MiRNA-132上调脑源性神经营养因子表达抑制β-淀粉样蛋白诱导的神经元损伤研究

研究背景脑源性神经营养因子(BDNF)在阿尔茨海默病(AD)发病机制中发挥重要作用,微小RNA-132(mi RNA-132)在神经元呈高表达,可以通过调控靶基因表达参与BDNF介导的神经发育过程。本研究旨在探讨阿尔茨海默病神经元模型中mi RNA-132与BDNF的调控关系和神经保护作用。方法体外培养海马神经元72 h后慢病毒转染mi RNA-132,并于体外培养第7天以β-淀粉样蛋白(Aβ)处理制备阿尔茨海默病神经元模型;实时荧光定量聚合酶链反应观察对照组与AD组mi RNA-132表达差异以及不同处理组BDNF m RNA表达变化,噻唑蓝法观察不同处理方式对细胞活性的影响。结果 (1)AD组海马神经元mi RNA-132(t=13.888,P=0.000)和BDNF m RNA(t=-12.274,P=0.000)表达水平均低于对照组。(2)原代培养的海马神经元经慢病毒转染后倒置相差荧光显微镜可见绿色荧光蛋白,对照组(t=16.135,P=0.000)和AD组(t=8.656,P=0.000)转染过表达mi RNA-132后均能上调BDNFm RNA表达。(3)AD组海马神经元活性降低(t=-6.023,P=0.000),AD组转染mi RNA-132后神经元活性增强(t=3.385,P=0.007),予以外源性BDNF共培养后神经元活性明显改善(t=3.672,P=0.004)。结论阿尔茨海默病神经元模型mi RNA-132和BDNF表达水平均下降,mi RNA-132可上调BDNF表达,提示mi RNA-132和BDNF对阿尔茨海默病神经元模型具有神经保护作用,有望为阿尔茨海默病诊断与治疗提供新的视角。     

胶质瘤中miR-134的表达及意义

目的 探讨miR-134在人脑胶质瘤组织和胶质瘤细胞系U87、U251中的表达及意义.方法 采用实时荧光定量PCR检测11例正常脑组织、42例不同级别脑胶质瘤组织、人脑胶质瘤细胞系U87和U251中miR-134的表达情况.结果 与正常脑组织相比,miR-134在不同级别胶质瘤中的表达均明显下降(均P＜0.05).WHOⅢ～Ⅳ级胶质瘤组织中miR-134表达明显低于WHO Ⅰ～Ⅱ级(P＜0.05).与正常脑组织相比,miR-134在胶质瘤细胞系U87、U251中的表达亦显著降低(均P＜0.05).结论 miR-134在胶质瘤中呈低表达,提示其可能参与胶质瘤的发生、发展.     

不同底物对Sombati癫(癎)细胞模型整合素α2表达的影响

目的:探讨不同底物对经体外培养的Sombati癫(癎)细胞模型海马神经元整合素α2表达水平的影响及意义.方法:以层黏连蛋白和多聚L-赖氨酸作为底物于体外培养新生小鼠海马神经元,至第7天时行神经元纯度鉴定;无镁细胞外液继续培养3h后制备Sombati癫(癎)细胞模型,逆转录-聚合酶链反应检测小同处理组海马神经元整合素α2...     

不同底物对Sombati癫癎细胞模型整合素α2表达的影响

目的探讨不同底物对经体外培养的Sombati癫癎细胞模型海马神经元整合素α2表达水平的影响及意义。方法以层黏连蛋白和多聚L-赖氨酸作为底物于体外培养新生小鼠海马神经元,至第7天时行神经元纯度鉴定;无镁细胞外液继续培养3h后制备Sombati癫癎细胞模型,逆转录-聚合酶链反应检测不同处理组海马神经元整合素α2mRNA相对表达变化。结果模型制备前,经体外培养至第5天的层黏连蛋白组神经元胞体增大、饱满,突起连接紧密,神经网络形成,多聚L-赖氨酸组则体外培养至第7天时方出现上述表现;模型制备后24h,不同处理组神经元均可见迁移现象和神经网络“网格”样改变,但不同处理组神经元形态无明显差异。以整合素α2与β肌动蛋白光密度值之比值代表整合素α2mRNA相对表达量,多聚L．赖氨酸组、层黏连蛋白组和多聚L-赖氨酸＋层黏连蛋白组分别为0．25±0．03、0．37±0．05和0．48±0．09,后两组整合素α2mRNA表达水平高于多聚L-赖氨酸组,且差异有统计学意义（P=0．005,0．000）。结论与多聚L-赖氨酸组相比,层黏连蛋白对经体外培养的原代神经元贴壁及轴突连接具有较强的促进作用。添加外源性层黏连蛋白可诱导Sombati癫癎细胞模型海马神经元整合素α-mRNA表达上调。     

miRNA-22在脂肪基质细胞体外脂向分化过程中的表达

背景：脂肪基质细胞在特定条件下可以向脂肪细胞分化, 然而,脂肪基质细胞脂向分化的分子机制仍不明确！ 目的：明确miRNA在脂肪基质细胞脂向分化过程中是否发挥作用及其可能机制。 设计、时间及地点：观察对照试验,于2007-10/2008-03在四川大学口腔疾病研究国家重点实验室完成。 材料：出生30 d健康雄性SD幼鼠8只,取出脂肪,采用密度梯度离心结合贴壁培养法获得了纯度高的脂肪基质细胞。 方法:采用脂向诱导液对第3代的脂肪基质细胞进行诱导培养。建立脂肪基质细胞体外脂向分化细胞模型,采用miRNA芯片技术筛选脂肪基质细胞向脂肪细胞方向分化的相关miRNA,使用实时定量聚合酶链反应技术对芯片结果进行验证。 主要观察指标：①细胞形态学。②PPARγ免疫细胞化学染色和油红O染色。③miRNA芯片结果。④实时定量聚合酶链反应结果。 结果: ①经显微镜下观察、油红O染色及PPARγ免疫细胞化学染色检测证实脂肪基质细胞已经脂向分化。②miRNA芯片发现诱导组中miRNA-22的表达量呈下降趋势。③实时定量聚合酶链反应结果证实miRNA-22的表达量与对照组相比显著减少(P < 0.05)。 结论: miRNA-22在脂肪基质细胞脂向分化后的表达有显著降低,提示miRNA-22可能参与脂肪基质细胞的脂肪分化调控过程,生物信息学分析提示,该过程可能通过对其靶基因MAPK7(ERK5)的调控而实现。     

阿魏酸钠对培养的皮质神经细胞内游离Ca2+的影响

目的 :研究阿魏酸钠对谷氨酸诱导培养的皮质神经细胞损伤的作用。方法 :采用新生大鼠皮质神经细胞原代培养建立谷氨酸神经细胞损伤模型 ,用Ca2 +指示剂Fura 2 /AM检测神经细胞内游离钙浓度 ( [Ca2 +] i)的变化 ,并观察反映神经细胞受损程度的培养液中乳酸脱氢酶 (LDH)的释放量的变化。结果 :阿魏酸钠 40～ 10 0 μmol·L-1能剂量依赖性抑制谷氨酸钠所引起的 [Ca2 +] i 升高及LDH释放。结论 :阿魏酸钠通过抑制谷氨酸钠所引起的 [Ca2 +] i 升高可能是其抗氧化性神经损伤作用的重要机制     

miR-29c对脑胶质瘤U251细胞生物学活性的影响

目的 探讨miR-29c对脑胶质瘤U251细胞生物学活性的影响及可能机制.方法 体外培养胶质瘤U251细胞,实验组将miR-29c mimics转染至细胞,miR mimcs转染作为对照组.应用实时荧光定量PCR检测转染后miR-29c表达量的改变,MTT实验测定细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡情况,体外侵袭实验分析miR-29c转染后细胞的体外侵袭能力,Western blot检测转染后转录因子YY1蛋白的表达.结果 荧光定量PCR结果显示:实验组miR-29c表达量为(106.65±15.51),较对照组显著上调(P＜0.01).与对照组比较,实验组U251细胞的增殖能力明显降低(P＜0.01),凋亡率增加(P＜0.05),体外侵袭能力明显减弱(P＜0.01),YY1蛋白表达下调(P＜0.01).结论 miR-29c可能通过调控YY1蛋白的表达抑制胶质瘤细胞的生物活性.     

神经元癫癇模型miRNA-212对BDNF/TrkB信号转导通路影响的研究

目的探讨海马神经元癫癇模型转染微小RNA（mi RNA）-212对脑源性神经营养因子（BDNF）/酪氨酸蛋白激酶B（Trk B）信号转导通路的影响。方法经体外培养7 d的大鼠海马神经元（正常对照组）,通过无镁离子细胞外液处理（3 h）方法建立癫癇神经元模型（癫癇模型组）,继而以含镁离子正常细胞外液与慢病毒稀释液转染构建mi RNA-212慢病毒表达载体;免疫荧光双染法、膜片钳技术和免疫印迹法观察转染mi RNA-212对BDNF/Trk B信号转导通路的影响。结果无论是正常海马神经元或癫癇神经元模型,与BDNF共培养后其磷酸化Trk B（p Trk B）/Trk B比值均显著升高（P=0.001）,表明BDNF/Trk B信号转导通路被激活;转染mi RNA-212后,癫癇神经元模型p Trk B/Trk B比值降低并低于未转染者（P=0.001）,提示BDNF/Trk B信号转导通路受到抑制。结论 BDNF具有激活海马神经元BDNF/Trk B信号转导通路作用,而转染mi RNA-212可抑制BDNF/Trk B信号转导通路。     

TNF-α和IFN-γ影响许旺细胞生长及髓鞘相关糖蛋白mRNA表达水平的研究

目的 研究肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和干扰素-γ(IFN-γ)对体外培养的许旺细胞(SCs)生长和髓鞘相关糖蛋白(MAG)mRNA 表达水平的影响.方法 建立许旺细胞与神经细胞(NCs)联合培养模型,绘制许旺细胞生长曲线,采用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测TNF-α和INF-γ对MAGmRNA 表达水平的影响.结果 许旺细胞培养液中加入TNF-α和IFN-γ后,许旺细胞增殖数目明显增加且高于单纯许旺细胞培养组(q = 7.476,P = 0.000;q = 6.631,P = 0.000);而TNF-α组与IFN-γ组之间差异无统计学意义(q = 0.846,P = 0.411).无神经细胞存在时,许旺细胞不表达MAG mRNA;经神经细胞诱导后,许旺细胞MAG mRNA 表达阳性,且具有时间性;加入TNF-α和IFN-γ后,许旺细胞MAG mRNA 表达水平明显升高,且高于单纯许旺细胞与神经细胞共培养组(q = 8.128,P = 0.000;q = 6.614,P = 0.000),而加入TNF-α和IFN-γ的许旺细胞与神经细胞共培养组之间差异无统计学意义(q = 1.515,P = 0.156).结论 TNF-α和IFN-γ具有促进许旺细胞增殖作用,且可提高髓鞘特异性基因MAG mRNA 表达水平.提示,这两种炎性干扰因子可通过影响许旺细胞及MAG mRNA 表达水平而间接影响髓鞘修复,为研究炎性脱髓鞘性神经疾病慢性期髓鞘修复障碍的发病机制提供了新的思路.     

胚胎大鼠神经干细胞培养及分化鉴定的实验研究

目的建立胚胎大鼠神经干细胞体外培养及分化鉴定的方法。方法分离不问孕龄(13- 18d)SD胎鼠脑室下区、中脑及海马等部位组织,在含有表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子及N-2 添加剂的DMEM培养基中悬浮培养,形成神经球体后撤除生长因子,经消化传代于含胎牛血清培养基中贴壁生长。应用免疫荧光方法检测原代细胞特异性标记巢蛋白、神经元标记微管蛋白-β、胶质细胞标记胶质纤维酸性蛋白,以及少突胶质细胞标记半乳糖脑苷的表达。结果胎鼠脑组织不同部位均可分离出神经干细胞,体外培养可以向神经元和神经胶质细胞分化,孕龄13d与18d胎鼠产生神经干细胞球体的能力不同,前者优于后者。结论 (1)胚胎大鼠脑内不同部位来源的组织生成神经干细胞球体数量和质量基本相同,但是不同胎龄的鼠脑组织产生神经干细胞球体的能力有所差异。(2)神经干细胞具有向神经元和神经胶质细胞分化的潜能。     

靶向人NHE-1 RNAi腺病毒表达载体的构建及细胞内酸化模型的建立

目的构建靶向人钠氢交换蛋白-1（NHE-1）RNA干扰（RNAi）腺病毒表达载体,感染SH-SY5Y细胞,建立细胞内酸化模型,为进一步研究细胞内pH值变化与散发性阿尔茨海默病间的关系奠定基础。方法利用基因重组技术构建4个含NHE-1前体微小RNA（miRNA）的重组干扰质粒pcDNA^TM6.2-GW/miR和阴性对照质粒pcDNA6^TM6.2-GW/neg-miR,实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测NHE-1 mRNA表达变化,筛选最佳干扰靶序列;BP和LR重组系统获得腺病毒干扰质粒pAd-miR-NHE-1,经包装、纯化后检测腺病毒滴度;感染复数（MOI）值梯度试验确定靶向人NHE-1 RNAi腺病毒感染SH-SY5Y细胞最佳MOI值,以最佳条件感染SH-SY5Y细胞,荧光探针法检测不同处理组细胞内pH值。结果聚合酶链反应（PCR）提示最佳靶向人NHE-1 RNAi病毒表达载体构建成功,且能有效抑制NHE-1 mRNA表达;靶向人NHE-1 RNAi腺病毒感染SH-SY5Y细胞最佳MOI值为160。当最佳MOI值为160时,NHE-1 miRNA腺病毒感染24、48和72 h后SH-SY5Y细胞内pH值分别为5.97±0.03、5.98±0.02和5.98±0.02;空载体对照组为6.05±0.04、6.04±0.07和6.03±0.05;空白对照组为6.03±0.06、6.05±0.04和6.03±0.04。不同测量时间点,SH-SY5Y细胞内pH值均显著低于空载体对照组和空白对照组,差异具有统计学意义（24 h:p=0.002,0.015;48 h:p=0.030,0.012;72 h:p=0.018,0.010）;但感染RNAi腺病毒后不同测量时间点（24、48和72 h）SH-SY5Y细胞内pH值差异无统计学意义（p=0.762）。结论最佳靶向人NHE-1 RNAi腺病毒表达载体及细胞内酸化模型的成功建立,可为探索细胞内酸碱平衡与β-淀粉样蛋白产生之间的关系提供一种有效工具。     

Neural cells from dogfish embryos express the same subtype-specific antigens as mammalian neural cells in vivo and in vitro

Neural cells are classically identified in vivo and in vitro by a combination of morphological and immunocytochemical criteria. Here, we demonstrate that antibodies used to identify mammalian oligodendrocytes, neurons, and astrocytes recognize these cell types in the developing spiny dogfish central nervous system and in cultures prepared from this tissue. Oligodendrocyte-lineage-specific antibodies O1, O4, and R-mAb labeled cells in the 9 cm dogfish brain stem's medial longitudinal fascicle (MLF) and in areas lateral to it. Process-bearing cells, cultured from the dogfish brain stem, were also labeled with these antibodies. An anti-lamprey neurofilament antibody (LCM), which recognized 60 and 150 kDa proteins in dogfish brain stem homogenates, labeled axons and neurons in the brain stem and axons in the cerebellum of the dogfish embryo. It also labeled cell bodies and/or processes of some cultured cerebellar cells. An anti-bovine glial fibrillary acidic protein antibody, which recognized 42–44 kDa protein(s) in dogfish brain stem homogenates, labeled astrocyte-like processes in the brain stem and cerebellum of the dogfish embryo and numerous large and small flat cells in the cerebellar cultures. These results demonstrate that dogfish oligodendrocytes, neurons, and astrocytes express antigens that are conserved in mammalian neural cells. The ability to culture and identify neural cell types from cartilaginous fish sets the stage for studies to determine if proliferation, migration, and differentiation of these cell types are regulated in a similar fashion to mammalian cells. © 1995 Wiley-Liss, Inc.     

Expression of complement messenger RNAs by human endothelial cells

This study evaluated complement mRNA expression in human brain microvessel endothelial cells (HBMEC), human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), and cells of the human derived ECV304 line. Cerebral endothelial cells and HUVEC expressed detectable levels of complement gene mRNAs for the C1q B-chain, C1r, C1s, C2, C3, C4, C5, C7, C8 gamma-subunit and C9. In addition to C6 mRNA, C1q and C9 were not detected in ECV304 cells. These results indicate that endothelial cells may be a source of complement proteins in brain and other organs of the body.     

A comparision of brain biopsy and CSF-PCR in the diagnosis of CNS lesions in AIDS patients

Twenty patients with AIDS who had intracranial lesions underwent both brain biopsy and cerebro-spinal fluid (CSF) examination to compare histological diagnosis with the polymerase chain reaction (CSF-PCR) for the identification of infectious agents. CSF-PCR was performed for herpes simplex virus, varicella zoster virus, cytomegalovirus (CMV), JC virus (JCV), Epstein-Barr virus (EBV), Toxoplasma gondii and Mycobacterium tuberculosis. A definitive diagnosis was obtained by brain biopsy in 14 patients (2 with astrocytoma, 12 with brain infection). CSF-PCR was positive for EBV DNA in 3 of 3 cases of primary cerebral lymphoma, positive for JCV DNA in 6 of 7 biopsy-proven (and one autopsy-proven) cases of progressive multifocal leukoencephalopathy (PML). CSF-PCR was positive for CMV DNA in one biopsy-proven and one autopsy-proven case of CMV encephalitis (the former also had PML) and positive for M. tuberculosis DNA in one case of tuberculous encephalitis. None of the five toxoplasmic encephalitis cases (one definite, four presumptive) were T. gondii DNA positive. There was close correlation between histology and CSF-PCR for CMV encephalitis, PML and PCL. Antitoxoplasma therapy affected the sensitivity of both histological and CSF-PCR methods. Received: 8 November 1995 Received in revised form: 9 July 1996 Accepted: 19 July 1996     

靶向人NHE-1RNAi腺病毒表达载体的构建及细胞内酸化模型的建立

目的构建靶向人钠氢交换蛋白-1（NHE-1）RNA干扰（RNAi）腺病毒表达载体,感染SH．SY5Y细胞,建立细胞内酸化模型,为进-步研究细胞内pH值变化与散发性阿尔茨海默病间的关系奠定基础。方法利用基因重组技术构建4个含NHE-1前体微小RNA（miRNA）的重组干扰质粒pcDNATM6．2．GW／miR和阴性对照质粒pcDNATM6．2．GW／neg-miR,实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测NHE-1mRNA表达变化,筛选最佳干扰靶序列;BP和LR重组系统获得腺病毒干扰质粒pAd-miR—NHE-1,经包装、纯化后检测腺病毒滴度;感染复数（MOI）值梯度试验确定靶向人NHE-1RNAi腺病毒感染SH—SY5Y细胞最佳MOI值,以最佳条件感染SH．SY5Y细胞,荧光探针法检测不同处理组细胞内DH值。结果聚合酶链反应（PCR）提示最佳靶向人NHE-1RNAi病毒表达载体构建成功,且能有效抑制NHE-1mRNA表达;靶向人NHE．1RNAi腺病毒感染SH．SY5Y细胞最佳MOI值为160。当最佳MOI值为160时,NHE-1miRNA腺病毒感染24、48和72h后SH—SY5Y细胞内pH值分别为5．97±0．03、5．98±0．02和5．98±0．02;空载体对照组为6．05±0．04、6．0d±0．07和6．03±0．05;空白对照组为6．03±0．06、6．05±0．0d和6．034-0．04。不同测量时间点,SH—SY5Y细胞内DH值均显著低于空载体对照组和空白对照组,差异具有统计学意义（24h：P=0．002,0．015;48h：P=0．030,0．012;72h：P=0．018,0．010）;但感染RNAi腺病毒后不同测量时间点（24、48和72h）SH—SY5Y细胞内DH值差异无统计学意义（P=0．762）。结论最佳靶向人NHE-1RNAi腺病毒表达载体及细胞内酸化模型的成功建立,可为探索细胞内酸碱平衡与β-淀粉样蛋白产生之间的关系提供-种有效工具。     

趋化因子CXC配体16与中国汉族动脉粥样硬化性卒中的相关性研究

目的 了解趋化因子CXC配体16（CXC ligand 16,CXCL16）181A >V多态性等位基因及基因型在中国汉族人群的分布,探讨其基因及血清水平与动脉粥样硬化性卒中的相关性。方法 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（Polymerase chain reaction-restrictive fragmentlength polymorphism,PCR-RFLP）方法,检测244例动脉粥样硬化性卒中患者（卒中组）和204例对照者（对照组）CXCL16 181A >V位点的基因型分布特点,同时比较该多态性位点在中国对照组人群、德国人群与瑞典人群间的分布差异。同时,应用ELISA方法检测卒中组与对照组的血清CXCL16水平,并进行统计学分析。结果 卒中组高血压病史、糖尿病病史、吸烟史、饮酒史、总胆固醇（total cholesterol,TC）、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C）、血清CXCL16水平高于对照组（P均<0.01）,高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C）低于对照组（P <0.01）。CXCL16181A >V等位基因（P <0.01）及基因型分布（P =0.004）在中国组、德国组和瑞典组差异有统计学意义,而卒中组与对照组间差异无统计学意义（P =0.774,0.692）。结论 血清CXCL16水平升高与动脉粥样硬化性卒中的发生相关;CXCL16 181A >V位点基因多态性存在种族差异性,与中国汉族人群动脉粥样硬化性卒中可能无关。