融合蛋白ScFv（3G11）-mms13在大肠杆菌中的表达及鉴定

目的：构建抗Ⅳ型胶原酶单链抗体基因ScFv与磁小体膜蛋白基因mms13融合基因的原核表达载体pET30a（＋）-ScFv-mms13,在大肠杆菌中诱导表达并对融合蛋白进行初步鉴定。方法 PCR扩增融合基因ScFv-mms13,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后克隆入原核表达载pET30a（＋）质粒,构建重组表达质粒。将重组质粒导入大肠杆菌DH5ɑ中,利用PCR、酶切筛选鉴定重组菌株。用异丙基疏代半乳糖苷（ IPTG）诱导表达融合蛋白,通过改变IPTG浓度、诱导时间优化表达条件。表达产物经SDS-PAGE电泳和Western blot法进行鉴定。结果重组质粒经PCR、酶切、测序证实重组质粒pET30a（＋）-ScFv-mms13构建成功。 SDS-PAGE电泳结果分析表明诱导菌株在43kDa左右处有明显异源蛋白表达,且确定了在IPTG终浓度为0．2mmol/L、诱导时间为6h时为表达稳定。对表达蛋白进行定位分析确定表达蛋白主要以包涵体形式存在,部分存在于可溶细胞质中。 Western blot结果实证该表达产物可与His-tag抗体发生特异性结合,提示为目的融合蛋白。结论成功构建pET30a（＋）-ScFv-mms13表达载体并表达获得目的融合蛋白。     

SOD基因克隆及真核表达载体构建

[目的]克隆超氧化物歧化酶(SOD)基因，构建逆转录病毒(pLNCX)-SOD真核表达载体转染复合体，为基因转染及基因治疗进行准备。[方法] RT-PCR法扩增SOD基因，DLNCX载体进行限制性酶切、去磷酸化，电泳后回收切开的pLNCX及SOD片段，经连接反应后构建pLNCX-SOD真核表达载体。[结果] 大鼠心肌细胞提取的总RNA电泳结果，28s和18s两种核糖体RNA的位置和亮度说明提取的RNA是完整的。SOD cDNA测序结果表明，克隆的SOD cDNA序列与大鼠SOD序列一致。质粒的所有克隆均具有同样大小，与计算结果一致，为7．0kb。限制性酶切电泳结果显示，pLNCX-SOD经HindⅢ酶切后，得到了约500bp的SOD片段，说明质粒的构建是正确的。[结论] 克隆了大鼠SOD基因，构建了pLNCX-Cu／Zn SOD真核表达载体复合体。     

GDNF基因克隆及表达载体的构建

目的 克隆大鼠胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)全长基因，构建真核细胞表达质粒。方法 从孕17d大鼠胚胎脑组织中提取RNA，参照分子克隆指南，合成cDNA第1、2链，加入引物PCR扩增目的基因，与pcDNA3质粒连接，构建表达质粒。结果 提取的总RNA经纯化后电泳出现18s和28s两条带，PCR扩增的目的基因为630bp大小的条带，测序结果为633bp。结论 正确地克隆了大鼠GDNF基因全序列，为进一步获得重组活性的GDNF蛋白和神经系统疾病的基础和临床研究奠定了基础。     

神经营养素3基因克隆及其真核表达载体的构建

目的 克隆大鼠神经营养素-3(NT-3)基因的表达序列,构建大鼠NT-3基因真核表达载体.方法 应用RT-PCR从大鼠脑组织总RNA中扩增NT-3基因cDNA,将其克隆到真核表达载体pcDNA3中构建重组质粒pcDNA3-N3,用限制酶酶切鉴定和DNA序列分析鉴定重组质粒.结果 RT-PCR产物为822 bp的特异片段,重组质粒酶切后产生822 bp和5.2 kb片段,DNA测序证实822 bp片段的碱基序列与大鼠NT-3 cDNA序列完全一致.结论 成功克隆大鼠NT-3基因表达序列并构建了NT-3基因真核表达载体pcDNA3-N3.     

狂犬病毒3aG株糖蛋白基因克隆及真核表达载体的构建

目的 构建含狂犬病毒３ａＧ株糖蛋白的重组质粒ｐＣＩ－ｎｅｏｒａｂＧ，为十冢ＤＮＡ免疫做准备。广阔地从感染了狂犬病毒３ａＧ株的鼠脑组织中提取总ＲＮＡ进行ＲＴ－ＰＣＲ，扩增出编码糖蛋白的基因片段，亚克隆入ｐＣＩ－ｎｅｏ真表达载体。结果 从３ａＧ株基因组中产出特异的糖蛋白基因片段，砍隆成功ｐＵＣ１９ｒａｂＧ；经亚克隆，筛选鉴定获得了ｐＣＩＩ－ｎｅｏｒａｂＧ重组质料。结论 构建成功狂犬病毒ｐＣＩ－ｎｅｏｒ     

汉坦病毒G1和G2糖蛋白的基因克隆及糖蛋白杆状病毒表达载体的构建

目的：克隆汉坦病毒G1和G2糖蛋白基因,构建基于杆状病毒表面展示系统（BSDS）的G1和G2糖蛋白杆状病毒表达质粒.方法：用PCR方法扩增汉坦病毒西安分离毒株84FLi株G1和G2糖蛋白基因的编码区,将其克隆入T载体,构建糖蛋白基因的T-A克隆.然后将糖蛋白编码区从T-A克隆中切下,插入杆状病毒表达转移载体pBACsurf-1的gp64信号肽和gp64成熟蛋白之间.结果：获得四个分别含有汉坦病毒G1和G2糖蛋白编码区的T-A克隆,并构建成功G1和G2糖蛋白的杆状病毒表达质粒.结论：构建成功基于BSDS的G1和G2糖蛋白杆状病毒表达质粒,为进一步用BSDS表达汉坦病毒糖蛋白奠定了基础.     

融合蛋白IP10-EGFRvⅢScFv的构建及表达

目的构建细胞因子融合蛋白IP10-EGFRvⅢScFv,建立并检测稳定表达融合蛋白的细胞株NIH3T3。方法通过RT-PCR法扩增小鼠IP10基因,全基因人工合成EGFRvⅢScFv,两段目的基因依次克隆于表达载体pcDNA3.1(-)PCMV启动子下游,二者以编码(Gly4Ser)3的柔性接头序列(linker)相连。将构建好的pcDNA3.1(-)IP10-EGFRvⅢScFv转染NIH3T3细胞,并用G418筛选出阳性克隆,采用实时定量PCR和Western blot法检测克隆细胞目的基因和蛋白的表达量,并观察转染后的NIH3T3细胞体外生长状况。结果成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(-)IP10-EGFRvⅢScFv,经过浓度为200mg/L的G418工作液筛选出了稳定高表达IP10-EGFRvⅢScFv的细胞系NIH3T3,且其生长状态并未受转染基因的影响。通过荧光检测、实时定量PCR、Western blot法检测到转染72h后目的基因和蛋白表达量最高,和稳定克隆株相比,表达量并无明显差异(P>0.05)。结论构建的新型细胞因子融合蛋白可以在NIH3T3细胞内获得稳定表达,为后期融合蛋白的提取及功能研究打下基础。     

融合毒素TOP_3表达载体的构建

目的构建融合毒素TOP3的原核表达载体,为研究该融合毒素的功能及分析评价临床应用前景奠定基础。方法构建原核表达载体pET-28a（＋）-TAT-ODD-CASPASE3[pET-28a（＋）-TOP3],并在大肠杆菌BL21（DE3）pLysS内诱导表达。结果经酶切分析及DNA序列分析,所构建的质粒均插入TAT-ODD-CASPASE3融合基因。结论成功构建原核表达载体pET-28a（＋）-TOP3,并在IPTG诱导下获得特异性表达。     

HBeAg融合表达载体的构建及表达

目的构建HBeAg融合表达载体,并探讨其在HepG2细胞的表达。方法采用PCR的方法从质粒PHBV1.5中扩增乙型肝炎病毒前C／C基因,克隆到pEC3FP-C1的多克隆位点区EcoRⅠ和BamHⅠ位点,构建HBeAg融合表达载体,通过酶切、PCR及测序鉴定,并把质粒转染HepG2细胞,用荧光显微镜、RT-PCR、免疫组化、ELISA检测融合蛋白的表达。结果通过酶切、PCR及测序鉴定,成功构建了HBeAg融合表达载体,并且该载体可以在HepG2细胞胞浆中表达融合蛋白。结论成功构建了乙肝病毒HBeAg融合表达载体,为以后用RNAi进行HBeAg的抑制研究奠定基础。     

猪APOBEC3F基因克隆及真核表达载体的构建与鉴定

目的 克隆猪载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3F(apolipoprotein B mRNA editing enzyme,catalytic polypeptide 3F,APOBEC3F)基因,构建真核表达载体实现其在体外表达与鉴定。方法分离4头21周龄,体质量25～30kg的雌性健康五指山猪的外周血单个核...     

TAT-EGFP融合蛋白表达载体的构建及表达

目的:构建TAT-EGFP原核表达载体,在E.coli BL21中高效表达并纯化.方法:人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段,插入载体pET28a后得到pET28a-TAT重组质粒,再连接绿色荧光蛋白(EGFP)基因,组成pET28a-TAT-EGFP重组表达子.转化大肠杆菌,IPTG诱导TAT-EGFP融合蛋白表达.表达产物用十二烷基硫钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,组氨酸亲和层析柱纯化融合蛋白.结果及结论:成功地构建了TAT-EGFP融合蛋白的原核表达载体,在诱导后获得了高效表达并纯化,为进一步研究TAT的蛋白转导作用奠定了基础.     

hOP-1全长基因克隆及真核表达载体的构建

目的证实人牙乳头细胞中OP-1的表达,获得hOP-1全长基因及其高效真核表达载体.方法提取人牙乳头细胞总RNA,反转录合成cDNA,以特异性引物扩增hOP-1全长基因并克隆入T载体,筛选阳性克隆进行序列测定后.构建高效真核表达载体pCI/OP-1并筛选鉴定.结果 PCR扩增得到一特异性的约1 300 bp的片段,序列测定结果表明与国外已发表的序列完全一致.构建的pCI/OP-1质粒,用于基因转染纯度较好.结论人牙乳头细胞中首次克隆到hOP-1全长基因,并构建获得该基因高效真核表达载体.     

转录因子Sp1基因克隆及表达载体的构建

目的 通过转录因子Sp1基因克隆以及真核表达载体的构建,为探讨转录因子Sp1在牙釉质发育的分子调控奠定基础.方法 根据引物设计原则设计Sp1基因的PCR引物,以从小鼠成釉细胞中提取的总RNA逆转录所得cDNA为模板,进行PCR扩增,用PCR法扩增得出含有EcoRⅠ和XbaⅠ的Sp1目的 基因连接到pcDNA3.1/myc-HisA真核表达载体上.结果 经过PCR引物扩增得到2343bp基因片段,将获得的重组质粒pcDNA3.1/myc-HisA-Sp1双酶切分析鉴定,测序结果与GenBank登录基因完全一致.结论 成功实现了Sp1基因克隆及表达载体的构建,为以后研究转录因子Sp1在牙釉质发育的分子调控方面奠定基础.     

改良型TAT-VP3融合基因原核表达载体的构建及表达

目的 构建改良型TAT-VP3融合基因原核表达载体,并表达目的 蛋白.方法 采用PCR法设计和扩增改良型TAT-VP3融合基因,克隆至表达载体pThioHisA中,构建非融合表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)plyS,经IPTG诱导表达,15%SDS-PAGE鉴定.结果 成功构建了改良型TAT-VP3融合基因的原核表达载体,经酶切、测序鉴定,证明构建正确.经SDS-PAGE鉴定可见相对分子质量16400的特异性目的 条带,37℃诱导8h的蛋白表达量最高,且多数以包涵体形式存在.结论 已成功构建改良型TAT-VP3融合基因原核表达载体,并表达目的 蛋白,为进一步的蛋白制备和应用研究奠定了基础.     

人α1胸腺素基因克隆及表达载体的构建

目的：为人α1胸腺素基因的蛋白质表达奠定基础。方法：用Trizol法提取人α1胸腺素RNA反转录成CD17NA,以已知胸腺素基因为模板,在编码区上游和下游分别设计合成一对含有EcoRI和BamHI酶切位点的寡聚核甘引物扩增Tα1克隆到PUC19载体中,双酶切后回收连接到表达大肠杆菌DH25中表达。以碱裂解法提取重组质粒双脱氧链法序列测定。结果：成功构建了Tα1克隆重组体PUC19-Tα1,经序列分析证实对码序列无误。结论：Tα1在DH25中表达成功。     

人类TSLC1基因克隆及真核表达载体的构建

目的:克隆人类TSLC1基因并构建其真核表达载体pcDNA3.1( )/TSLC1.方法:从正常皮肤组织中提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增TSLC1基因全长cDNA,克隆入pMD18-T载体并转化大肠杆菌JM109,经PCR、酶切鉴定均为阳性的克隆,进行核苷酸测序分析,再将TSLC1基因定向克隆入pcDNA3.1( )载体中构建表达载体.结果:RT-PCR扩增后的产物在约1413 bp处出现明显的特异性条带,TSLC1基因的cDNA片段被成功插入真核表达载体pcDNA3.1( )质粒的多克隆位点,经鉴定与GenBank收录的TSLC1 cDNA 序列一致.结论:TSLC1基因的cDNA片段被成功克隆,为以后的研究奠定了基础.     

人lamda3干扰素(hIFN-λ3)基因克隆及表达

目的构建表达hIFN-λ3基因的真核表达载体，并在COS-7细胞中表达具有抗病毒活性的rhIFN-λ3蛋白。方法用口腔滤泡炎病毒VSV刺激A549人肺腺癌细胞，抽提总RNA，经RT-PCR获得全长cDNA，与pcDNA3．1／myc—his(-)A真核表达载体连接，构建重组体pcDNA3．1A-hIFN-λ3，并在COS-7细胞中进行表达，采用微量细胞病变抑制试验研究表达产物的抗病毒活性。结果经PCR和限制性酶切鉴定以及DNA测序确证重组入载体中的基因片段不仅方向正确，而且确为hIFN-λ3，与GeneBank报告序列完全一致，并成功地在COY-7细胞中瞬时表达了具有抗病毒活性的rhIFN-λ3蛋白。结论该研究成功地克隆出hhIFN-λ3基因编码序列，并在COS-7细胞中获得瞬时表达，证明了rhIFN-λ3蛋白具有抗病毒活性，为今后干扰素的基因治疗奠定了基础。     

融合蛋白TOP_3原核表达载体的构建、表达及纯化研究

目的:利用HIV病毒TAT蛋白转导结构域、人缺氧诱导因子1α氧依赖降解结构域以及CASPASE3构建融合蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达及纯化。方法:分别构建原核表达质粒pET-28a(+)-TAT、pET-28a(+)-TAT-ODD、pET-28a(+)-TAT-ODD-CASPASE3(pET-28a(+)-TOP3);在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS内,利用镍-亚硝胺乙酸-组氨酸(Ni-NTA-His)亲和层析法对重组蛋白TOP3进行纯化。结果:成功构建了pET-28a(+)-TOP3的原核表达载体,经过优化表达和纯化条件,融合蛋白在IPTG诱导下获得特异性表达,纯化得到了高纯度的目的蛋白。结论:融合蛋白TOP3的成功表达及纯化,为该融合蛋白应用于肿瘤的治疗研究奠定了理论基础。     

GST-CTCF融合蛋白原核表达载体的构建及表达

目的构建人CCCTC结合因子(CCCTC-binding factor,CTCF)与谷胱甘肽转移酶(glutathione S-transferase,GST)重组蛋白的原核表达载体,并进行诱导表达。方法以pEASY-T1-SIMPLE-CTCF为模板,设计引入限制性酶切位点的CTCF引物,PCR方法扩增目的片段,产物经限制性内切酶酶切后与原核表达载体pGEX-4T-1连接,构建成pGEX-4T-1-CTCF原核表达载体,转化至大肠埃希菌BL21中,经异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)进行诱导,Western blot检测GST-CTCF融合蛋白的表达情况。结果经菌液PCR、质粒双酶切分析、基因测序分析证实重组表达质粒pGEX-4T-1-CTCF构建成功,GST-CTCF融合蛋白产物经Western blot鉴定为特异性表达。结论成功构建了pGEX-4T-1-CTCF原核表达质粒,获得特异性的GST-CTCF融合蛋白,为进一步研究转录因子CTCF的功能奠定了基础。更多还原     

人环指蛋白11真核表达载体的构建及表达

目的构建含有标签蛋白的人环指蛋白11(ring finger protein 11,RNF11)的真核表达载体,并观测其在293T细胞中的表达。方法使用MEGA5.0等生物学软件构建人RNF11的分子进化树;应用RT-PCR从4种人胃癌细胞系中检测到该基因的表达,并将其克隆到pEASY-Blunt载体中,酶切测序鉴定正确后,再将其连接到真核表达载体pCMV-HA中,酶切鉴定正确后转染293T细胞,Western-blotting测其表达。结果重组的携带有RNF11的真核表达载体酶切鉴定后显示载体及片段的大小正确,将该真核表达载体转染293T细胞后使用Western-blotting检测到了融合蛋白的表达。结论携带有标签蛋白的人RNF11基因的真核表达载体pCMV-HA-RNF11克隆及表达成功,为进一步研究其与其它蛋白质的相互作用奠定了基础。