48 h后,应用QPCR检测转染前后miR-21的表达变化,以及使用Western印迹分析DKK2、β-catenin蛋白的表达变化,利用噻唑蓝(MTT)检测12、24、48 h细胞的增殖能力。结果流式细胞术检测A549细胞球中CD133+CD44+阳性率为65.800%;IHN组miR-21的表达以及β-catenin蛋白的表达较A549细胞球组和IHN-NC组显著下调(P<0.05),而DKK2蛋白表达显著升高(P<0.05);MTT结果示IHN组和IHN-NC组在12、24、48 h时抑制率显著高于A549 sphere组(P<0.05),IHN组在24、48 h时相点抑制率明显高于IHN-NC组(P<0.05)。结论miR-21抑制物可有效抑制A549 sphere的增殖,其可能成为治疗肺癌的潜在靶点。     

沙格列汀对ox-LDL诱导的血管内皮细胞损伤及miR-590/TLR4/NF-κB表达的影响

目的探讨沙格列汀对ox-LDL诱导的血管内皮细胞损伤及miR-590/TLR4/NF-κB表达的影响。方法培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)并分为对照组、ox-LDL组、沙格列汀组、沙格列汀+miR-590抑制物组、NC模拟物组、miR-590模拟物组、NC抑制物组、miR-590抑制物组。检测细胞的增殖活力、细胞中miR-590/TLR4/NF-κB表达量及培养基中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、细胞间黏附分子1(ICAM-1)、血管细胞黏附分子1(VCAM-1)的含量。结果 ox-LDL组细胞中TLR4、NF-κB p65表达量及培养基中TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1的含量均明显高于对照组,细胞增殖活性及细胞中miR-590的表达量明显低于对照组;沙格列汀组细胞中TLR4、NF-κB p65表达量及培养基中TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1的含量均明显低于ox-LDL组,细胞增殖活性及细胞中miR-590的表达量明显高于ox-LDL组;沙格列汀+miR-590抑制物组细胞中TLR4、NF-κB p65表达量及培养基中TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1的含量均明显高于沙格列汀组,细胞增殖活性及细胞中miR-590的表达量明显低于沙格列汀组;miR-590模拟物组细胞中TLR4、NF-κB p65的表达量及培养基中TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1的含量均明显低于NC模拟物组,miR-590抑制物组细胞中TLR4、NF-κB p65的表达量及培养基中TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1的含量均明显高于NC抑制物组。结论沙格列汀能够通过miR-590/TLR4/NF-κB通路减轻ox-LDL诱导的血管内皮细胞损伤。     

阻断Hedgehog信号通路对人胰腺癌干细胞自我更新的影响

目的 观察Hedgehog信号通路特异阻断剂环巴明对胰腺癌干细胞自我更新的影响.方法 应用0.5、1、2、5、10 μmol/L环巴明处理胰腺癌PANC1干细胞、PANC1贴壁细胞和永生化胰腺导管上皮H6C7细胞24、48、72 h.采用实时RT-PCR法检测细胞Smo及Gli1 mRNA表达;CCK-8法检测细胞增殖抑制;流式细胞仪检测细胞周期及凋亡.结果 10 μmol/L环巴明处理72 h后,PANC1干细胞、PANC1细胞和H6C7细胞的Smo mRNA表达量分别为1、0.83、2.61;Glil mRNA为57.27、26.35、1;生长抑制率分别为(37.85±13.69)%、(8.53±4.43)%、(43.55±28.98)%.与PANC1细胞比较,PANC1干细胞的Smo、Gli1 mRNA表达显著增加,生长抑制率亦显著增强(P值＜0.05或＜0.01).经10 μmol/L环巴明处理72 h,PANC1干细胞G1期比例从(67.41±6.35)%显著降至(36.53±6.03)%(P＜0.05),细胞凋亡率从(10.95±5.68)%降至(5.73±1.42)%(P＞0.05);PANC1细胞G1期比例从(67.64±6.88)%显著降至(53.13±1.10)%(P＜0.05),细胞凋亡率从(12.08±4.12)%降至(5.66±1.33)%(P＞0.05);而H6C7细胞的G1期比例及凋亡无明显变化.结论 环巴明阻断Hedgehog信号通路可抑制PANC1干细胞增殖,其机制可能与细胞凋亡无关.     

斑蝥素对胰腺癌细胞系PANC1、CFPAC-1的凋亡诱导作用及机制研究

目的 研究斑蝥素对胰腺癌细胞系PANC1、CFPAC-1的凋亡诱导作用及机制。方法 用斑蝥素处理PANC1、CFPAC-1细胞。四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡;酶化学法检测caspase活性;RT-PCR及蛋白质印迹法检测凋亡相关基因的表达。结果 斑蝥素呈剂量依赖性明显抑制胰腺癌细胞系PANC1、CFPAC-1增殖及诱导细胞凋亡。10μmol/L斑蝥素处理细胞72 h,PANC1、CFPAC-1细胞的增殖抑制率最高,分别达(52.95 +6.34)％和(71.21 +6.30)％。处理24h,PANC1细胞的早期和晚期凋亡细胞分别从7.35％增加到24.89％、6.36％增加到17.73％;CFPAC-1细胞从6.39％增加到24.70％、9.21％增加到12.58％(P值均＜0.01)。PANC1细胞的caspase 8和caspase9活性分别为对照组的(155.8±11.5)％和(194.6±14.7)％;CFPAC-1细胞分别为对照组的(182.5±24.3)％和(215.8±12.2)％(P值均＜0.01)。促凋亡基因TNF-α、TRAILR1、TRAILR2、Bad、Bak和Bid表达增加,抗凋亡基因Bcl-2表达减少。结论 斑蝥素通过激活Caspase、上调促凋亡基因及下调抗凋亡基因的表达从而诱导胰腺癌细胞凋亡。     

增殖性腺病毒CNHK600-p53的构建及对胰腺癌细胞抑制的体外实验研究

目的 探讨携带p53基因的新型增殖性腺病毒CNHK600-p53的导入能否增加胰腺癌细胞株PANC1对化疗药物的敏感性.方法 采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法,观察化疗药物5-FU、丝裂霉素(MMC) 和表阿霉素(epirubicin, EPI)单独应用及与CNHK600-p53联合应用对胰腺癌细胞株PANC1的杀伤效应.结果 PANC1在5-FU浓度为400 μg/ml时细胞抑制率为(65±4.2)%,MMC浓度为1 μg/ml时细胞抑制率为(41±1.9)%,EPI浓度为10 μg/ml时细胞抑制率为(65±1.8)%.转入CNHK600-p53(MOI = 0.625)后再使用上述浓度的化疗药物,PANC1的细胞抑制率分别为(89±5.3)%、(60±2.3)%和(75±1.5)%.当MOI值为0.3125、0.625、1.25时,CNHK600-p53组和Ad-p53组的细胞抑制率分别为(27±2.5)%、(30±3.7)%、(61±4.3)%和(4±2.7)%、(5±3.5)%、(16±4.5)%.结论 单用CNHK600-p53效果优于Ad-p53,携带p53基因的CNHK600-p53能提高胰腺癌细胞株PANC1对化疗药物的敏感性.     

CD137信号通过核因子κB影响小鼠主动脉平滑肌细胞活化T细胞核因子c1表达

目的 探讨CD137信号是否通过核因子-κB(NF-κB)调控小鼠血管平滑肌细胞(VSMC)活化T细胞核因子c1(nuclear factor of activated T cells c1,NFATc1)表达.方法 采用组织块贴壁法对正常C57BL/6J小鼠的VSMC进行原代培养.以每孔2×105个VSMC接种于6孔板中培养,待其贴壁后,饥饿24 h,用含10％ FBS+肿瘤坏死因子(TNF-α,终浓度10 ng/ml)的DMEM培养基分别培养细胞0、4、8、12、24、36、48 h后,收获细胞用于CD137 mRNA和蛋白的检测,选取CD137表达最多的时间点进行下一步实验.细胞实验分为3组,即对照组[含10％ FBS、TNF-α(终浓度10 ng/ml)、DMEM培养基共同干预]、刺激组[对照组干预基础上加CD137 mAb激动剂(终浓度10 μg/ml)]和抑制组[对照组干预基础上加PDTC(终浓度30 μmol/L),然后加CD137 mAb激动剂(终浓度10 μg/ml)].加入不同干预因素后继续培养,分别于90 min时收集核内外磷酸化(p)-NF-κB p65、核因子κB抑制蛋白(IKB-α),24 h收集细胞总RNA和NFATc1蛋白备检.逆转录定量聚合酶链反应检测CD137和NFATc1 mRNA表达水平.流式细胞术检测CD137膜蛋白表达水平.蛋白印迹法检测IκB-α、NF-κB p65、p-NF-κB p65和NFATc1蛋白表达水平.结果 (1)TNF-α诱导VSMC表达CD137的结果:TNF-α刺激VSMC 4、8、12、24、36、48 h后,细胞CD137 mRNA表达均上调.RT-PCR结果示,以24 h组CD137 mRNA升高最为显著,以未刺激(即0h)组的细胞为对照进行比较,差异有统计学意义(40.00±2.83比1,P＜0.05).流式细胞术检测亦显示24 h组CD137膜蛋白升高最为显著.(2)各组VSMC中p-NF-κB p65蛋白表达水平的检测结果:刺激组VSMC胞浆中p-NF-κB p65蛋白表达水平高于对照组(8.34±0.28比1,P＜0.05),而IkB-α蛋白表达水平低于对照组(1比2.70±0.28,P＜0.05).抑制组VSMC胞浆中p-NF-κB p65蛋白表达水平低于刺激组(1.15 ±0.14比8.34±0.28,P＜0.05),而IkB-α蛋白表达水平则高于刺激组(1.78±0.74比1,P＜0.05).刺激组VMSC细胞核内p-NF-KB p65蛋白表达水平高于对照组(2.64±0.42比1,P＜0.05),而抑制组表达水平则低于刺激组(2.09±0.12比2.64±0.42,P＜0.05).(3)各组VSMC中NFATc1 mRNA和蛋白表达水平的检测结果:干预24 h后,刺激组VSMC中NFATc1 mRNA表达水平高于对照组(2.07±0.09比1,P＜0.05),NFATc1蛋白表达水平亦高于对照组(1.75±0.07比1,P＜0.05).而抑制组VSMC中NFATc1 mRNA表达水平低于刺激组(1.15±0.07比2.07±0.09,P＜0.05),蛋白表达水平亦低于刺激组(0.90±0.11比1.75±0.07,P＜0.05).结论 CD137信号通过NF-κB p65影响小鼠VSMC中NFATc1的表达.     

circNT5E靶向miR-377-3p对ox-LDL诱导的血管平滑肌细胞增殖、迁移侵袭的影响

目的探讨环状RNA NT5E(circNT5E)对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的血管平滑肌细胞增殖、迁移侵袭的影响,并探讨其机制是否与调控miR-377-3p表达有关。方法将人主动脉血管平滑肌细胞(HASMCs)分为对照(Con)组(正常培养的细胞)、ox-LDL组(50 μg/ml ox-LDL)、ox-LDL+si-NC组(转染小干扰RNA阴性对照,50 μg/ml ox-LDL)、ox-LDL+si-circNT5E组(转染si-circNT5E,50 μg/ml ox-LDL)、ox-LDL+miR-NC组(转染miR-NC,50 μg/ml ox-LDL)、ox-LDL+miR-377-3p组(转染miR-377-3p模拟物,50 μg/ml ox-LDL)、ox-LDL+si-circNT5E+anti-miR-NC组(转染si-circNT5E和anti-miR-NC,50 μg/ml ox-LDL)、ox-LDL+si-circNT5E+anti-miR-377-3p组(转染si-circNT5E和anti-miR-377-3p,50 μg/ml ox-LDL)。实时定量PCR(RT-qPCR)检测circNT5E和miR-377-3p表达;细胞计数法、Transwell实验检测细胞活力、迁移和侵袭细胞数。双荧光素酶报告实验和RT-qPCR确定circNT5E对miR-377-3p的靶向作用。结果 ox-LDL处理的HASMCs中circNT5E表达量、细胞活力、迁移和侵袭细胞数显著升高(P0.05),miR-377-3p表达量显著降低(P0.05)。干扰circNT5E表达或过表达miR-377-3p可减弱ox-LDL对HASMCs增殖、迁移和侵袭的促进作用(P0.05)。circNT5E直接结合miR-377-3p,干扰circNT5E促进miR-377-3p表达,而过表达circNT5E抑制miR-377-3p表达(P0.05)。抑制miR-377-3p表达可逆转干扰circNT5E对ox-LDL诱导的HASMCs增殖、迁移和侵袭的抑制作用(P0.05)。结论干扰circNT5E表达可抑制ox-LDL诱导的血管平滑肌细胞增殖、迁移侵袭,其机制与上调miR-374a-3p表达有关。     

HT29和HCT116结肠癌细胞无血清培养形成肿瘤干细胞球特性的差异性研究

目的比较HT29和HCT116两种结肠癌细胞系中肿瘤干细胞的差异，初步探讨结肠癌干细胞研究模型。方法以无血清培养法培养HT29和HCT116细胞，观察其在不同时间形成肿瘤干细胞球的差异，用限制性稀释法计算两者的成球率；流式细胞术分析HT29和HCT116细胞系中CD44／CD24的表达情况；裸鼠体内成瘤实验鉴定HT29细胞球与HCT116细胞球成瘤能力。结果无血清培养法发现HCT116较HT29更易形成肿瘤干细胞球且所需时间更短，即HT29在无血清培养的第7天开始形成规则的球体，而HCT116则在第5天就已形成规则的球体，HCT116成球率（11．4±1．15）％高于HT29（3．31±0．27）％，且差异有统计学意义（P〈0．05）；HT29和HCT116中CD44±／CD24±各细胞含量有显著差异，结果显示具有干细胞特性的CD44＋／CD24＋结肠癌细胞在HCT116中所占比例（60．33±5．75）％明显高于HT29（9．23±2．15）％，差异有统计学意义（t=13．939，P〈0．05）；体内成瘤实验发现HCT116细胞球在裸鼠体内的成瘤能力明显强于HT29细胞球，HCT116细胞球的成瘤速度及瘤体生长速度都较HT29细胞球快。结论与HT29相比，HCT116结肠癌细胞系更适合作为肿瘤干细胞研究的模型。     

Jagged1基因沉默对人胰腺癌细胞SW1990和PANC1血管相关因子分泌及迁移能力的影响

目的 以RNA干扰技术靶向沉默人胰腺癌细胞株Jagged1基因,观察细胞VEGF、Angiopoietin2、bFGF、MMP9的分泌及细胞迁移能力的变化.方法 应用靶向Jagged1的siRNA、对照siRNA(c-siRNA)转染人胰腺癌细胞株SW1990和PANC1,实时PCR法和蛋白质印迹法检测细胞Jagged1 mRNA和蛋白的表达,ELISA法检测细胞培养上清中VEGF、angiopoietin2、bFGF、MMP9的分泌量,Transwell小室观察细胞的迁移能力.结果 SW1990和PANC1细胞均高表达Jagged1基因.15 nmol/L Jagged1 siRNA转染胰腺癌细胞72 h后,SW1990、PANC1细胞的Jagged1 mRNA表达被抑制,分别为c-siRNA组的(59.62 ±2.75)％和(76.96 ±6.16)％,Jagged1蛋白表达几乎完全被抑制.SW1990、PANC1细胞的VEGF分泌量均较c-siRNA组显著减少[(867.93±58.69) pg/ml比(1516.24±37.58)pg/ml,(951.13±120.49) pg/ml比(1413.68±33.56) pg/ml,P＜0.05],但angiopoietin2、bFGF、MMP9蛋白分泌无明显变化.另外,Jagged1 siRNA转染后,SW1990细胞VEGF mRNA表达水平为c-siRNA组的(52.26 ±4.85)％ (P＜ 0.05);PANCI细胞为c-siRNA组的(59.75±4.91)％(P＜0.05).转染后的SW1990和PANC1细胞的穿膜细胞数分别为(65.25±5.56)、(57.50±8.58)个,较c-siRNA组的( 122.25±11.09)、(112.00±12.52)个显著减少(P＜0.05).结论 人胰腺癌细胞高表达Jagged1,沉默Jagged1基因可明显抑制人胰腺癌细胞VEGF的产生和分泌,并且可降低癌细胞的体外迁移能力.     

5-氟尿嘧啶对肝癌细胞系BEL-7402中肿瘤干细胞的富集作用

目的 探讨5-氟尿嘧啶(5-FU)对肝癌细胞系BEL-7402细胞的作用,并对免于5-FU杀伤的存活细胞进行干细胞表面标志物的检测和“肝癌干细胞”的细胞生物学鉴定。方法 检测5-FU作用前后BEL-7402细胞增殖能力、细胞周期和细胞表面标志物CD56、CD54、上皮细胞黏附分子(EpCAM)和CD133表达率的变化;通过集落形成实验检测CD56、CD54、EpCAM、CD133阳性细胞和阴性细胞的克隆形成能力并对其进行比较。两组间均数比较采用t检验,两组数据间构成比比较采用x 2检验。 结果 5-FU对BEL-7402细胞的增殖抑制作用呈时间和剂量依赖性。10 μ g/ml5-FU作用48 h后,Go/G1期细胞比例由对照组的57.50％±0.98％升高至实验组的68.70％±3.41％(P＜0.05); S期细胞比例由对照组的40.26％±4.12％下降至实验组的31.80％±4.15％（P＜ 0.01）;实验组G2/M期细胞消失,对照组该期细胞比例为5.80％±1.87％（P＜0.01）。细胞周期分布变化明显,差异具有统计学意义。5-FU处理使BEL-7402细胞中CD56、CD54、EpCAM和CD133阳性细胞比例分别由0.57％±0.12％,8.10％±6.79％,0.3％±0.01％,3.20％±0.99％升高至4.13％±0.06％,50.08％±1.69％,0.55％±0.07％,10.51％±1.13％,差异具有统计学意义（P＜ 0.05）。软琼脂集落形成实验中,CD56、CD54、EpCAM、CD133阴性细胞与阳性细胞的成集落比例分别为2.11％±0.21％,3.32％±0.31％; 0.86％±0.101％,2.40±0.52％;7.19％±0.56％,7.73±0.71％; 2.70％±0.26％,5.75％±0.81％。各组阳性细胞集落形成率与阴性细胞比较,均有明显增加,差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论 一定剂量的5-FU能够富集肝癌细胞系BEL-7402中的肿瘤干细胞;同EpCAM和CD133一样,CD56和CD54单阳性细胞比其各自单阴性细胞具有更强的克隆形成能力,这提示CD56和CD54可能成为肝癌干细胞的分子标志物。     

小干扰RNA特异性沉默CD44基因对羧甲基壳聚糖保护大鼠软骨细胞凋亡的影响

目的 探讨小干扰RNA(siRNA)沉默大鼠软骨细胞的CD44基因后对细胞CD44基因表达的抑制作用及对软骨细胞在羧甲基壳聚糖(CMCS)作用下细胞生物学特性变化及其作用机制.方法 构建针对CD44基因特异性的siRNA(siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3),LipofectamineTM 2000转染软骨细胞.通过免疫荧光鉴定CD44基因特异性siRNA(CD44-siRNA)的转染情况,通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及蛋白印迹法检测CD44-siRNA转染细胞中CD44基因及蛋白的表达情况;通过硝普钠诱导软骨细胞凋亡并通过流式细胞技术检测CMCS对硝普钠诱导正常及经CD44-siRNA转染软骨细胞凋亡的影响.采用单因素方差分析及SNK-q检验对结果进行统计学分析.结果 免疫荧光检测发现CD44-siRNA成功转染进入软骨细胞,转染率在60％左右.RT-PCR检测结果表明,转染siRNA-1后的24、48及72 h,与空白对照组(0.429±0.053,0.501±0.037,0.341±0.009)相比,CD44的mRNA表达明显减弱(分别为0.198±0.007,0.211±0.016,0.153±0.005;q=5.93,7.01,11.23; P＜0.01).蛋白印迹法检测表明转染siRNA-1后24 h,与空白对照组相比,CD44的蛋白表达明显减弱(0.231±0.064与0.675±0.113,q=13.09,P＜0.01).流式细胞检测结果表明3 mmol/L硝普钠可以成功诱导软骨细胞发生早期凋亡[(70±6)％];50、100、200μg/ml CMCS对硝普钠诱导的凋亡有一定的抑制作用[凋亡率分别为(51±7)％,(30±4)％,(15±4)％;q=5.08,6.97,9.73;P＜0.01];但CMCS对硝普钠诱导的CD44-siRNA-1转染的软骨细胞的凋亡抑制作用比未转染组明显减弱[凋亡率分别为(34±6)％和(15±4)％,q=6.95,P＜0.01 ].结论 CD44特异性siRNA-1转染体外培养的大鼠软骨细胞能显著下调CD44基因的表达;CD44基因在CMCS保护硝普钠诱导软骨细胞凋亡中发挥重要的作用.     

CpG ODN对胰腺癌细胞PANC1吉西他滨化疗敏感性的影响

目的 观察用Toll样受体9（TLR9）激动剂CpG ODN2216处理后胰腺癌PANC1细胞对吉西他滨化疗敏感性的影响.方法 采用免疫荧光化学法及蛋白质印迹法检测胰腺癌PANC1细胞TLR9蛋白的表达,应用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测CpG ODN2216处理后PANC1细胞对不同浓度吉西他滨敏感性的变化.结果 胰腺癌PANC1细胞高表达TLR9蛋白.CpG ODN2216±吉西他滨组的PANC1细胞对吉西他滨的半数抑制剂量（IC50）为（0.28 ±0.13） mg/L,吉西他滨组PANC1细胞的IC5o为（1.23±0.14） mg/L,两组差异有统计学意义（P＜0.01）.0.01、0.1、1、10 mg/L吉西他滨干预经CpGODN2216处理的PANC1细胞的生长抑制率分别为（34.1±1.3）％、（43.5±2.7）％、（76.3±2.5）％、（95.3±2.2）％;干预未经CpG ODN2216处理的PANC1细胞的生长抑制率分别为（14.5±0.9）％、（23.5±1.1）％、（44.8±1.4）％、（63.6±1.8）％,两组差异均有统计学意义（P值均＜0.01）.结论 TLR9激动剂CpG ODN2216能增加人胰腺癌细胞PANC1对吉西他滨的敏感性.     

无血清悬浮法培养结肠癌HT29细胞系及肿瘤干细胞样亚群筛选

目的:研究无血清培养基悬浮培养人结肠癌细胞系HT29,筛选并鉴定HT29结肠癌细胞系中肿瘤干细胞相关亚群。方法:通过无血清培养基筛选结肠癌细胞系肿瘤干细胞相关亚群。应用克隆形成实验、表面标志检测、双苯酰亚胺(Hoechst)33342染色检测来确定培养细胞中肿瘤干细胞比例及其培养后的肿瘤干细胞含量变化。结果:结肠癌细胞系HT29中约50%的肿瘤细胞在无血清培养基中能够存活、增殖,形成自由飘浮的细胞球。细胞球可连续传代,若重新接种于含血清培养基中可重新贴壁分化,分化后细胞与培养储存的HT29细胞形态无明显差异。流式细胞仪检测表面标志,HT29细胞系中CD44+细胞含量为(44.18±2.18)%,而细胞球中CD44+细胞含量为(83.41±11.21)%;双苯酰亚胺33342染色检测提示HT29中侧群(sidepopulation,SP)细胞含量为(3.82±0.08)%,而细胞球中含量明显增高。结论:结肠癌细胞系HT29可在含生长因子的无血清培养基中悬浮生长,并维持细胞系。该细胞系中含有一定比例的具有增殖和自我更新能力的结肠癌干细胞样细胞亚群。表面标志以及双苯酰亚胺33342检测差异提示细胞球中仅部分细胞具有干细胞的功能。     

沙利度胺对人胰腺癌细胞株SW1990体外增殖及凋亡的影响

目的 观察沙利度胺(THD)体外抑制人胰腺癌细胞株SW1990增殖及诱导其凋亡的作用.方法 应用不同浓度的THD(3.125、6.25、12.5、25、50、100、200、400μg/ml)处理胰腺癌SW1990细胞24、48、72 h,用MTT法测定细胞的生长抑制率,流式细胞仪分析细胞周期,Annexin V/PI检测细胞凋亡率,蛋白质印迹法检测细胞Bcl-2、Bax蛋白的表达.结果 THD呈浓度和时间依赖性抑制胰腺癌细胞SW1990的生长.200μg/ml的THD干预使SW1990细胞G0/G1期比例从(41.15±2.23)％上升到(58.83 ±2.33)％;细胞凋亡率从2.6％增加到28.0％;细胞Bax蛋白表达量从0.17±0.03上调到0.33±0.04,Bcl-2蛋白表达量从0.35±0.02下调到0.17±0.01,Bcl-2/Bax比值从2.17±0.44下降到0.52±0.07.结论 THD可以抑制SW1990细胞增殖,其机制可能与上调Bax蛋白表达、下调Bcl-2蛋白表达,促进细胞凋亡,将细胞周期阻滞于G0/G1期有关.