转染Noggin基因的骨髓基质干细胞体外分化为神经元样细胞的研究

目的 构建Noggin基因的表达载体,分离骨髓基质干细胞(BMSCs),探讨转染Noggin基因的BMSCs在体外分化为神经元样细胞的情况.方法 应用RT-PCR技术扩增Noggin基因,利用基因工程技术构建载体pCS2+[Tα1]-Noggin,分离、培养大鼠BMSCs,借助脂质体将Noggin基因转入BMSCs.观察诱导后细胞形态变化,利用免疫细胞化学方法 鉴定分化细胞是否表达神经细胞特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白-2(MAP-2)以及胶质纤维酸性蛋白(GFAP).利用RT-PCR方法 检测神经细胞标记物mRNA的表达.结果 成功构建Noggin基因的真核表达载体并分离培养BMSCs.转染Noggin基因表达载体后, 分化的BMSCs形态似神经细胞;免疫化学检测到NSE、MAP-2特异性标志物表达,未检测到GFAP表达;RT-PCR测得神经细胞标记物GAP43、NCAM、SYN1表达.结论 从形态、蛋白、基因水平证实转染Noggin基因的BMSCs在体外可以分化为具有部分功能的神经细胞.     

人Noggin基因神经细胞特异性表达载体的构建

目的构建具有神经细胞表达特异性的人Noggin基因的真核表达载体，进一步研究Noggin基因在神经系统发育成熟、功能机制方面的作用。方法根据人Noggin基因的cDNA序列，设计合成一对5’端分别含有HindⅢ和XbaⅠ酶切位点的特异性引物，运用RT-PCR方法克隆人Noggin基因的cDNA序列；回收PCR产物，并将其与pMD18 simple T载体连接，进行HindⅢ和XbaⅠ双酶切鉴定和DNA测序鉴定；真核表达载体pCS2 [Tal]-GFP带有神经细胞特异性启动子(alpha1-微管蛋白启动子)，用HindⅢ和XbaⅠ双酶切后琼脂糖凝胶电泳回收带有特异性启动子的片断和T载体上人Noggin基因，在T4DNA连接酶作用下将二者连接，并筛选鉴定。结果RT-PCR产物含有人Noggin基因，DNA测序结果显示重组的pMD18-Noggin载体中含有正确的人Noggin基因序列，重组的pCS2 [Ted]-Noggin载体中含有人Noggin基因的cDNA序列以及alpha1-微管蛋白启动子。结论成功构建了人Noggin基因的神经细胞特异性真核表达载体pCS2 [Ted]-Noggin。     

多效生长因子在骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化中的表达变化

目的探讨多效生长因子(PTN)在体外诱导成人骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经元样细胞分化中过程不同时间的表达变化,了解多效生长因子是否参与BMSCs向神经元样细胞分化的机制。方法以密度梯度离心加贴壁培养法分离成人BMSCs,进行原代和传代培养,以流式细胞仪鉴定纯度。对照组和实验组对传代第6代的BMSCs进行诱导分化,诱导后30min至3d,观察细胞形态并计数。将分化后细胞采用免疫细胞化学法测定神经细胞特异性表面标志神经元特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白-2(MAP-2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达。对诱导前和诱导后3h、6h、12h、24h、3d细胞以RT-PCR法测定PTN mRNA表达。结果 BMSCs在接种1d后黏附贴壁,呈椭圆形或圆形,3d~5d后呈梭状细胞成簇生长,7d~12d融合。传代至第5代~6代可见较为均一的成纤维细胞样形态。流式细胞仪检测结果显示:细胞表达CD44、CD105,不表达造血干细胞的特异标记CD45,证实其纯度。诱导后细胞胞体开始向细胞胞核收缩,出现双极或多极细胞。12h变形细胞增多,细长突起相互连接。24h后细胞变化不明显。诱导后细胞经免疫化学染色显示:多数表达NSE(64.79±0.06)%、MAP-2(60.05±0.09)%,而未检测到GFAP。实验组诱导后细胞不同时间点PTN mRNA的表达不同(P0.01)。诱导后12h~24hPTN mRNA表达最高。结论建立成人BMSCs培养增殖体系基础上诱导BMSCs向神经元样细胞分化,诱导过程细胞有外观形态变化,同时表达神经细胞特异性标志物NSE和MAP-2。诱导后BMSCs与形态改变相似,向神经元样细胞分化的不同时间点,有PTN mRNA表达变化,提示PTN可能参与BMSCs向神经元样细胞的分化。     

成人骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞的研究

目的 研究成人骨髓间充质干细胞(hMSC)体外定向诱导可否分化为神经元样细胞。方法 Percoll分离液离心分离hMSC，体外扩增，采用两种方法：①含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)预诱导24小时，甲氧酚(BHA)和二甲亚枫(DMSO)联合诱导6小时；②2-巯基乙醇(2-ME)预诱导24小时，BHA和DMSO诱导6小时。免疫组化检测神经元样细胞表达神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。结果 hMSC在体外扩增传至5代后，流式细胞仪显示hMSC表面抗原CD29、CD44、CD90表达阳性率分别为99．5％，97．8％，98．8％。采用两种方法诱导hMSC后，胞体收缩，突起伸出，较密的部分神经元拉成网状；免疫组化显示诱导的神经元样细胞能特异性表达NSE、NF，不表达GFAP。结论 成人骨髓hMSC在体外可以分化为神经元样细胞。     

大鼠脑组织匀浆对其BMSCs向神经元样细胞分化的影响

目的:探讨大鼠脑组织匀浆上清对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经元样细胞分化的影响.方法:全骨髓培养法从wistar大鼠中分离培养BMSCs,流式细胞仪鉴定,预诱导24h后,分为4组.空白对照组(A组)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)20ng/mL组(B组)、bFGF20ng/mL+正常脑匀浆上清100μg/mL组(C组)、bFGF 20ng/mL+损伤脑匀浆上清100μL/mL组(D组),诱导48h至细胞分化.免疫细胞化学染色分别检测各组诱导分化后神经特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白-2(MAP-2)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.结果:第4代BMSCs CD29、CD44和CD34的表达率为99.8%、99.7%和2.2%,诱导后的细胞均具有神经细胞形态特征.免疫组化染色结果:NSE在诱导各组(B组、C组、D组)的表达率为44.50%,63.10%和73.30%,MAP-2的表达率为45.70%、65.30%和75.60%,各组均不表达GFAP.结论:大鼠脑组织匀浆上清能提高BMSCs向神经细胞方向分化的阳性率,损伤脑匀浆的作用更强.     

葡萄籽原花青素对骨髓间充质干细胞诱导分化后神经元样细胞凋亡的影响

目的探讨葡萄籽原花青素(grape seed proanthocyanidins,GSP)对骨髓间充质干细胞(BMSCs)诱导分化后神经元样细胞是否具有抗凋亡作用及作用的最适剂量。方法BMSCs由成年健康雄性WISTAR大鼠股骨全骨髓法取得,经贴壁培养法分离纯化,取第五代BMSCs用低中高剂量(20mg/L、40mg/L、80mg/L)GSP干预24h,设立空白对照组。以含有20%胎牛血清的1mmol/L B-巯基乙醇(BME)预诱导24h后,继而用含有40ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的无血清培养基作为诱导液诱导24h。采用免疫细胞化学法鉴定神经细胞特异性抗原标记神经元特异性烯醇化酶(neuronspecificenolase,NSE)和微管相关蛋白-2(microtubule-associated protein2,MAP-2)的表达。MTT法检测不同剂量的GSP干预24h后对神经元样细胞活力的影响,流式细胞仪检测以Fluo-3AM为荧光探针标记的细胞内游离钙浓度,以Annexin V凋亡试剂盒检测组间细胞凋亡率。结果成功分离培养WISTAR大鼠BMSCs,经诱导分化后大部BMSCs变成神经元样细胞并表达NSE和MAP-2。GSP干预组细胞生长状态,活力及存活细胞比例较好。结论GSP能使BMSCs诱导分化后神经元样细胞保持较好的活力,对抗自由基产生,减少细胞凋亡。     

不同时间诱导后上清液在骨髓间充质细胞向神经元样细胞分化中的作用

目的 研究体外使用音猬因子(SHH)、维甲酸(Ra)、Forskolin(Fn)组成的诱导体系诱导骨髓间充质细胞(BMSCs)后的上清液对BMSCs向神经细胞分化的作用.方法 从健康志愿者髂骨处抽取骨髓4 mL,体外分离、培养、扩增后用400 ng/L SHH、0.5 μm Ra 和5 μm Fn 组成的诱导体系进行诱导,取诱导后6 h、12 h、24 h、3 d、5 d和7 d的诱导液上清分别作用于BMSCs.7 d后使用倒置显微镜和免疫组织化学方法观察诱导前后细胞的变化.结果 诱导7 d后各组均有部分细胞胞体收缩、伸长突起,表现出神经细胞的形态.12 h上清诱导组同SHH+Ra+Fn 诱导组NSE、MAP-2阳性细胞比例高于其他组(P<0.05),12 h上清诱导组同SHH+Ra+Fn诱导组NSE、MAP-2阳性细胞比例无统计学意义(P>0.05).结论 12 h后上清液可有效诱导BMSCs向神经细胞分化.     

细胞接触诱导骨髓间充质干细胞获得窦房结细胞表型的初步研究

目的 通过建立体外骨髓间充质干细胞(BMSCs)与纯化培养的乳鼠窦房结细胞共培养体系,探讨窦房结微环境对BMSCs分化的诱导作用.方法 自新生乳鼠的心脏分离窦房结细胞,并差速贴壁纯化培养,免疫荧光检测超极化激活环核苷酸门控阳离子通道基因4(HCN4)和缝隙连接蛋白45(Cx45)的表达.自成年大鼠的骨髓分离BMSCs,传2代后,用脂质体介导pEGFP-N1转染标记BMSCs,再与纯化培养的窦房结细胞以1:5比例进行直接接触共培养,并用窦房结细胞条件培养液对转染后的BMSCs进行培养作为对照.1周后应用免疫荧光检测BMSCs的HCN4和Cx45表达.结果 接触共培养组中,可见部分表达绿色荧光蛋白的BMSCs同时表达HCN4和Cx45,而条件液培养组中未见HCN4和Cx45的表达.结论 直接接触共培养体系可诱导BMSCs初步分化为窦房结样细胞.     

脐血单个核细胞体外向神经干细胞的诱导及Foxg1基因的表达

目的探讨人脐血单个核细胞（UBC-MNCs）体外向神经干细胞（NSCs）的诱导分化机制及NSCs中Foxg1基因表达的意义。方法从脐血中分离出UBC—MNCs,用含hEGF、bFGF和B27因子的Neurobasa1培养基联合诱导其向NSCs方向分化,观察NSCs形态学及增殖分化特点;免疫组化法检测培养细胞中神经细胞标志抗原Nestin、NSE、GFAP的表达情况,BrdU标记靶细胞;RT-PCR法检测分离后、培养3、6、9、12d细胞中Foxg1基因的表达。结果UBC—MNCs可定向诱导分化为神经元样细胞,表达Nestin、NSE、GFAP标记抗原。Foxg1 mRNA在诱导前细胞中低表达,诱导后逐渐升高（P〈0．05）,6d达高峰,之后逐渐下降（P〈0．05）。结论体外定向诱导培养可获得UBC-MNCs源性NSCs,Foxg1基因是NSCs增殖分化关键调控因子,脐血可成为NSCs的新来源。     

三七总皂苷对人骨髓间充质干细胞诱导分化后神经元样细胞生长状态的影响

目的 研究三七总皂苷(tPNS)与bFGF联合在人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)分化为神经元样细胞过程中的诱导作用及作用剂量.方法 全骨髓贴壁法分离、培养、扩增、纯化hBMSCs,流式细胞仪检测hBMSCs表面CD29、CD44、CD105、CD34分子,测定周期.取第三代hBMSCs,含20%胎牛血清的1 mmol/Lβ-巯基乙醇(BME)预诱导24 h,继而用bFGF(20 ng/mL)标准组、tPNS(1 mg/mL)药物组、20 ng/mL bFGF+低、中、高剂量tPNS(0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL)诱导液诱导,设立空白对照组.采用免疫细胞化学法鉴定神经细胞特异性抗原标记神经元特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋-2(MAP-2)和神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.MTT法检测各组诱导后不同时间点对神经元样细胞活力的影响.结果 成功分离培养hBMSCs,经诱导后大部分hBMSCs分化为神经元样细胞,联合诱导组细胞生长状态及活力较好,阳性细胞NSE、MAP-2比例高于对照组(P<0.05),GFAP表达阴性.结论 tPNS与bFGF联合在体外能有效诱导hBMSCs分化为神经元样细胞,表达神经细胞特异性抗原,保持较好的活力、延长存活时间.     

Glucose-responsive insulin-producing cells from stem cells

Recent success with immunosuppression following islet cell transplantation offers hope that a cell transplantation treatment for type 1 (juvenile) diabetes may be possible if sufficient quantities of safe and effective cells can be produced. For the treatment of type 1 diabetes, the two therapeutically essential functions are the ability to monitor blood glucose levels and the production of corresponding and sufficient levels of mature insulin to maintain glycemic control. Stem cells can replicate themselves and produce cells that take on more specialized functions. If a source of stem cells capable of yielding glucose-responsive insulin-producing (GRIP) cells can be identified, then transplantation-based treatment for type 1 diabetes may become widely available. Currently, stem cells from embryonic and adult sources are being investigated for their ability to proliferate and differentiate into cells with GRIP function. Human embryonic pluripotent stem cells, commonly referred to as embryonic stem (ES) cells and embryonic germ (EG) cells, have received significant attention owing to their broad capacity to differentiate and ability to proliferate well in culture. Their application to diabetes research is of particular promise, as it has been demonstrated that mouse ES cells are capable of producing cells able to normalize glucose levels of diabetic mice, and human ES cells can differentiate into cells capable of insulin production. Cells with GRIP function have also been derived from stem cells residing in adult organisms, here referred to as endogenous stem cell sources. Independent of source, stem cells capable of producing cells with GRIP function may provide a widely available cell transplantation treatment for type 1 diabetes.     

Insulin expressing cells from differentiated embryonic stem cells are not beta cells

Aim/hypothesis Embryonic stem (ES) cells have been proposed as a potential source of tissue for transplantation for the treatment of Type 1 diabetes. However, studies showing differentiation of beta cells from ES cells are controversial. The aim of this study was to characterise the insulin-expressing cells differentiated in vitro from ES cells and to assess their suitability for the treatment of diabetes.Methods ES cell-derived insulin-expressing cells were characterised by means of immunocytochemistry, RT-PCR and functional analyses. Activation of the Insulin I promoter during ES-cell differentiation was assessed in ES-cell lines transfected with a reporter gene. ES cell-derived cultures were transplanted into STZ-treated SCID-beige mice and blood glucose concentrations of diabetic mice were monitored for 3 weeks.Results Insulin-stained cells differentiated from ES cells were devoid of typical beta-cell granules, rarely showed immunoreactivity for C-peptide and were mostly apoptotic. The main producers of proinsulin/insulin in these cultures were neurons and neuronal precursors and a reporter gene under the control of the insulin I promoter was activated in cells with a neuronal phenotype. Insulin was released into the incubation medium but the secretion was not glucose-dependent. When the cultures were transplanted in diabetic mice they formed teratomas and did not reverse the hyperglycaemic state.Conclusions/Interpretation Our studies show that insulin-positive cells in vitro-differentiated from ES cells are not beta cells and suggest that alternative protocols, based on enrichment of ES cell-derived cultures with cells of the endodermal lineage, should be developed to generate true beta cells for the treatment of diabetes.Abbreviations ES Embryonic stem - LIF leukemia inhibitory factor - ITSF insulin-transferrin-selenite-fibronectin.Bleackley and Korbutt laboratories contributed equally to this paper     

DC与CIK或LAK联合对结肠癌细胞株SW480杀伤作用的研究

[目的]研究树突状细胞(DC)联合细胞因子诱导或未诱导的杀伤细胞(CIK)或淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)对结肠癌细胞株SW480的杀伤活性.提供DC联合CIK或LAK治疗结肠癌的实验依据.[方法]取人外周血分离出单个核细胞(PBMNC),诱导生成DC、CIK、LAK细胞;流式细胞仪检测DC经SW480肿瘤抗原冲击后的表型变化;以CIK+DC细胞、CIK细胞、LAK+DC细胞及LAK细胞作为效应细胞,SW480为靶细胞,以15∶1、30∶1、45∶1为效靶比,LDH释放法测定细胞杀伤试验活性;ELISA检测杀伤试验中干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素2(IL-2)、IL-12、IL-17的分泌水平.[结果]流式细胞仪检测DC经SW480肿瘤抗原冲击后,其表面分子HLA-DR、CD40、CD80和CD86表达分别平均为90.23％、73.68％、85.96％、57.55％,与未经肿瘤抗原冲击DC比较,DC成熟的表面标志分子表达明显增加(P＜0.01).相同效靶比下,CIK+DC细胞组对SW480的杀伤作用最强,明显高于其他细胞组(P＜0.01);CIK+ DC细胞组在效靶比为45∶1时,杀伤活性最强(P＜0.01);单独CIK细胞组的杀伤活性明显高于LAK+DC细胞组(P＜0.01);LAK+ DC细胞组的杀伤活性明显高于单独LAK细胞组(P＜0.01).效靶比为45∶1时,各杀伤试验细胞组上清液中IFN-γ、IL-2、IL-12、IL-17的分泌量,CIK+DC细胞组的IFN-γ、IL-12的分泌量显著高于其他细胞组(P＜0.05);LAK+DC、单独LAK细胞组IL-2的分泌量明显高于CIK+DC、单独CIK细胞组(P＜0.05);单独CIK细胞组IFN-γ的分泌量明显高于LAK+DC、单独LAK细胞组(P＜0.05).[结论]CIK+DC细胞组对SW480的杀伤活性明显强于单独CIK、LAK+ DC组、单独LAK细胞组.其机制可能是,SW480抗原致敏的DC分泌IFN-γ、IL-12等刺激、诱导CIK细胞的活化和增殖,明显增强CIK细胞杀伤SW480的活性.     

Dendritic cells: specialized antigen presenting cells

Renewing interest in cancer immunotherapy reflects the excellent results that have been obtained in animal models and the promising results in early clinical trails with dendritic cell (DC) based approaches. The central role that DCs play in the initiation of an immune response raises the possibility of using them to trigger specific anti-tumor immunity. In addition, deeper knowledge of DC biology will allow better understanding of the mechanism(s) underlying allergic and autoimmune diseases as well as tolerance phenomena. These crucial issues were critically reviewed during a workshop organized by the Italian Society for Experimental Hematology in Florence, Italy, on March 18th, 1999. The chairmen have prepared this report for the readers of Haematologica.     

树突状细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞对胃癌细胞杀伤作用

目的探讨树突状细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞对胃癌细胞的杀伤作用。方法采用胃癌患者自身血液中单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC),经体外诱导分别扩增出DC和CIK细胞,二者共同培养后,利用MTT法检测DC细胞联合CIK细胞体外杀伤人胃癌细胞株(MNK-45、MNK-28、SG-7901)的活性。结果DC与CIK细胞共培养后得到的细胞群高表达CD3 CD56 ,平均值达到(56.74±7.63)%。通过彼此相互作用诱导出的细胞群体对胃癌细胞株MNK-45、MNK-28、SG-7901有杀伤作用,且杀伤活性随着效靶比的增加而增强。结论DC与CIK细胞共培养后有很强的增殖能力,对胃癌细胞具有杀伤活性,且其杀伤作用与胃癌细胞类型无相关性。