布鲁氏菌多重荧光定量PCR方法的建立与应用北大核心CSCD

目的探讨应用多重荧光定量PCR方法检测待检者血液、血清以及环境样本中布鲁氏菌的价值。方法根据149名待测者的就诊情况进行分类,其中疑似组75人、治疗组74人。对收集的环境和待检者的样本应用多重荧光定量PCR方法检测,结果进行统计分析。将3对引物、探针的目的基因克隆到PUC57载体上制作阳性标准品,进行灵敏度检测和标准曲线的绘制。结果通过对149名待检者的样本进行荧光定量PCR检测,单重、双重和三重方法的阳性率分别为79.2%、34.2%和27.5%。单重与双重,单重与三重荧光定量方法的阳性率差异均有统计学意义,χ^(2)值分别为55.42和73.42,P<0.05。布鲁氏菌属的单重荧光定量PCR结果生成的标准曲线为y=-3.7732x+43.188,R^(2)=0.9953,线性关系良好,最低检测范围为101 copies/μL。经过多重荧光定量方法检测的环境样本结果全部为阳性。结论单重荧光定量PCR方法灵敏度较好,建议与血清学方法联合使用对高危人群进行定期筛查,三重荧光定量方法可以在一次实验中既能完成属水平的鉴定又能区分牛种和羊种布鲁氏菌,对于环境样品具有良好的扩增效果,2种方法对于布鲁氏菌病的预防控制具有重要作用。     

基于微滴数字PCR技术建立HBV共价闭合环状DNA的检测方法

目的建立一种用于检测HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)的微滴数字PCR(ddPCR)方法。方法构建HBV cccDNA标准品,利用HBV cccDNA和松弛环状DNA(rcDNA)在结构上存在的差异,设计HBV cccDNA引物和探针,通过扩增HBV质粒得到HBV cccDNA标准品,把梯度稀释后的标准品作为HBV cccDNA检测的模板,建立ddPCR检测方法,并分析此方法的检出限和重复性;收集2017年6月—2020年10月在首都医科大学附属北京佑安医院就诊的20例临床患者的肝组织样本,均诊断为HBV感染,提取样本的DNA,利用质粒安全性ATP依赖的DNA酶(PSAD)进行酶切,得到HBV cccDNA模板,对ddPCR检测方法进行临床样本的评价,并与实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法作对比。计数资料两组间比较采用χ~2检验。结果建立了基于ddPCR的HBV cccDNA检测方法,梯度稀释的HBV cccDNA标准品均能准确检出,检出限为1拷贝/μl,其中1×10~3、1×10~2、1×10~1拷贝/μl标准品的变异系数分别为4.41%、3.98%、5.09%;检测20例临床HBV患者样本的HBV cccDNA,ddPCR检测方法能检出17例,阳性率为85%,qPCR检测方法能检出11例,阳性率为55%,两组比较差异有统计学意义(χ~2=4.286,P=0.038)。结论建立的ddPCR检测HBV cccDNA方法具有较低的检出限和较好的重复性,为进一步的临床检测提供了有效的工具。     

液滴式数字PCR与实时荧光定量PCR检测利什曼原虫的方法比较

目的 建立内脏利什曼病液滴式数字PCR检测方法,将其与同时建立的实时荧光定量PCR检测方法进行方法学比较,探究其在内脏利什曼病诊断方面的价值。方法 以杜氏利什曼原虫小环动基体DNA(kinetoplast DNA,kDNA)为分子靶标,根据其约200 bp的保守片段设计引物和探针,建立内脏利什曼病液滴式数字PCR检测方法,比较其与实时荧光定量PCR检测方法的检测限、精密度以及在不同利什曼原虫虫株中的检测效果。结果 液滴式数字PCR检测下限与实时荧光定量PCR检测下限相同,约为1.0×10 copies/μL;随待测样本浓度的降低(1.0×10⁴ copies/μL～1.0×10 copies/μL),液滴式数字PCR检测方法变异系数呈增大趋势(12.07%～62.96%),重复性越差;实时荧光定量PCR变异系数较小(2.96%～4.26%),且不同浓度之间的变异系数差别不大。2种方法在不同利什曼原虫中的检测灵敏度不同。结论 和实时荧光定量PCR相比,液滴式数字PCR在利什曼原虫检测中的灵敏度和重复性没有表现出显著的优势,后续还需更多的研究从分子靶标的选择、灵敏度、...     

基于样品检测的布鲁氏菌荧光定量PCR方法的建立

目的 本文建立一种基于样品检测的特异性好、灵敏性高的布鲁氏菌荧光定量PCR检测方法。方法 以哺乳动物beta-actin基因和外源重组质粒为内参,针对布鲁氏菌属特异性基因IS711,建立用于样品检测的布鲁氏菌荧光定量PCR方法,并验证其敏感性、特异性及稳定性,绘制标准曲线。将该方法用于哺乳动物样品检测,并与细菌分离培养检测结果比较。结果 荧光定量PCR方法对布鲁氏菌检测有良好的特异性,3对引物对阴性对照菌均无非特异性扩增;该方法用于样品检测的最低检测限为17拷贝;内外源内参同时存在条件下,布鲁氏菌荧光定量PCR的标准曲线相关系数为R²=0.997(Y=-3.12X+40.9)。将该方法直接用于181份动物样本的检测,并与分离培养结果相比,荧光定量PCR检测阳性率为11.4%,细菌分离培养检测阳性率为9.9%,且细菌分离培养阳性样品与荧光定量PCR阳性样品中编号基本一致。结论 本文建立的荧光定量PCR检测方法灵敏性高、特异性及稳定性好,可直接应用于样品的检测,检测结果受内参基因质控。     

微滴式数字聚合酶链反应在病原体检测中的研究进展

［摘要］　聚合酶链反应是一种分子生物学技术,用于使某些脱氧核糖核酸（DNA）片段扩增,它是一种常见且不可或缺的技术,已应用于许多领域,特别是在临床实验室中。第三代聚合酶链反应,微滴式数字聚合酶链反应（ddPCR）,是常规聚合酶链反应方法的生物技术改进,可用于直接定量和克隆扩增DNA。ddPCR现在广泛用于低丰度核酸检测,可用于感染性疾病的诊断。该文介绍了ddPCR检测手段的发展及原理,总结了其在病毒性疾病、细菌性疾病和真菌性疾病临床诊断中的潜在优势：ddPCR对低丰度病原体的检测更灵敏、准确、可重复,可能在未来临床应用中是比定量聚合酶链反应更好的选择。     

布鲁氏菌PCR鉴定方法的研究与应用

目的采用PCR、PCR SSCP方法对布鲁氏菌进行快速鉴定,并对其种、型鉴别。方法分析已发表布鲁氏菌属、种、型基因序列,寻找出不 同布鲁氏菌的种、型特异性碱基分布规律,设计特异性引物,用于布鲁氏菌属、种、型的鉴定;根据聚合酶链反应 单链构象多态性（PCR SSCP）分析原理,建立PCR SSCP方法,用于区分牛种A19疫苗株与其他型布鲁氏菌。结果所建立的PCR方法能高效、准确鉴定出布鲁氏菌,并能 对其种、型进行区分;PCR SSCP方法可将A19疫苗株从其他型布鲁氏菌中区分出来。结论利用PCR、PCR SSCP方法能快速、准确地进行布鲁氏 菌属、种、型以及疫苗株A19的鉴别,且简便、可靠,便于临床应用。     

牛种布鲁氏菌A19-△VirB12标记疫苗双重实时荧光定量PCR方-法的建立

目的 建立一种区分牛种布鲁氏菌A19-△VirB12标记疫苗株与布鲁氏菌野毒感染株的双重荧光定量PCR方-法。方法 分别以布鲁氏菌4型分泌系统中VirB8基因、VirB12基因序列设计2对引物及探针,优化实时荧光PCR反应体系及条件。以牛种布鲁氏菌A19-△VirB12标记疫苗株、牛种布鲁氏菌A19疫苗株、羊种布鲁氏菌M5疫苗株以及猪种布鲁氏菌S2疫苗株、大肠杆菌、沙门氏菌基因组DNA进行 Realtime-PCR扩增,评价该方-法特异性。分别构建布鲁氏菌VirB12基因和VirB8基因片段阳性质粒,10倍系列稀释后进行Realtime-PCR扩增,测定该方-法的敏感性。结果 本方-法具有良好的特异性,牛种布鲁氏菌A19疫苗株、羊种布鲁氏菌M5疫苗株以及猪种布鲁氏菌S2疫苗株基因组DNA同时出现VirB8基因与VirB12基因阳性扩增,牛种布鲁氏菌A19-△VirB12标记疫苗株仅出现VirB8基因阳性扩增,大肠杆菌、沙门氏菌均未扩增出目的条带,对VirB8基因及VirB12基因片段阳性质粒的检测限分别为约10² copies/μL和10³ copies/μL。该方-法仅用于鉴别区分牛种布鲁氏菌A19-△VirB12标记疫苗株与布鲁氏菌野毒株。结论 本研究建立的布鲁氏菌双重Realtime-PCR方-法,具有良好的特异性和敏感性,为今后鉴别牛种布鲁氏菌A19-△VirB12分子标记疫苗免疫牛与自然感染牛提供技术支撑。     

多重荧光定量PCR方法鉴定布鲁氏菌属及牛羊种布鲁氏菌研究

摘要：目的 利用多重实时荧光PCR技术,建立快速鉴定布鲁氏菌的方法。方法 根据布鲁氏菌特异性基因Bcsp31,AlkB/IS711和BMEI1162/IS711的部分片段作为靶基因,分别设计探针引物,将扩增产物连接到PUCm18-T载体上,制备标准品及标准曲线,确定此方法的灵敏度。利用布鲁氏菌的其他生物型菌株和同源性较近的致病菌（汉赛巴尔通体、霍乱弧菌、土拉弗朗西斯菌、大肠杆菌O:157、大肠杆菌O:16、小肠结肠耶尔森菌O:9、沙门氏菌N群血清型、嗜麦芽假单胞菌）验证所建立方法的特异性。通过布鲁氏菌标准菌株建立方法,优化体系后扩增97株地方株进行验证。结果 应用多重Taqman荧光PCR技术检测布鲁氏菌结果显示,布鲁氏菌属、牛种布鲁氏菌和羊种布鲁氏菌有各自的荧光信号,而与其同源性较高的致病菌均未见荧光信号;由标准曲线可知该方法的单重和多重荧光PCR最低检测下限均约为102copy/μL（13-24fg /μL）,是常规PCR灵敏度的100倍。结论建立的方法有灵敏度高、快速易操作等优点,可用于布鲁氏菌快速鉴定,并同时确定是否为牛种或羊种布鲁氏菌。     

微滴式数字化PCR方法在McCune-Albright综合征患儿GNAS热点激活突变检测中的应用

目的 应用微滴式数字化(droplet digital)PCR方法检测McCune-Albright综合征(MAS)患儿GNAS已知热点突变,并探讨其在MAS诊断中的应用价值。方法 研究对象为122名就诊于上海交通大学医学院附属瑞金医院儿科的MAS患儿,针对MAS致病基因GNAS的已知突变热点(R201H/C),分别采用ddPCR技术、实时荧光焦磷酸解激活聚合反应技术(PAP)及二代测序方法检测其是否存在基因突变,并结合临床进行关联分析。结果 122例MAS患儿中共89例完善了GNAS基因检测,发现存在突变者共57例。ddPCR、PAP及二代测序阳性率分别为77.42%、29.03%及56.25%。完善检测的经典三联征患者均检测出GNAS基因突变。其中,ddPCR方法在典型及不典型患儿外周血中阳性率分别为100%及73.1%,明显高于其余两种方法。性早熟合并骨病变患者GNAS突变检出率高于性早熟合并皮肤病变者,提示骨纤维结构不良伴性早熟是儿童MAS的临床诊断的重要依据。结论 儿童MAS的内分泌表现以性早熟最为多见。骨纤维结构不良伴性早熟是临床诊断的重要权重因素。ddPCR灵敏度高,可为...     

数字PCR和荧光定量PCR诊断急性期布鲁菌病的灵敏度比较初步研究

目的建立用于布鲁菌检测的数字PCR技术,初步用小样本开展研究,比较数字PCR和荧光定量PCR的灵敏度差异,验证数字PCR作为急性期布鲁菌病诊断技术的可行性。方法选取符合我国急性期布鲁菌病诊断标准的20例患者的血清标本,分别用数字PCR和荧光定量PCR技术进行检测,初步比较2者在急性期布鲁菌病诊断中的灵敏度差异,并分析差异原因。结果20例急性期布鲁菌病患者血清样本中,数字PCR检测阳性20例,荧光定量PCR检测阳性0例。结论初步证实在急性期布鲁菌病患者血清标本检测中,数字PCR检测灵敏度高于荧光定量PCR,有良好的临床应用前景,但也存在一定局限性,尚须进一步扩大样本完成实验诊断技术临床研究,并进行多实验室验证。     

牛羊猪种布鲁氏菌快速鉴别PCR方法的建立及评价

目的 建立一种可在一个反应体系中同时鉴别布鲁氏菌及牛羊猪种布鲁氏菌的快速PCR鉴别方法。方法 将布鲁氏菌及牛羊猪种布鲁氏菌的扩增引物进行优化组合,建立全新的BAMS-PCR方法;随后对该方法的特异性和灵敏度进行评价,并对现场分离的219株布鲁氏菌进行鉴别,评价其在布鲁氏菌鉴别中的应用价值。最后,用该方法对临床标本中布鲁氏菌的DNA进行扩增,评价其在临床诊断中的实用性。结果 BAMS-PCR方法可在同一反应中同时鉴别布鲁氏菌及牛种(1,2,4型),羊种(1,2和3型)和猪种(1型)布鲁氏菌,并有较好的特异性和敏感性。布鲁氏菌属,牛种,猪种和羊种布鲁氏菌引物的检测灵敏度分别为10 pg/μL,100 pg/μL, 10 pg/μL和100 pg/μL。BAMS-PCR对219株临床分离菌株的鉴定结果和常规生物分型方法的鉴定符合率为100%。经BAMS-PCR检测,97份临床血清样本仅6份为阳性,全血和组织(羊脾)样本全部为阴性。结论 BAMS-PCR是一种简便、快速、高效、准确的布鲁氏菌鉴别方法,可作为临床分离菌株的首选鉴别方法。     

五种布鲁氏菌核酸检测试剂盒检测性能的评价北大核心CSCD

目的比较5种布鲁氏菌核酸实时荧光PCR检测试剂盒的一致性和检出能力,为临床实验室选择检测方法和布鲁氏菌的诊断提供参考依据。方法选用经病原学检测确定为布鲁氏菌阳性的血液样本38份,健康人的血液样本24份,潘氏变形杆菌、溶藻弧菌、河弧菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌DNA各1份,使用5种试剂盒(编号A-E)分别进行核酸检测,比较5种试剂盒临床样本检测的一致性;选择1份阳性样本核酸用无RNA酶水梯度稀释得到5个浓度(浓度1:4453.13 fg/μL,浓度2:1113.28 fg/μL,浓度3:278.32 fg/μL,浓度4:69.58 fg/μL,浓度5:17.40 fg/μL),每个浓度使用5种试剂盒(编号A-E)分别进行3次检测,比较5种试剂盒的阳性检出率及批内重复性。结果5种试剂盒检测67份DNA样品的符合率稍有不同,试剂盒ABDE的符合率均为100%,试剂盒C的符合率为98.51%。批内重复性显示5种试剂盒在浓度1、浓度2、浓度3水平重复检测DNA的Ct值变异系数均<5%;在浓度1与浓度4梯度区间,试剂盒的阳性检出能力比较显示试剂盒A、B、D较高,为11/12,试剂盒C和E较低,为8/12。结论5种试剂盒的真实性和可靠性较好,灵敏度和符合率稍有差别,特异度均为100%;重复性较好,检测性能良好。部分试剂盒对弱阳性样本的检出能力不强,该类样本可使用多种试剂盒复核,以保障结果的准确性。     

PCR技术鉴定布氏菌

目的用PCR技术检测鉴定羊种布氏菌和牛种布氏菌1、2、4型。方法根据文献发表的3对引物(简称B、M、A),用PCR技术对细菌DNA进行扩增,在属和种的水平上鉴定布氏菌。结果用B引物进行PCR扩增可以在属的水平上鉴别布氏菌,M引物可以鉴别羊种布氏菌,A引物可以鉴别牛种布氏菌1、2、4型和沙林鼠种。B、M、A 3对引物PCR鉴别结果与常规方法鉴定结果相符率分别为100%、92.0%和87.5%。结论PCR技术对细菌DNA进行扩增,可以在属和种的水平上鉴别布氏菌。布氏菌牛种9型的PCR扩增产物与布氏菌其他生物型有差异,说明牛种9型布氏菌在基因上不同于其他布氏菌。目前所用的表型分型技术存在着与本试验所用基因分型方法的不一致性。